מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת

Summary

כימות מהיר ויעיל של גדילת שחפת M. תוך תאית הוא חיוני להמשך טיפולים משופרים נגד שחפת ( שחפת ). פרוטוקול זה מתאר בדיקת זיהוי קולורימטרית מבוססת מרק באמצעות מערכת תרבית נוזלית אוטומטית כדי לכמת את גידול ה-Mtb במקרופאגים שטופלו בטיפולים מוכווני מארח מועמדים.

Abstract

מיקובקטריום שחפת (Mtb), הגורם הסיבתי לשחפת, היה גורם התמותה המשמעותי ביותר ממחלות זיהומיות בעולם עד להופעת COVID-19. Mtb התפתח כדי להתמיד בסביבה התוך-תאית שלו, להתחמק מהגנות המארח, ופיתח עמידות לתרופות רבות נגד שחפת. גישה אחת לפתרון עמידות היא זיהוי תרופות מאושרות קיימות שיגבירו את התגובה החיסונית של המארח ל-Mtb. לאחר מכן ניתן יהיה לשנות את ייעודן של תרופות אלה כטיפולים משלימים המכוונים על ידי מארח (HDT) כדי לקצר את זמן הטיפול ולסייע להתגבר על עמידות לאנטיביוטיקה.

כימות של גידול Mtb תוך-תאי במקרופאגים הוא היבט מכריע בהערכת HDT פוטנציאלי. תקן הזהב למדידת גידול Mtb הוא ספירת יחידות יוצרות מושבה (CFU) על לוחות אגר. זוהי בדיקה איטית, עתירת עבודה, שאינה מתאימה לסינון מהיר של תרופות. בפרוטוקול זה, מערכת תרבית אוטומטית, מבוססת מרק, המשמשת בדרך כלל יותר לאיתור Mtb בדגימות קליניות, הותאמה לסינון פרה-קליני של טיפולים מכווני מארח. הוערכה יכולתה של מערכת בדיקת התרבית הנוזלית לחקור גידול Mtb תוך-תאי במקרופאגים שטופלו ב-HDT. ה-HDTs שנבדקו על יכולתם לעכב צמיחת Mtb היו חומצה רטינואית כל-טרנסית (AtRA), הן בתמיסה והן במיקרו-חלקיקים של פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) והשילוב של אינטרפרון-גמא ולינזוליד. היתרונות של טכניקה אוטומטית זו המבוססת על תרבית נוזלית על פני שיטת CFU כוללים פשטות התקנה, הכנה פחות עתירת עבודה וזמן מהיר יותר לתוצאות (5-12 ימים לעומת 21 ימים או יותר עבור צלחות אגר).

Introduction

מיקובקטריום שחפת (Mtb), הגורם הסיבתי לשחפת, היה הרוצח המשמעותי ביותר למחלות זיהומיות בעולם בשנת 2019¹. כדי להתחמק מהגנות המארח, Mtb חותר תחת הפעילות המיקובקטריאלית של תאי מערכת החיסון המולדת כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs), ומאפשר לו להתמיד תוך תאית ולהשתכפל². היעדר חיסון יעיל למניעת שחפת ריאתית למבוגרים והופעתם הגוברת של זנים עמידים לתרופות מדגישים את הצורך הדחוף בטיפולים חדשים.

טיפולים משלימים המכוונים על ידי מארח (HDT) יכולים לקצר את זמן הטיפול ולעזור להתגבר על התנגדות³. הערכה פרה-קלינית של מועמדי HDT במבחנה כדי לקבוע פעילות מיקובקטריצידלית בתוך מקרופאגים מסתמכת לעתים קרובות על כימות של גידול Mtb על ידי יחידות יוצרות מושבה (CFU) על צלחות אגר מוצקות. זוהי בדיקה איטית, עתירת עבודה, שאינה מתאימה לסינון מהיר של תרופות. מערכות זיהוי מיקרוביאליות אוטומטיות מבוססות מרק, הזמינות מסחרית, נפוצות יותר במעבדות מיקרוביולוגיה קליניות לזיהוי ובדיקת רגישות לתרופות של Mtb ומינים מיקובקטריאליים אחרים בדגימות קליניות⁴. מכשירים אלה מודדים גדילה בעקיפין על סמך הפעילות המטבולית החיידקית המובילה לשינויים פיזיים במדיית התרבית (שינוי ברמות CO 2 או O₂ או לחץ) המנוטרים לאורך זמן⁵. הקריאה היא זמן לחיוביות (TPP), שבעבר הוכח כי היא מתואמת עם Mtb CFU בדגימות כיח של חולי שחפת בתגובה לטיפול ^6,7 ובליזטים של ריאה וטחול מורין נגועים⁸. בנוסף, נעשה שימוש במערכות לזיהוי תרביות נוזליות כדי למדוד את ההשפעה של טיפולים קונבנציונליים המכוונים לפתוגנים על צמיחת מיקובקטריה בתרבית אקסנית ומקרופאגים בתרבית ^9,10. המכשיר שימש גם כדי לחקור את היכולת המולדת של תאים דנדריטיים ושל מקרופאגים אלוואולריים לשלוט בצמיחה תוך-תאית של Mtb^11,12. פרוטוקול ניסיוני זה מדגים כי ניתן להתאים מערכת אבחון של תרבית נוזלית לביצוע בדיקות סקר פרה-קליניות של HDT לשחפת במקרופאגים בתרבית. בהשוואה לספירה של CFU, היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מפחיתה במידה ניכרת את העבודה הניסיונית ואת הזמן הדרוש לכימות גדילה/הישרדות של מיקובקטריאליים תוך-תאיים. טכניקה זו מסתמכת על גישה לכלי תרבית אוטומטי שניתן להשתמש בו כדי להעריך את הישרדות המיקובקטריאליים התוך-תאיים בתאי מערכת החיסון שטופלו במגוון רחב של ריאגנטים פרמקולוגיים המכוונים לתפקודים תאיים כדי להגביר את חסינות המארח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו באמצעות זן H37Ra מוחלש של Mtb, אשר ניתן לטפל בו במעבדת הכלה רמה 2. כל המניפולציות של מיקובקטריה חיה בוצעו בארון הבטיחות הביולוגי מסוג II (BSC). הליכים ניסיוניים נועדו למזער את הדור של אירוסולים. תרבית תאים אאוקריוטים (תאי THP-1) בוצעה גם ב-BSC מדרגה II. המעבדה ביצעה הערכת סיכונים והבטיחה כי כל ההליכים יבוצעו בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדית והארצית. קו התאים המונוציטי האנושי THP-1 שימש לביצוע השיטה כמתואר (שלב 1). התאים מתמיינים למקרופאגים לאחר גירוי עם פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) לפני זיהום במיקובקטריה.

1. תרבית תאים

1. הפיצו מלאי זרעים H37Ra כדי לרשום שלב בציר Middlebrook 7H9 (MB) בתוספת העשרת אלבומין-דקסטרוז-קטלאז (ADC) (10%) ו-0.05% פוליסורבט 80. יש לאחסן מלאי H37Ra ב-1 מ"ל במקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך עד שנה.
2. הפשירו בקבוקון של 1 מ"ל של Mtb-H37Ra והעבירו אותו לבקבוקון T25 עם מכסה מסנן המכיל 9 מ"ל של מרק נוסף MB כשבוע לפני הניסוי המתוכנן. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס במשך 5-7 ימים באינקובטור סטטי.
3. לגדל תאי THP-1 ב-RPMI-1640 בתוספת 10% סרום עגל עוברי ללא חום (שלם (c)RPMI) בבקבוק T75 באינקובטור לח CO 2 ב-5% CO₂/37 °C ותת-תרבית פעמיים בשבוע כדי לשמור על צפיפות של פחות מ-1 x 10^{6 תאים} למ"ל.
4. התמינו תאי THP-1 למקרופאגים 3 ימים לפני ההדבקה על ידי פיפטינג עדין של תאים מספר פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית בבקבוקי T75 כדי לפזר את כל הגושים ולהניח אותם בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
5. תאים צנטריפוגים בגודל 300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מסירים את הסופר-נטנט, ומניחים בעדינות את הכדור ב-2 מ"ל של RPMI. בצע ספירת תאים כדי להעריך תאים/מ"ל.
6. זרע 2 מ"ל של מקרופאגים THP-1 ב-12 צלחות תרבית רקמה בצפיפות של 100,000 תאים/מ"ל ב-cRPMI עם 100 ננוגרם/מ"ל PMA למשך 72 שעות. הסר את המדיום המכיל PMA מהתאים וחדש עם cRPMI טרי לפני זיהום Mtb.
7. הגדר לוחות נפרדים עבור כל נקודת זמן נדרשת.
8. תאי זרעים באותה צפיפות (100,000 תאים/מ"ל) בשקופיות של 2 תאי זכוכית כדי לקבוע את ריבוי הזיהום (MOI).
9. מניחים באינקובטור 5% CO₂ לח למשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.

2. כימות קליטת MTB

1. קביעת ספיגת MTB על ידי מקרופאגים (MOI)
   1. הגדר את ארון הבטיחות הביולוגי Class II (BSC) ביום ההדבקה ועבוד על שתי שכבות של נייר טישו כדי לתפוס כל נזילה. הגדירו מיכלי פסולת להשלכה בהתאם לתקנות המקומיות.
   2. הסר 6-8 מ"ל של תרבית מיקובקטריאלית מבקבוק T25 והעבר אותו לצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל.
      הערה: ניתן להשתמש בצינורות בנפח קטן יותר לניסויים קטנים יותר.
   3. צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה ספסל בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 2890 x גרם.
   4. הסר בזהירות את הצינור מהצנטריפוגה והעבר אותו לארון הבטיחות הביולוגי. המתן דקה אחת כדי לאפשר לחיידקים לשקוע.
      1. שפכו את חומר החיטוי לתוך מיכל ההשלכה של חומר החיטוי, שפופרת הסיכום והרחיקו את החיידקים בתווך הנותר על ידי הקשה על צד הצינור. המתן דקה אחת כדי לאפשר לחיידקים לשקוע.
   5. מוסיפים 2 מ"ל של cRPMI שחומם מראש, מערבבים בעדינות ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
   6. יש להשעות את המיקובקטריה בזהירות רבה באמצעות מחט של 25 גרם ומזרק של 5 מ"ל. כדי לבצע החייאה, משכו את תרחיף המיקובקטריה לתוך המזרק ופלטו בעדינות רבה לאורך דופן הצינור כדי למזער את ייצור האירוסול. חזור על 6-8 פעמים.
      הערה: נקוט זהירות מרבית מכיוון שמדובר בתרבית בצפיפות גבוהה של מיקובקטריה. כדי למנוע את הסיכון של פגיעה במקל המחט, השתמש במחטים קהות במידת האפשר, ומזרקי Luer.
   7. השליכו את המחט והמזרק במיכל חדים ב- BSC.
   8. העבירו את המתלים לצינור מיקרופוגה בגודל 2 מ"ל (עם מכסה הברגה) וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות ב-100 x גרם כדי לגלגל את כל הגושים שנותרו. החזירו את הצינור לארון הבטיחות והמתינו דקה אחת כדי לאפשר לחיידקים לשקוע.
   9. העבר את 1-1.5 המ"ל העליונים של הסופרנטנט לצינור חדש. יש להשליך את השפופרת המקורית לדלי הפסולת המכיל חומר חיטוי. מערבבים היטב ומוסיפים כמויות שונות של מתלה המיקובקטריאלי (למשל, 5, 25, 50, 150 μL) למגלשות תא הזכוכית של 2 בארות ודוגרים במשך 3 שעות באינקובטור CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
2. צביעה על חיידקים מהירים חומצית (AFB)
   הערה: לאחר דגירה של 3 שעות, המקרופאגים נשטפים ומקובעים עם פרפורמלדהיד כדי להשבית מיקובקטריה. לאחר מכן, השקופיות מוכתמות באמצעות ערכת Auramine O שעברה שינוי (ראו טבלת חומרים) כדי להעריך מיקובקטריה פאגוציטוזה לכל תא. בשל דופן תא השעווה שלהם, מיקובקטריה שומרים על צבע האורמין לאחר שטיפת חומצה-אלכוהול. גרעיני המקרופאגים מוכתמים לאחר מכן ב-Hoechst. שיטה זו מאפשרת לספור את מספר החיידקים הפאגוציטוזים לכל תא ומשמשת לקביעת ריבוי הזיהום (MOI) של המקרופאגים.
   1. הסר את המדיום ממגלשת תא הזכוכית לאחר צנרת למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לעקור חיידקים שלא טופלו פאגוציטוזה.
   2. לשטוף פעם אחת עם 2 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר.
   3. מלאי חנות של 4% paraformaldehyde, מומס PBS ב aliquots ב -20 °C (70 °F) עד 6 חודשים. להפשיר אליקוט של 4% פרפורמלדהיד מיד לפני השימוש. יש לדלל ל-2% פרפורמלדהיד עם PBS ולהוסיף 2 מ"ל לכל באר.
   4. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להסיר את מגלשת תא הזכוכית מארון הבטיחות בשלב זה לצורך צביעה.
   5. שטפו את המגלשה מתחת לזרם עדין של מי ברז.
   6. יש לפזר מספיק אורמין על המגלשה כדי לכסות את התאים באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק ולדגירה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר בחושך (לכסות בנייר אלומיניום).
   7. שטפו את עודפי הצבע מהמגלשה עם מי ברז והוסיפו את מסיר הצבעים / quencher למשך דקה אחת בחושך.
   8. שטפו את העודפים במי ברז ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם Hoechst 33342 (10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS) בחושך.
   9. שטפו את כתם ההוכסט במי ברז, הסירו את התאים, נקזזו עודפי מים מהמגלשה, הוסיפו טיפת אנטיפדה וכיסוי, ויייבשו באוויר.
   10. בחן את השקופית מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות המטרה 100x שמן. מיקובקטריה תזרח בירוק מתחת למסנן FITC. הגרעינים מתנוססים בכחול מתחת למסנן DAPI (איור 1C).
   11. קבע את MOI על ידי ספירת מספר המיקובקטריה פאגוציטוזה לכל תא ואחוז התאים הנגועים.
   12. חשב את נפח ההשעיה המיקובקטריאלית הדרושה להשגת ה- MOI הנדרש בהתבסס על שטח הפנים של באר בצלחת; לדוגמה, שטח הפנים של שקופיות תא הזכוכית ששימשו בניסוי זה הוא 4 ס"מ². MOI נמוך (כ-1-2 בצילי לתא) רצוי לניסויים הנערכים במשך מספר ימים (למשל, 5 ימים).
3. זיהום של מקרופאגים
   1. ערבבו היטב את תרחיף המיקובקטריה והוסיפו את הכמות הדרושה לתאים על לוחות של 12 בארות לאחר שנקבע הנפח הדרוש להשגת ה-MOI הרצוי.
   2. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות כדי לאפשר למיקובקטריה להיות פאגוציטוזה.
   3. הסר חיידקים חוץ תאיים על ידי שטיפת הבארות עם RPMI חם או HBSS מספר פעמים.
   4. שים את המקרופאגים בבאר אחת (דגימה של 3 שעות) כדי לקבוע את אחוז הזמן לחיוביות (TTP) של האינוקולום הראשוני (דגימה של 3 שעות) כמתואר בשלב 3 להלן.
   5. הוסף cRPMI טרי ואת מינוני התרופה הנדרשים או בקרת רכב לבארות הנותרות, לדגור את הצלחות בחממת CO₂ ב 37 מעלות צלזיוס לזמן הדרוש (תלוי בתכנון הניסוי אבל בדרך כלל במספר מרווחים בין 1 ל 8 ימים).

3. קצירת דגימות למערכת זיהוי תרבית נוזלית

הערה: ביום ההדבקה, מיקובקטריה חוץ-תאית מוסרת על-ידי שטיפה, ומיקובקטריה תוך-תאית נקטפת על-ידי תזה של באר אחת של מקרופאגים (דגימה של 3 שעות) כדי לקבוע את הכמות הראשונית של פאגוציטוזה כבקרה בסיסית לזיהום. בזמנים שלאחר מכן משולבים גם המדיום, ליזאט התאים וגם השטיפות כדי למדוד את הצמיחה המיקובקטריאלית הכוללת. ניתן גם להעריך צמיחה חוץ-תאית ותוך-תאית בנפרד במידת הצורך.

1. קציר דגימה של 3 שעות כדי לקבוע TTP
   1. יש לשטוף מיקובקטריה חוץ-תאית מכל הבארות לאחר 3 השעות הראשונות של הזיהום כמתואר בשלב 2.3.3. הוסף 1 מ"ל של מדיה טרייה לבאר הבקרה של 3 שעות כדי להשוות את עוצמת הקול של ליזאט עם אלה של נקודות זמן מאוחרות יותר.
      הערה: ראה שלב 3.2.7 אם יש להוציא מיקובקטריה חוץ-תאית מהניתוח.
2. איסוף דגימות
   1. בקבוקי מרק MB חמים ותרבית כלי נגינה כדי להביא אותם לטמפרטורת החדר.
   2. העבר את המדיום מצלחת 12 הבאר לצינורות החרוטיים המסומנים המתאימים.
   3. הוסף 500 μL של מאגר ליזיס סטרילי (0.1% Triton x-100 ב- PBS מסונן דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר) לכל באר למשך 10 דקות.
   4. מגרדים בעדינות את התאים מהבאר עם מגרד סטרילי ומשלבים עם המדיום בצינור החרוטי המתאים.
   5. לשטוף את הבאר עם 0.5 מ"ל של PBS סטרילי ולהעביר את הצינור המתאים.
   6. מעבירים בעדינות כל דגימה דרך מחט ומזרק (25 גרם) 6-8 פעמים כדי לפרק את הגושים. לדלל דגימות 1:10 במרק MB; 100 μL מדגם + 900 μL MB בינוני.
   7. בזמנים/ימים הנדרשים (בדרך כלל בין 1 ל-8 ימים), קצרו את הדגימות הנותרות על ידי ביצוע השלבים 3.2.1-3.2.6 לעיל.
      הערה: החוקרים עשויים להעדיף להוציא מיקובקטריה חוץ-תאית מהניתוח שלהם, ובמקרה זה, בשלב 3.2.2 לעיל, התווך מכל באר מושלך, ומקרופאגים נשטפים מספר פעמים לפני הוספת מאגר תזה.
3. בקבוקי תרבית מכשירים לחיסון וטעינה
   הערה: פרטים על כלי התרבית הנוזלית והחומרים המתכלים הקשורים אליו מסופקים בטבלת החומרים.
   1. יש לעקר את פקק הגומי של בקבוק תרבית המכשיר בנייר טישו ספוג ב-70% אלכוהול ולאפשר לו להתייבש באוויר.
      הערה: שלב זה צריך להתבצע ב- BSC.
   2. הכינו את הבקבוקים על ידי העברת כמות מספקת של תוספי תזונה עבור כל הדגימות לתוך צינור חרוטי (0.5 מ"ל/בקבוק). השתמשו במחט ובמזרק כדי להזריק 0.5 מ"ל של תוסף תזונה לבקבוק תרבית המכשירים.
   3. פיפטה 500 μL של הדגימה המדוללת (1:10) לתוך צינור 1 מ"ל עם תחתית V.
   4. השתמש במחט ובמזרק כדי להזריק את הדגימה של 500 μL לתוך בקבוק תרבית המכשיר שהוקצה.
   5. יש לעקר את פקק הגומי של בקבוק תרבית המכשיר בנייר טישו ספוג ב-70% אלכוהול ולאפשר לו להתייבש באוויר. נגבו את הבקבוקים עם נייר טישו ספוג ב-70% אלכוהול לפני הוצאתם מה-BSC.
   6. העבירו בזהירות בקבוקים מארון הבטיחות הביולוגית למכשיר הטעינה.
   7. לחץ על לחצן הטעינה במערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית.
   8. סרוק את הברקודים על בקבוקי תרבית מכשירים והכנס את הבקבוקים לחממה של מערכת הגילוי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 42 יום. קרא והקלט את הזמן שנדרש כדי להגיע לחיוביות ממסך המכשיר.
      הערה: הברקוד מאפשר למכשיר לזהות את הבקבוק ולקשר קריאות השתקפות עם בקבוק מסוים.
   9. חשב את זמן האחוזים לחיוביות (TTP) על-ידי השוואת ה-TTP של האינוקולום התוך-תאי הראשוני (יום 0) לזה של מקרופאגים שגודלו בתרבית עבור הזמנים שצוינו. שינוי חיובי באחוז TTP פירושו צמיחה מיקובקטריאלית¹³.
      לדוגמה, עבור היום השלישי:
      אחוז השינוי בזמן לחיוביות =

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מכשיר התרבית הנוזלית האוטומטי ששימש במחקר זה מנטר רמות CO₂ כל 10 דקות. שינוי צבע בחיישן בתחתית בקבוק המכשיר נמדד באופן צבעוני ומתבטא כיחידות רפלקציה. לאחר מכן, תוכנת המכשיר מיישמת אלגוריתמי זיהוי כדי לחשב את הזמן לחיוביות (TTP), כלומר את מספר הימים מהחיסון ועד שהתרביות מסומנות כחיוביות (<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

החוקרים השתמשו בשיטת התרבית הנוזלית המתוארת בפרוטוקול זה כדי לעקוב אחר צמיחת Mtb במקרופאגים שמקורם במונוציטים ובמקרופאגים אלוואולריים ובתאי THP-1 הממוינים ב-PMA^11,16,17. טכניקה זו יכולה גם להיות שונה לשימוש עם תאים שאינם דבקים¹². לא?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IX51 Fluorescent Microscope	Olympus, Japan	N/A	AFB detection and imaging
2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	72.694.006	Mtb infection of macropahges
5 mL syringe, Luer lock	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	SZR-150-031K	Mtb infection of macropahges/CFU
50 mL tube, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	62.547.254	Mtb infection of macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	R2625	Host directed therapy candidate
BacT/ALERT 3D Microbial Detection System	Biomerieux ( Hampshire, UK)	247001	Broth-based colormetric detection system
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP Nutrient Supplement	Biomerieux ( Hampshire, UK)	414997	Broth-based colormetric detection assay
BACT/ALERT MP culture bottles	Biomerieux ( Hampshire, UK)	419744	Broth-based colormetric detection assay
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0553	Mycobacterium liquid culture
BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0678	Colony Forming Units
Cell scraper, 25 cm	Sarstedt, North Carolina, USA	83.1830	Harvest of lmacrophage lysates
Corning Syringe Filter, 0.2 µm	Corning Incorporated, Germany	431219	Sterilization of lysis buffer
Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness	VWR International Limited	631 - 0147
Cycloheximide, from microbial	Sigma Aldrich, Missouri, USA	C7698	Colony Forming Units
Dako Fluorescent Mounting Medium	Agilent Technologies Ireland Limited	S3023	Antifade mounting medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich, Missouri, USA	D8537	Mtb infection of macropahges
Fetal Bovine Serum, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	10270106	Macrophage cell culture
Glycerol, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	228220	Colony Forming Units
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	B2261	Nuclear stain
IFNγ, recombinant human	R&D Systems Inc, Minnesota, USA	285-IF	Host directed therapy candidate
Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	TKT-210-150R	Mtb infection of macropahges
L-Asparagine, anhydrous	Sigma Aldrich, Missouri, USA	A4159	Colony Forming Units
Linezolid	Sigma Aldrich, Missouri, USA	PZ0014	Antibiotic
Microlance Hypodermic Needle 25 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	300400	Mtb infection of macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0303	Colony Forming Units
Middlebrook 7H9 Broth Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0178	Mycobacterium liquid culture
Modified Auramine O Stain and Decolourizer	Scientific Device Laboratory, IL, USA	345-250	AFB stain
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich, Missouri, USA	158127	Mtb infection of macropahges
Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag)	Sarstedt, North Carolina, USA	82.1473.001	Colony Forming Units
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	P8139	Macrophage cell culture
Polysorbate 80, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	231181	Mycobacterium liquid culture
RPMI-1640, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	52400025	Macrophage cell culture
Sterile Cell Spreader, L-Shaped	Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA	RB-44103	Colony Forming Units
T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	156367	Mycobacterium liquid culture
THP-1 cell line	ATCC, Virginia, USA	ATCC TIB-202	Macrophage cell culture