JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בפרוטוקול זה, וקטור AAV2 מיוצר על ידי פולחן שותף Spodoptera frugiperda (Sf9) תאים חרקים עם baculovirus (BV)-AAV2-חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או גן טיפולי ותאי Sf9 נגועים BV-AAV2-rep בתרבית השעיה. חלקיקי AAV משתחררים מהתאים באמצעות חומר ניקוי, מובהר, מטוהר על ידי כרומטוגרפיה של עמודת זיקה, ומרוכזים על ידי סינון זרימה משיק.

Abstract

וירוסים הקשורים אדנו (AAV) הם וקטורים מבטיחים עבור יישומי ריפוי גנטי. כאן, וקטור AAV2 מיוצר על ידי תרבית משותפת של תאי Spodoptera frugiperda (Sf9) עם תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס (BV)-AAV2-GFP (או גן טיפולי) ו- BV-AAV2-rep-cap בתרבית מתלים ללא סרום. תאים מתורבתים בבקבוקון בשייקר מסלולי או ביו-ריאקטור גלים. כדי לשחרר את חלקיקי AAV, תאי היצרן הם lysed במאגר המכיל חומר ניקוי, אשר מובהר לאחר מכן על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה וסינון. חלקיקי AAV מטוהרים מהתא ליסאט באמצעות כרומטוגרפיה של עמודי AVB ספרוז, הקושרת חלקיקי AAV. חלקיקים קשורים נשטפים עם PBS כדי להסיר מזהמים ונבהרים מהשרף באמצעות חיץ נתרן סיטראט ב- pH 3.0. האלואט החומצי מנוטרל עם חיץ Tris-HCl אלקליין (pH 8.0), מדולל עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), ומרוכז עוד יותר עם סינון זרימה משיק (TFF). הפרוטוקול מתאר ייצור וקטורי פרה-קליני בקנה מידה קטן התואם לייצור AAV בקנה מידה גדול עד בקנה מידה קליני עבור יישומי טיפול גנטי אנושי.

Introduction

וירוסים הקשורים לאדנו (AAV) הם פרובווירוסים אנושיים שאינם עוטפים המכילים DNA חד-גדילי של 4.6 kb. לווקטורים AAV יש מספר יתרונות על פני וקטורים ויראליים אחרים עבוריישומי ריפוי גנטי 1,2,3,4. AAVs אינם כשירים באופן טבעי לשכפול, ובכך דורשים וירוס עוזר ומכונות מארחות לשכפול. AAVs אינם גורמים לשום מחלה ויש להם אימונוגניות נמוכה במארח הנגוע3,5. AAV יכול להדביק תאים שיבונים וחלוקה פעילה ועשויים להימשך כאפיוזום מבלי להשתלב בגנום של התאים המארחים (AAV לעתים רחוקות להשתלב בגנום המארח)1,3. תכונות אלה הפכו את AAV לכלי רצוי עבור יישומי ריפוי גנטי.

כדי ליצור וקטור העברת גנים AAV, קלטת transgene, כולל הגן הטיפולי, משובטת בין שתי חזרות מסוף פנימיות (ITRs), אשר נגזרות בדרך כלל סרוטיפ AAV 2. הגודל המרבי מ- ITR בגודל 5 אינץ' ל- ITR של 3 אינץ', כולל רצף הטרנסג'נים, הוא 4.6 kb6. קפידים שונים עשויים להיות תא אחר או טרופיזם רקמה. לכן, capsids צריך להיבחר בהתבסס על הרקמה או סוג התא שנועד להיות ממוקד עם וקטור AAV7.

וקטורים AAV רקומביננטיים מיוצרים בדרך כלל בקווי תאים של יונקים כגון תאי כליה עובריים אנושיים, HEK293 על ידי העברה ארעית של וקטור העברת הגנים AAV, כובע נציג AAV, ווירוס עוזר plasmids2,3. עם זאת, ישנן מספר מגבלות לייצור AAV בקנה מידה גדול על ידי ארעיות של תאי HEK293 חסידים. ראשית, יש צורך במספר רב של ערימות תאים או בקבוקי רולר. שנית, יש צורך בדנ"א פלסמיד באיכות גבוהה ובריגנטים של טרנספקטים, מה שמגדיל את עלות הייצור. לבסוף, בעת שימוש בתאי HEK293 דבקים, הסרום נחוץ לעתים קרובות לייצור אופטימלי, מה שמסבך את העיבוד במורד הזרם1,2,3. שיטה חלופית של ייצור AAV כוללת שימוש בקו תאי החרק, תאי Spodoptera frugiperda (Sf9), ווירוס חרקים הנקרא רקומביננטי חתימה californica וירוס polyhedrosis גרעיני multicapsid (AcMNPV או baculovirus)8,9,10. תאי Sf9 גדלים בתרבית מתלים ללא סרום שקל להגדיל ותואם לייצור בפועל הייצור הטוב הנוכחי (cGMP) בקנה מידה גדול, שאינו דורש ריאגנטים פלסמיד או טרנספקטו. יתר על כן, העלות של ייצור AAV באמצעות מערכת Sf9-baculovirus נמוכה יותר מאשר העלות של שימוש transfection חולף של plasmids לתוך HEK293 תאים11.

מערכת הייצור המקורית של rAAV באמצעות תאי baculovirus-Sf9 השתמשה בשלושה בקולווירוסים: בקולווירוס אחד המכיל קלטת העברת גנים, הבאקולווירוס השני המכיל גן נציג, ואת נגיף הבאקולו השלישי המכיל גן קפסיד ספציפי לסרוטיפ12,13. עם זאת, הבקולווירוס המכיל מבנה נציג היה לא יציב גנטית על סיבובים מרובים של מעברים, אשר מנע הגברה של baculovirus לייצור AAV בקנה מידה גדול. כדי לפתור בעיה זו, פותחה מערכת וקטורית rAAV חדשנית, שהכילה שני בקלווירוסים (TwoBac): אחד baculovirus המכיל את קלטת העברת הגנים AAV ועוד baculovirus המכיל את הגנים rep-cap AAV יחד אשר יציבים יותר מבחינה גנטית מאשר המערכת המקורית ונוח יותר לייצר rAAV בגלל שימוש TwoBac במקום שלושה14, 15. מערכת OneBac משתמשת בקלטת העברת הגנים AAV ובגנים של כובע נציגים בבאקולווירוס יחיד שנוח יותר לייצר את ה- rAAV בגלל שימוש בבאקולווירוס אחד במקום להשתמש ב- TwoBac או ThreeBac2,16,17. במחקר שלנו, מערכת TwoBac שימשה לאופטימיזציה.

מערכת baculovirus לייצור AAV יש גם מגבלות: חלקיקי baculovirus אינם יציבים לאחסון לטווח ארוך בינוני ללא סרום11, ואם titer baculovirus נמוך, יש צורך בנפח גדול של supernatant baculovirus, אשר עלול להיות רעיל לצמיחה של תאי Sf9 במהלך ייצור AAV (תצפית אישית). השימוש בתאי שימור תאים נגועים ללא טיטר והגדלת תאים (TIPS), או תאי חרקים נגועים בבקולווירוס (BIIC), מספק אפשרות טובה לייצור AAV שבהם תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס מוכנים, קריופ שמורים, ולאחר מכן משמשים לזיהום של תאי Sf9 טריים. יתרון נוסף הוא היציבות המוגברת של baculovirus (BV) בתאי Sf9 לאחר cryopreservation10,11.

שני סוגים של תאי TIPS נוצרים כדי לאפשר ייצור AAV: הראשון על ידי זיהום של תאי Sf9 עם BV-AAV2-GFP או גן טיפולי, והשני על ידי זיהום של תא Sf9 עם BV-AAV2-rep-cap. תאי טיפים שמורים ב aliquots קטן ומוכן לשימוש. וקטורים AAV מיוצרים בתרבית מתלים ללא סרום בבקבוקון להציב שייקר מסלולית או bioreactor גל על ידי כת משותפת תאי TIPS המייצרים baculoviruses ותאי Sf9 טריים. תאי Sf9 נגועים בבאקולווירוסים הנושאים את וקטור AAV2-GFP ואת רצפי כובע הנציג כדי ליצור AAV. ארבעה עד חמישה ימים לאחר מכן, כאשר תשואות AAV הן הגבוהות ביותר, תאי היצרן הם lysed עם חומר ניקוי כדי לשחרר את חלקיקי AAV. lysate התא מובהר לאחר מכן על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה וסינון. חלקיקי AAV מטוהרים מהליסאט על ידי כרומטוגרפיה של עמודי AVB ספרוז. לבסוף, וקטורים AAV מרוכזים באמצעות TFF. הפרוטוקול מתאר את הייצור של AAV בקנה מידה קטן, שימושי למחקר ומחקרים פרה קליניים. עם זאת, השיטות ניתנות להרחבה ותואמות לייצור וקטורים AAV ברמה קלינית ליישומי ריפוי גנטי.

Protocol

ראה איור 1 לקבלת איור המסכם את הפרוטוקול.

1. דור תאי טיפים נגועים בבקולווירוס

  1. להפשיר בישול אחד של תאי Sf9 ומיד לזרוע אותם ב 50 מ"ל של מדיום תרבית תאי חרקים. לגדל תאי Sf9 באינקובטור שייקר מסלולית ב 125 סל"ד ו 28 °C בבקבוקונים התחתונים העגולים עם כובע מחובר באופן רופף לחילופי אוויר8,9. להפיץ את התאים בבקבוקון 1 L המכיל 200 מ"ל של בינוני כדי להשיג מספיק תאים לייצור תאי TIPS.
  2. הוסף 50 מ"ל של תאי Sf9 ב 2 x 106 תאים / מ"ל בשני צלוחיות: להדביק בקבוקון אחד של תאי Sf9 עם 0.5 מ"ל של baculovirus (BV)-AAV2-GFP (או גן טיפולי) ואת הבקבוקון השני של תאים עם 0.5 מ"ל של BV-AAV2-rep-cap.
    הערה: פלסמידים וקטור AAV סופקו בנדיבות על ידי ד"ר רוברט מ קוטין (NIH). ייצור Baculovirus מ- DNA bacmid (Bac-to-Bac System) תואר בעבר8,9. היציבות baculovirus במהלך המעבר היא בעיה קריטית עבור ייצור בקנה מידה של rAAV. עדיף להשתמש במספר מעבר נמוך יותר של baculovirus (עד מעבר מספר 4). קבע את הנפח האופטימלי של ה- baculovirus supernatant באופן אמפירי על ידי בדיקת יעילות הזיהום של באקולווירוס באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2) במהלך ייצור תאי TIPS.
  3. לפקח על זיהום baculovirus 3-4 ימים לאחר זיהום על ידי מכתים baculovirus gp64 בתאי Sf9 נגוע כדלקמן.
    1. כתם 2 x 105 תאי Sf9 (תאים נגועים ובאקולווירוס) עם 0.5 מיקרוגרם של נוגדן נגד בקולווירוס gp64 עכבר (1:200) המכיל צבע פלואורסצנטי ב 100 μL של חוצץ חסימה במשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה.
    2. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS כדי להסיר את הנוגדן resuspend התאים מוכתמים ב 300 μL של PBS המכיל 0.5% אלבומין סרום בקר.
    3. נתח את הביטוי baculovirus gp64 על תאים באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2).
      הערה: קבע את אסטרטגיית הגינג עבור רכישת ציטומטריית זרימה וניתוח אמפירי. בסך הכל נרכשים 10,000 תאים חיים בודדים. ביטוי Baculovirus gp64 על משטחי תא Sf9 מציין זיהום baculovirus. לאחר 3-4 ימים, רוב תאי ה-Sf9 נדבקים בנגיף הבאקולווירוס, כפי שמעיד ביטוי baculovirus gp64(איור 2).
  4. כאשר התאים הם 80%-90% קיימא עם עלייה בקוטר(איור 3),לקצור את התאים קריופרסרבל 1 x 107 תאים ב 1 מ"ל של תרבות חרקים מדיום בתוספת עם 10% סרום בקר עוברי 10% דימתיל גופוקסידי במיכל הקפאה איטית ב -80 מעלות צלזיוס. למחרת, להעביר את הצינור המכיל תאי TIPS למקפיא חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: בצע את תרבית התא בארון בטיחות ביולוגית בעקבות טכניקת המעבדה האספטית הסטנדרטית ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).

2. ייצור וקטור AAV

  1. יום 1: תאי Sf9 בעלי תרבות משותפת עם תאי TIPS נגועים בבקולווירוס
    1. תרבות ולגדול תאי Sf9 נאיביים ב 1 x 106 תאים / מ"ל ב 28 °C (2 L צלוחיות המכילות 400 מ"ל של מדיום תרבית תאי חרקים באינקובטור שייקר הדרוש לייצור AAV. לאחר 3-4 ימים, צפיפות התא גדלה עד 5 x 106-6 x 106 תאים /mL.
      הערה: CO2 ולחות אינם גורמים חשובים לצמיחה של תאי Sf9.
    2. זרע את תאי Sf9 או צלוחיות לנער או bioreactor כדלקמן.
      1. ייצור AAV בבקבוקונים בחממה שייקר מסלולית: השתמש פיפטה או משאבה peristaltic לזרוע 400 מ"ל של תרבות Sf9 ב 2 x 106 תאים / מ"ל לתוך בקבוקון 2 L aseptically. הגדר את שייקר מסלולית ב 125 סל"ד ו 28 °C (70 °F).
        הערה השתמש במשאבה פרייסטלית או פיפטה סטנדרטית בהתאם לגודל הייצור של AAV.
      2. ייצור AAV בביו-ריאקטור: השתמש במשאבה פריסטלטית כדי לזרוע 1 ליטר של תרבית Sf9 ב-2 x 106 תאים/מ"ל לתוך שקית ביו-ריאקטור של 10 ליטר באופן הפוך. טען את השקית על יחידת Bioreactor עבור culturing ב 28 °C (50 °F). הוסף 40% חמצן לשקית הביו-ריאקטור ב-0.1 פסאיי. הקימו את יחידת הביו-ריאקטור בזווית של 20° ותנערו את השקית במהירות של 25 סל"ד.
    3. להפשיר בריון אחד של כל BV-AAV2-GFP (או גן טיפולי) ותאי טיפים BV-AAV2-rep-rep. לדלל את התאים עם 20 מ"ל של מדיום תרבית חרקים ולבצע ספירת כדאיות של התאים באמצעות כחול טריפן. לחסן את שני תאי TIPS ביחס של 1:10,000 ביחס לתאי Sf9 הנאיבים בתרבית בבקבוק שייקר או ביו-ריאקטור.
      הערה: ההישרדות של תאי TIPS מופחתת עקב cryopreservation, ואת שיעור ההתאוששות הוא כ 50% כאשר הכדאיות התא נקבע עם כתמים כחול טריפן. בצע ניסוי פיילוט כדי לקבוע אמפירית את היחס של תאי TIPS ותאי Sf9 נאיביים לפני ייצור rAAV בקנה מידה גדול.
  2. יום 2: ניטור תרבות
    1. קציר 1 מ"ל של תרבות Sf9 באופן קפטיות. כתם עם צבע כחול טריפן כדי לנתח את ספירת התאים, הכדאיות והמורפולוגיה.
  3. יום 3: ניטור והאכלה תרבותית
    1. קציר 1 מ"ל של תרבות Sf9 ולנתח את ספירת התאים, הכדאיות והמורפולוגיה. בדוק את המצב של זיהום baculovirus לאחר מכתים את תאי Sf9 כאמור בשלב 1.3.
      הערה: עלייה בקוטר התא ובאפקט ציטופתי הם סימנים לזיהום בבקולווירוס. העלייה בקוטר קודמת לירידה בכדאיות התא, ופרמטרים אלה משמשים לקביעת זמן קציר התא במהלך ייצור AAV. קבע את נקודת הזמן האופטימלית באופן אמפירי.
    2. להאכיל את תרבות Sf9 עם מדיום תרבות חרקים טריים ביחס של 1:5 באופן טפיטי.
  4. יום 4: ניטור תרבות
    1. קציר 1 מ"ל של תרבות Sf9 ולנתח את ספירת התאים, הכדאיות והמורפולוגיה. נתק את אספקת החמצן משקית הביו-ריאה.
  5. יום 5: ניטור תרבות וקציר
    1. קציר 1 מ"ל של תרבות Sf9 ולנתח את ספירת התאים, הכדאיות והמורפולוגיה. קציר את המדיום והתאים התרבותיים כאשר הכדאיות של תאי Sf9 ירדה לסביבות 50% (איור 4).
    2. ספין השעיית התא ב 2100 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). לאסוף את supernatant ואת גלולה התא, ולאחסן אותם ב -80 °C (80 °F).

3. תמיסת תאים ושחרור AAV

  1. להפשיר את גלולה תא מפיק AAV. הוסף 100 מ"ל של מאגר תמוגה של תאים (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM נתרן כלורי, 0.5 % טריטון-X-100) לכדור התא, לערבב במרץ, ודגרה במשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה כדי לשחרר את חלקיקי AAV.
  2. צנטריפוגה ב 2100 × גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (50 °F) ולהעביר את lysate התא למיכל חדש. מערבבים את lysate התא ואת תרבית התא supernatant לאחר הפשרה.
  3. הוסף 20 נוקלאז U /mL ו 10 mM MgCl2 לתא ליסאט כדי לעכל את ה- DNA וה- RNA. דגירה במשך 2-4 שעות ב 37 °C (50 °F).
  4. סנן את lysate באמצעות 0.8 מיקרומטר ו 0.2 μmpolyethersulfone מערכת סינון כפול באמצעות משאבה.
  5. יש לאחסן את התא המובהר במהירות של 4 °C (75°F) למשך הלילה או לטהר את ה-AAV באופן מיידי.

4. טיהור וקטור AAV באמצעות מערכת כרומטוגרפיה של עמודת זיקה

  1. הכן את מכשיר הכרומטוגרפיה על ידי שטיפת רצף של קווי המדגם והחוצץ במים סטריליים, 1 N נתרן הידרוקסיד, מים, תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4) בקצב זרימה של 50 מ"ל / דקה.
  2. הר את עמודת AVB Sepharose (10.0 מ"ל) לתוך מערכת הכרומטוגרפיה, והפעל 100 מ"ל של PBS בקצב זרימה של 5 מ"ל לדקה.
    הערה: השתמש בנפח נמוך או גבוה יותר של עמודת AVB Sepharose בהתאם לגודל הייצור של AAV והגדר את קצב הזרימה כפי שהוצע על-ידי יצרן העמודה או השרף (ראה טבלת חומרים).
  3. כדי לאסוף את שברי התמיסה של מעבר העמוד, מאגר לשטוף, מאגר אלוטציה המכיל חלקיקי AAV, הכנס צינורות לחריצי אספן השבר של מכשיר הכרומטוגרפיה.
  4. שפל את העמודה עם PBS בקצב זרימה של 5.0 מ"ל / דקה.
  5. טען את lysate התא המסונן המכיל חלקיקי AAV על העמודה באמצעות מכונת הכרומטוגרפיה המצוידת במשאבת מדגם. הפעל את המדגם בקצב זרימה של 3.0 מ"ל לדקה.
  6. הפעל PBS דרך עמודת AVB Sepharose בקצב זרימה של 3.0 מ"ל לדקה עד שעקומת הספיגה האולטרה סגולה (UV) (280 ננומטר) תחזור לקו הבסיס ותהפוך ליציבה.
  7. אלים את חלקיקי AAV מהעמודה עם 50 mM נתרן סיטראט (pH 3.0) חוצץ בקצב זרימה של 3.0 מ"ל / דקה (איור 5).
    הערה: בעוד חלקיקי AAV להתנתק מן השרף ולעבור דרך גלאי UV, פסגת החלבון elution ניתן לראות על הכרומטוגרמה.
  8. מיד לדלל את supernatant AAV עם נפח חמישית של 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) כדי להגדיל את ה- pH של AAV המכיל supernatant כ pH 5.5 כדי למנוע השפלה בתיווך pH עם חוצץ האלה חומצית. יתר על כן, לדלל את AAV supernatant פי 10 עם PBS כדי לנטרל באופן מלא את ה- pH.
    הערה: ערך ה- pH הוא כ- 5.5 לאחר נטרול פתרון rAAV. לאחר נטרול AAV, לדלל את פתרון rAAV פי 10 עם PBS (pH 7.4) כך AAV הוא במאגר פיזיולוגי.
  9. יש לאחסן 1 מ"ל של כל דגימות ריצה, מאגר כביסה ו- 100 μL של סופר-נט AAV הנבה כדי להעריך את נוכחותו של AAV על-ידי זיהום של תאי היעד.
  10. נקה את עמודת AVB Sepharose עם 100 מ"ל של חומצת לימון 100 מ"מ (pH 2.1) ו-100 מ"ל של PBS (pH7.4) בקצב זרימה של 5.0 מ"ל/דקה. לשטוף את העמודה עם 20% אתנול בקצב זרימה של 5.0 מ"ל / דקה ולאחסן ב 4 °C (5 °F).
  11. נקה את הצינורות של מכשיר הכרומטוגרפיה עם המיקום הלא מקוון של העמודה כמתואר בסעיף 4.1. לבסוף, לשטוף את מערכת הכרומטוגרפיה עם 200 מ"ל של 20% אתנול בקצב זרימה של 50.0 מ"ל / דקה ולאחסן 20% אתנול.

5. ריכוז וסינון של וקטור AAV באמצעות סינון זרימה משיק (TFF)

  1. הגדר את מערכת TFF המצוידת במחסנית קרום פוליסולפון (100 kDa משקל מולקולרי מנותק) כדי לרכז את AAV.
  2. מודול TFF שוויון עם 200 מ"ל של PBS במשך 10 דקות.
  3. טען את מדגם AAV על ידי שליטה בזרימת המשאבה עד המדגם מופחת לנפח הרצוי תוך שמירה על לחץ קרום טרנס ב 2-3 פסאיי.
  4. Diafiltrate retentate עם 100 מ"ל של PBS, כפי שנעשה במחקר זה, או להגדיר אמפירית חוצץ חלופי התומך ביציבות ארוכת טווח של AAV.
  5. לאחר ריכוז דגימת AAV לנפח הרצוי, לאסוף את מדגם AAV, לסנן אותו דרך 0.2 מיקרומטר polyethersulfonefilter, aliquot, ולאחר מכן לאחסן אותו ב -80 °C (80 °F).

6. זיהום של דגימות AAV בתאי היעד כדי להעריך את נוכחותו של AAV בשלבי הטיהור

  1. לחסן 7 x 104 תאי HT1080 /גם בצלחת 24-well ב 500 μL של בינוני נשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 1% L-גלוטמין, 1% נתרן pyruvate, ו 10% סרום בקר עוברי (FBS) יום לפני ההדבקה. תרבית התאים באינקובטור ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2.
  2. תספור את התאים לפני ההדבקה. הוסף את דגימת ה- AAV המדוללת שלא אובחנה לפני הפעלת העמודה, דגימות ריצה בעמודה, מאגר כביסה ודגימת AAV מטוהרת.
    הערה: לספור את התאים מוכתמים כחול טריפן עם המוציטומטר. קבע את גורם הדילול ואת אמצעי האחסון (μL) של דגימות AAV אמפירית. ככל שצמיגי AAV גבוהים יותר, כך יש צורך בדילול רב יותר. ודא כי חלקיקי baculovirus של מדגם בתפזורת לא שאושר לפני הפעלת העמודה, עמודות לרוץ דרך דגימות, חוצץ לשטוף הם בחום מומתים ב 50 °C (50 °F) במשך 50 דקות לפני הדבקת תאי היעד כדי לקבוע titers זיהומיות של AAV.
  3. יומיים לאחר ההדבקה, לנתח את ביטוי החלבון (למשל, GFP או גן טיפולי) בתאים באמצעות cytometer זרימה.
  4. חשב titers זיהומיות של AAV באמצעות מספר התאים בזמן זיהום, גורם דילול, ואחוז של תאי GFP + עם הנוסחה: (המספר הכולל של תאים x אחוזים GFP + תאים x גורם דילול) / נפח של AAV במיליליטרים.
    הערה: לדוגמה, מספר התאים הוא 1 x 105, אחוז תאי GFP+ הוא 3.4%, גורם הדילול הוא 100, והנפח של AAV נוסף הוא 2 μL. titer של AAV הוא 1.7 x 108 יחידה זיהומית (IU)/mL. הכמות הכוללת של חלקיקי AAV מטוהרים ב-25 מ"ל של השבר המלוטץ היא 4.3 x 109 יחידות זיהומיות (IU)/mL (איור 6). המספר הכולל של חלקיקי AAV ראשוניים שלא קיבלו שיפונו הוא 1.09 x 1010 IU/mL, וחלקיקי AAV מטוהרים הם 4.3 x 109 IU/mL. לכן, אחוז ההתאוששות הוא 39.4%. אחוז תאי GFP+ צריך להיות בין 1%-30%, התואם לטווח ליניארי בעת שימוש בחישוב ה- titer הזיהומי של AAV. אם חלקיקים וקטורים AAV מרוכזים יותר נגועים בתאי היעד; קיימת אפשרות כי עותקים מרובים של חלקיקי AAV עלולים להדביק תא בודד שיציג כעותק יחיד של הווקטור. לכן, לדלל את supernatant וקטור AAV כדי להשיג 1%-30% זיהום וקטורי בתאי היעד. אם לווקטור AAV אין גן עיתונאי, הכתימו את הטרנסג'ן או את הגן הטיפולי שבא לידי ביטוי בווקטור AAV בנוגדן המכיל צבע פלואורסצנטי שניתן לזהות ולהו כמות באמצעות ציטומטר זרימה. לא כל הסרוטיפים של AAV יכולים להדביק ביעילות תאי HT1080. לכן, כדי לבצע את ההדבקה של סרוטיפים אחרים של AAV, השתמש בשורות תאים שונות. Titer חלקיקי AAV2-GFP לפני הטיהור ולאחר טיהור על תאי HT1080 ולמדוד את ביטוי GFP על ידי ציטומטריית זרימה. חשב את ההתאוששות (%) לפי היחס בין מספר חלקיקי AAV מטוהרים ומספר חלקיקי AAV לפני הטיהור מוכפל ב -100.

תוצאות

כאן, התוצאות הייצוגיות של פיתוח תהליכים לייצור וטיהור של וקטורים AAV באמצעות מערכת תאי החרקים Sf9 מוצגים. השיטה כוללת תרבית משותפת של תאי Sf9 עם תאי TIPS נגועים בבקולווירוס, הזנת התאים עם מדיום גדילה, קצירה ותזה של תאי המפיק כדי לשחרר את חלקיקי AAV, הבהרה של ליסאט התא עם טיפול נוקלאז, צנטריפוגה וסינ...

Discussion

הפרמטרים המשמשים בפרוטוקול זה לפיתוח תהליך הייצור, הטיהור והריכוז של וקטורים AAV ניתן להחיל הן ייצור קטן בקנה מידה גדול של וקטורים AAV עבור יישומי ריפוי גנטי. ניתן לבצע את כל התהליך במעלה ובמורד הזרם במערכת סגורה התואמת לנוהלי הייצור הטובים (cGMP) הנוכחיים. היתרונות העיקריים של מערכת Sf9-baculovirus ה...

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לד"ר רוברט מ. קוטין (המכון הלאומי ללב, דם ולריאות, NIH) על שסיפק לנו בנדיבות את הפלסמידים של AAV ודניאל סטיל ורבקה ארנסט (בית החולים לילדים בסינסינטי) על הסיוע הטכני שלהם. עבודה זו נתמכת על ידי קרן הסטארט-אפ מקרן סינסינטי לחקר הילדים ל- M.N.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 N Sodium HydroxideSigma-Aldrich1.09137For Akta Avant cleaning
2 L flasksThermoFisher Scientific431281Flask for suspension culture
50 ml Conical tubeThermoFisher Scientific14-959-49AFor collection of supernatants
24-well plateThermoFisher Scientific07-200-80Adherent cell culture plate
250 mL flasksThermoFisher Scientific238071Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn SoftwareCytiva28976337Chromatography system
AVB Sepharose High PerformanceCytiva28411210Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFPIn-housenon-catalogAAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-capIn-housenon-catalogAAV packaging vector
NucleaseSigma-AldrichE1014Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking bufferSanta Cruz Biotechnologies516214Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis bufferIn-houseNon-catalog item20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 LCytiva28937662Bioreactor bag
Cleaning bufferIn-houseNon-catalog item100 mM citric acid (pH 2.1) 
CryovialThomas Scientific1222C24For cryopreservation
DMEMSigma-AldrichD6429Growth media for cell lines
Elution bufferIn-houseNon-catalog item50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
EthanolSigma-AldrichE7073For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit Pall Corporation12941Membrane filter
HT1080 cell lineATCCCCL-121Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture mediaCytivaSH30278.02Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic PumpPall CorporationNon-catalog itemTFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator ThermoFisher ScientificNon-catalog itemShaker for suspension culture
MicroscopeNikonNon-catalog itemCell monitoring and counting 
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibodySanta Cruz Biotechnologies65498 PEMonitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tankPraxairNon-catalog item40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBSThermoFisher Scientific20012027Wash buffer
Silver Staining kitThermoFisher ScientificLC6100Staining AAV capsid proteins
Sf9 cellsThermoFisher Scientific11496-015Insect cells
Steile waterIn-houseNon-catalog itemFor Akta Avant cleaning
Table top centrifugeThermoFisher Scientific75253839/433607For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridgePall CorporationOA100C12TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0ThermoFisher15568025Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50Cytiva28-9378-00Bioreactor

References

  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  3. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  4. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  5. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
  6. Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
  7. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  8. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
  9. Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
  10. Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
  11. Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
  12. Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
  13. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  14. Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
  15. Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
  16. Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
  17. Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
  18. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  19. Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
  20. Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
  21. Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
  22. Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

179AAVbaculovirusSf9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved