JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אופטוגנטיקה היא כלי רב עוצמה עם יישומים רחבי היקף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול.

Abstract

מערכות ביטוי גנים לא יסולא בפז הן כלי רב ערך לחקר תהליכים ביולוגיים. מערכות ביטוי אופטוגנטיות יכולות לספק שליטה מדויקת על תזמון ביטוי הגנים, המיקום והמשרעת באמצעות אור כסוכן המעורר. בפרוטוקול זה, מערכת ביטוי אופטוגנטית משמשת להשגת ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה. מערכת זו מסתמכת על גורם שעתוק מהונדס הנקרא TAEL המבוסס על גורם שעתוק המופעל על ידי אור ממקור טבעי מהחיידק E. litoralis. כאשר הוא מואר באור כחול, TAEL דימרייז, נקשר לאלמנט הרגולטורי הקוגניטיבי שלו הנקרא C120, ומפעיל תמלול. פרוטוקול זה משתמש בעוברי דגי זברה מהונדסים המבטאים את גורם התמלול של TAEL תחת שליטתו של מקדם ה- ubb בכל מקום. יחד עם זאת, האלמנט הרגולטורי C120 מניע את הביטוי של גן עיתונאי פלואורסצנטי (GFP). באמצעות לוח LED פשוט כדי לספק הפעלת אור כחול, אינדוקציה של ביטוי GFP ניתן לזהות תחילה לאחר 30 דקות של תאורה ומגיע לשיא של אינדוקציה יותר מפי 130 לאחר 3 שעות של טיפול באור. אינדוקציה של ביטוי יכולה להיות מוערכת על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) ועל ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו היא גישה רב-תכליתית וקלה לשימוש לביטוי גנים אופטוגנטיים.

Introduction

מערכות ביטוי גנים לא ניתנות לתקדים מסייעות לשלוט בכמות, בתזמון ובמיקום של ביטוי גנים. עם זאת, השגת שליטה מרחבית וטמפורלית מדויקת באורגניזמים רב-תאיים הייתה מאתגרת. בקרת זמן מושגת בדרך כלל על ידי הוספתתרכובות מולקולה קטנה 1 או הפעלה של מקדמי הלם חום2. עם זאת, שתי הגישות חשופות לסוגיות של תזמון, כוח אינדוקציה ותגובות לחץ מחוץ למטרה. שליטה מרחבית מושגת בעיקר על ידי שימוש ביזמים ספציפיים לרקמות3, אבל גישה זו דורשת מקדם מתאים או אלמנט רגולטורי, אשר לא תמיד זמינים, וזה לא תורם אינדוקציה ברמת תת רקמות.

בניגוד לגישות קונבנציונליות כאלה, מפעילי שעתוק אופטוגנטיים המופעלים על ידי אור יש פוטנציאל לשליטה מרחבית וטמפורלית עדינה יותר של ביטויגנים 4. מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול פותחה ומותבת לשימוש בעוברי דגי זברה5,6. מערכת זו מבוססת על גורם שעתוק אנדוגני המופעל על ידי אור מהחיידק E. litoralis7,8. מערכת TAEL/C120 מורכבת מפעיל תמלול בשם TAEL המכיל תחום הפעלה Kal-TA4, תחום LOV מגיב אור כחול (חישת מתח אור)ותחוםכריכת DNA של הסליל-תור-סליל (HTH). כאשר מוארים, תחומי LOV עוברים שינוי קונפורמציה המאפשר לשתי מולקולות TAEL לעמעם, להיקשר למקדם C120 מגיב TAEL, וליזום תמלול של גן במורד הזרם של עניין5,8. מערכת TAEL/C120 מציגה אינדוקציה מהירה וחזקה עם רעילות מינימלית, והיא יכולה להיות מופעלת על ידי מספר שיטות אספקת אור שונות. לאחרונה, שיפורים במערכת TAEL / C120 נעשו על ידי הוספת אות לוקליזציה גרעינית ל- TAEL (TAEL-N) ועל ידי צימוד האלמנט הרגולטורי C120 למקדם בסיס cFos (C120F) (איור 1A). שינויים אלה שיפרו את רמות האינדוקציה ביותר מפי 15.

בפרוטוקול זה, לוח LED פשוט משמש להפעלת מערכת TAEL / C120 ולזירוז הביטוי בכל מקום של גן כתב, GFP. אינדוקציה של ביטוי יכולה להיות מנוטרת באופן איכותי על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנטיות או כמותית על ידי מדידת רמות התמליל באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). פרוטוקול זה יציג את מערכת TAEL/ C120 ככלי רב-תכליתי וקל לשימוש המאפשר רגולציה חזקה של ביטוי גנים ב- vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה מרסד.

1. חציית דגי זברה ואוסף עוברים

  1. שמור על קווי דגי זברה מהונדסים נפרדים המכילים את מפעיל התמלול של TAEL או את הגן הכתב הנשלט על ידי C120 כדי למזער הפעלה מזויפת.
  2. לחצות 6-8 דגי זברה בוגרים מכל שורה בשיטות סטנדרטיות9 כדי לייצר עוברים מהונדסים כפולים המכילים הן את רכיבי TAEL והן את רכיבי C120(איור 1B).
    הערה: לחלופין, שני הרכיבים יכולים לבוא לידי ביטוי באופן ארעי באמצעות מיקרו-ינון של mRNA או DNA פלסמיד בשיטות סטנדרטיות10.
  3. לאסוף עוברים במנות פטרי המכילות מי ביצים (60 מיקרוגרם / מ"ל מלח ים מיידי האוקיינוס מומס במים מזוקקים), עם כ 30 עוברים לכל תנאי להיבדק.
  4. מניחים את הכלים בקופסה אטומה לאור או מכסים בנייר אלומיניום כדי למזער הפעלה לא מכוונת באור הסביבה (ראו טבלה 1).

2. אינדוקציה אור גלובלית

  1. השתמש בלוח LED באור כחול (465 ננומטר) כדי לספק הפעלת אור כחול למספר עוברים בו-זמנית.
  2. מקם את לוח ה- LED ביחס לצלחות הפטרי המכילות עוברים כך שכוח האור בפועל המתקבל על ידי העוברים הוא כ - 1.5 מ"ר / ס"מ2 כפי שנמדד על ידי מד כוח אור ואנרגיה (איור 2A).
  3. פעמו את האור במרווחי זמן של שעה אחת בהפעלה/שעה באמצעות ממסר טיימר אם הוא מאיר במשך יותר מ-3 שעות כדי להפחית את הסיכון לצילום להפעלה של תמלול TAEL5,8.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את משך התאורה המדויק עבור יישומים ספציפיים. בפרוטוקול זה, דוגמאות של משך תאורה של 30 דקות, 1 שעות, 3 שעות ו 6 שעות מסופקות.
  4. הסר מכסי צלחת פטרי כדי למזער את פיזור האור מן ה עיבוי.
  5. מניחים מנות פטרי המכילות עוברי בקרה בקופסה חסינת אור או מכסים בנייר אלומיניום לבקרות כהות.

3. הערכה כמותית של אינדוקציה על ידי qRT-PCR

  1. יש להסיר עוברים מההארה לאחר משך ההפעלה הרצוי.
  2. לחלץ RNA כולל מ 30-50 אור מופעל ו 30-50 עוברים כהים באמצעות ערכת בידוד RNA בעקבות הוראות הערכה.
    1. מעבירים עוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומסירים עודפי מי ביצים. מוסיפים חוצץ תמוגה ומותגנים את העוברים עם עלי פלסטיק.
    2. העבר את ה- lysate לעמודה שסופקה על-ידי ערכה והמשיך בהוראות הערכה. מיד להמשיך לשלב 3.3 או לאחסן RNA מטוהר ב -20 °C (50 °F) עד -80 °C (70 °F).
  3. השתמש RNA כולל של 1 מיקרוגרם לסינתזת cDNA באמצעות ערכת סינתזה של cDNA בהתאם להוראות הערכה.
    1. קח צינור PCR 0.2 מ"ל דק, הוסף 1 מיקרוגרם של RNA ל 4 μL של 5x cDNA תגובה מאסטר תערובת (המכיל חיץ ממוטב, אוליגו-dT פריימרים אקראיים, ו- dNTPs), 1 μL של פתרון תמלול הפוך 20x, ומים ללא נוקלאז לנפח כולל של 20 μL.
    2. מניחים את הצינור בתרמוציקלר המתוכנת כדלקמן: 22 °C (70 °F) למשך 10 דקות, 42 °C (55 °F) למשך 30 דקות, 85 °C (5 דקות), ולאחר מכן להחזיק ב 4 °C (70 °F). המשך מיד לשלב 3.4 או לאחסן cDNA ב -20 °C (70 °F).
  4. הכן תגובות qPCR המכילות תערובת מאסטר אנזימים ירוקים SYBR, cDNA מדולל פי 5 (שלב 3.3) ו- 325 ננומטר של כל פריימר עבור GFP.
    הערה: פריימרים המשמשים בפרוטוקול זה באופן הבא. GFP קדימה: 5'-ACGACGGCAACTACACACACC-3'; GFP הפוך: 5'-GTCCTCCTTGAATGTCGATGC-3'; ef1a קדימה 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverse: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
  5. בצע תגובות qPCR במחשב PCR בזמן אמת.
    הערה: תוכנית PCR: הפעלה ראשונית ב 95 °C (55 °F) במשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 30 s ב 95 °C (55 °F), 30 s ב 60 °C (50 °F), ו 1 דקות ב 72 °C (72 °F).
  6. בצע ניתוח עקומת המסה לאחר השלמת ה- PCR כדי לקבוע את הספציפיות לתגובה. בצע שלושה שכפולים טכניים עבור כל דגימה.
  7. חשב אינדוקציה המופעלת על ידי אור כשינוי קיפול ביחס לעוברים שנשמרו בחושך באמצעות שיטת2 -ΔΔCt 11. ניתן לקבוע משמעות סטטיסטית באמצעות חבילת תוכנה לסטטיסטיקה.

4. הערכה איכותית של אינדוקציה על ידי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות

  1. הסר את העוברים מן התאורה לאחר משך ההפעלה הרצוי.
  2. לשתק עוברים להדמיה ב 3% methylcellulose המכיל 0.01% tricaine בשקופיות דיכאון זכוכית.
  3. השג תמונות פלואורסצנטיות וב brightfield בסטריומקרוסקופ פלואורסצנטי המחובר למצלמה דיגיטלית באמצעות הגדרות מסנן GFP סטנדרטיות. השתמש בהגדרות זהות של רכישת תמונות עבור כל הדוגמאות.
  4. מזג תמונות Brightfield ופלואורסצנטיות לאחר הרכישה עם תוכנת עיבוד תמונה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

עבור הדגמה זו, קו כתב GFP מגיב C120(Tg(C120F:GFP)ucm107)נחצה עם קו מהונדס המבטא TAEL-N בכל מקום מן ubiquitin b (ubb) מקדם (Tg (ubb:TAEL-N)ucm113))כדי לייצר עוברים מהונדסים כפולים המכילים את שני האלמנטים. 24 שעות לאחר ההפריה, העוברים נחשפו להפעלת האור הכחול, פעמו בתדר של 1 שעות על /1 שעה כבויה. אינד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת TAEL/C120 האופטוגנטית להשגת ביטוי גנים כחול שאינו ניתן לתפוקה באור. מערכת זו מורכבת מפעיל תמלול, TAEL, כי dimerizes על תאורה עם אור כחול ומפעיל שעתוק של גן עניין במורד הזרם של אלמנט רגולטורי C120. ביטוי מושרה של כתב GFP ניתן לזהות לאחר מעט כמו 30 דקות של חשיפה לאור, דבר המצב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

Acknowledgements

אנו מודים לסטפן מטרנה ולחברים במעבדות וו ומטורנה על הצעות והערות מועילות על פרוטוקול זה. אנו מודים לאנה ריד, קווין גרדנר ולורה מוטה-מינה על דיון ותובנות יקרי ערך בעת פיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH; R03 DK106358) והוועדה לתיאום חקר הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה (CRN-20-636896) ל- S.W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BioRender web-based science illustration toolBioRenderhttps://biorender.com/
Color CCD digital cameraLumenara755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCDThorlabsPM100D
Excitation filter, 545 nmOlympusET545/25x
illustra RNAspin Mini kitGE Healthcare95017-491
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)AmazonB017GWDF7E
MethylcelluloseSigma-AldrichM7140
NEARPOW Programmable digital timer switchAmazonB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mixQuantabio101414-286
Photoshop image procesing softwareAdobe
Prism graphing and statistics softwareGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemApplied BiosystemsA28137
StereomicroscopeOlympusSZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light sourceExcelitas010-00326RDiscontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

References

  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738(2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved