JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מודלים מקיפים במבחנה המשיבים נאמנה את המחלה האנושית הרלוונטית חסרים. המחקר הנוכחי מציג יצירה ותרבות תלת מימדית של גידול תלת מימדי(תלת-ממדי), כלי הפריה אמין לחקר האינטראקציה בין הגידול לסטרומלי בקרצינומה הפטוקולרית האנושית.

Abstract

האגרסיביות והיעדר טיפולים נסבלים ויעילים ביותר עבור קרצינומה hepatocellular מתקדמת (HCC), הצורה הדומיננטית של סרטן הכבד, לתרץ את הדירוג שלה כגורם השני בשכיחותו למוות הקשור לסרטן. מודלים פרה-קליניים צריכים להיות מותאמים כדי לשחזר את התנאים האנושיים כדי לבחור את המועמדים הטיפוליים הטובים ביותר לפיתוח קליני ולסייע באספקת רפואה מותאמת אישית. מודלים תלת-ממדיים של כדוריות תאיות (תלת-ממדיות) מציגים הבטחה כחלופה במבחנה מתפתחת לתרבויות חד-ממדיות (דו-ממדיות) של מונו-שכבתיות. כאן, אנו מתארים מודל כדורי גידול תלת מימדי המנצל את היכולת של תאים בודדים לצבור כאשר הם נשמרים בטיפות תלויות, והוא מייצג יותר סביבת in vivo מאשר monolayers סטנדרטיים. יתר על כן, כדורי תלת-ממד יכולים להיות מיוצרים על ידי שילוב תאים הומוטיפיים או הטרוטיפיים, המשקפים יותר את ההטרוגניות התאית ב- vivo, מה שעשוי לאפשר מחקר של אינטראקציות סביבתיות שיכולות להשפיע על התקדמות ותגובות טיפול. המחקר הנוכחי ייעל את צפיפות התאים ליצירת כדורי גידול הומוטיפיים והטרוטיפיים תלת-ממדיים על ידי השתהות השעיות תאים על המכסים של מנות פטרי סטנדרטיות בגודל 10 ס"מ3 . ניתוח אורך בוצע כדי ליצור עקומות צמיחה עבור גידול הומוטיפי לעומת הטרוטיפיקי / כדורי פיברובלסטים. לבסוף, ההשפעה המתרבת של פיברובלסטים (תאי COS7) ומיופיברובלסטים בכבד (LX2) על גידול הומוטיפי (Hep3B) כדורי נחקרה. צפיפות זריעה של 3,000 תאים (במדיה של 20 μL) הניבה בהצלחה כדורי הטרוטיפיים של Huh7/COS7, שהציגה עלייה מתמדת בגודל עד ליום התרבות 8, ואחריה פיגור גדילה. ממצא זה אומת באמצעות כדוריות הומוטיפיות Hep3B בתרבית LX2 (קו תא כוכבי הכבד האנושי) מדיום מותנה (CM). LX2 CM עורר את התפשטות כדורי ההפ3B בהשוואה לספרואידים של שליטה בגידול. לסיכום, פרוטוקול זה הראה כי כדורי גידול תלת-ממדיים יכולים לשמש ככלי הפריה פשוט , חסכוני וקדם-מסך לחקר אינטראקציות סרטניים-סרטניים באופן מקיף יותר.

Introduction

השכיחות העולמית והתמותה מסרטן הכבד המשיכו לעלות, למרות ההתקדמות בטיפולים במחלת כבד וברוב סוגי הסרטן האחרים. בשנת 2018, סרטן הכבד עלה על סרטן המעי הגס והקיבה והפך הגורם השני בשכיחותו למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם1. בשנת 2020 היו יותר מ-9,000,000 אבחונים חדשים, המהווים 4.7% מכלל מקרי הסרטן ברחבי העולם1. זה מאכזב במיוחד, בהתחשב בכך גורמי הסיכון המשמעותיים להתפתחות HCC, הצורה הנפוצה ביותר של סרטן הכבד, מאופיינים היטב2. שחמת הכבד היא גורם הסיכון הנפוץ ביותר להתפתחות HCC, עם 80% מהמקרים המתפתחים על רקע שחמת הוקמה2. מחלות כבד כרוניות, אשר מתקדמות שחמת הכבד, וכתוצאה מכך HCC, כוללות וירוס הפטיטיס B (HBV), וירוס הפטיטיס C (HCV), מחלת כבד הקשורה לאלכוהול (ARLD), מחלות כבד שומני לא אלכוהוליות (NAFLD) - האחרון המיוחס להשמנת יתר וסוכרת מסוג 2 (T2DM)2,3. פרוטוקולי הניהול הנוכחיים של HCC תלויים בשלבים ומוגבלים עבור חולי סרטן מתקדם, שלרוב יש להם תוצאה גרועה4. חלה התקדמות משמעותית באמצעות מעכבי קינאז, ולאחרונה, טיפולים חיסוניים-אונקולוגיים, אם כי באופן מציאותי, מועילים רק למיעוט חולים עם סרטן כבד מתקדם5. יתר על כן, קיים חשש כי HCCs הנובעים בחולים עם NAFLD - הגורם הבסיסי הגדל במהירות הגבוהה ביותר, המהווה יותר מ -50% ממקרי HCC שאובחנו לאחרונה במדינות המערב, עשוי להיות עמיד יותר למוות מתוכנת 1 (PD1) טיפול מעכב מחסום 6.

יש כבר השקעה מסיבית בניסויים קליניים עבור חולים עם HCC, כולל שיפורים משמעותיים בניסויים קליניים ונקודות הקצה שלהם7. לאחר עשור של כישלונות, השקעות אלה החלו לשנות את ההזדמנויות עבור חולים. עם זאת, המציאות היא כי השיעור הכולל של המגיבים נשאר נמוך יחסית, עם חולים שגויסו לניסויים לעתים קרובות מייצגים בצורה גרועה את אלה שמטופלים במרפאות. הסכנה היא שההתקדמות יקרה ותועילה למעטים ולא לרבים. ככל שיותר טיפולים מועמדים מופיעים לשימוש חד פעמי או לשילוב, חיוני שיהיו מודלים פרה-אקליניים שמנבאים יותר את תגובות vivo. אלה עשויים להיות מודלים המשלבים גורמים נוספים התורמים לשונות הנראית בתגובות המטופל המשקפות טוב יותר את ההטרוגניות של HCC האנושי ואת המורכבות הפתולוגית8. מערכות הפותולוגיות של HCC נדרשות כדי לסייע בהבנת הביולוגיה של התפתחות הגידול, צמיחה והתקדמות. המודלים הניסיוניים הקיימים של מחלות כבד כרוניות ו- HCC נופלים בדרך כלל תחת שלוש קטגוריות עיקריות: במודלים מבוססי בעלי חיים של vivo (שנסקרו ב- 9), בתרביות במבחנה10, ומודלים ex vivo11,12. גישות מבוססות בעלי חיים משמשות רבות לחקר מחלות כבד כרוניות, כולל HCC; עם זאת, השונות הגנטית, עלויות ההפעלה הגבוהות ומערכת החיסון השונה בין המינים הם בין המגבלות העיקריות ליישום מודלים כאלה9. בעוד כמה מודלים ex vivo לספק כלי מצוין להתמקד ברקמות אנושיות לעומת מודלים אחרים קו תאי במבחנה, זמינות רקמות ואת קורס זמן הניסוי המוגבל לחסום את השימוש שלהם בקנה מידה גדול.

מצד שני, מודלים קו תאי במבחנה להישאר אפשרות טובה עבור מדענים עובדים עם משאבים מוגבלים, עם צורך פחות יש אספקה מתמדת של רקמות אנושיות טריות10. מודלים אלה מספקים גם כלי שיכול לשמש כמסך ראשון כדי לסייע באימות היעד של בחירת סמים לפני שתמשיך למורכב יותר בדגמי vivo. השינוי האחרון של תרבויות המונו-שכבתיות הדו-ממדיות המסורתיות לתרבויות תלת-ממד שיפר את היעילות של דגמי במבחנה אלה13,14.

מודלים במבחנה תלת-ממדית יכולים לשחזר תכונות קריטיות הנראות במצבים אנושיים נורמליים ופתולוגיים. בתנאים פיזיולוגיים, העברת אותות מתבצעת באמצעות הצלבה תאית ואינטראקציה עם מולקולות אחרות של רקמת חיבור, כלומר, חלבוני המטריצה החוץ-תאית (ECM), היוצרים רשת אינטראקציה תלת-ממדית15,16. הגידול מתפתח בצורה כדורית תלת-ממדית במהלך טרנספורמציה ממאירה, שעבורה חמצן וחומרים מזינים מצויים בשפע באינטרפאזה שאינה גידול/גידול. יחד עם זאת, תנאים היפוקסיים השולטים בליבת הגידול. הטרוגניות זו בזמינות החומרים המזינים גורמת להפעלה של אותות ייחודי מרחבי ומסלולים מטבוליים המווסתים גידולים. תנאים אלה הם recapitulated בצורה גרועה בתרביות monolayer 2D קונבנציונאלי14, שבו תאים לגדול על פלסטיק תרבות נוקשה בצורה לא רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. תאים סרטניים מתקשרים גם עם תאים אחרים שאינם א-פרנסיים, המקור העיקרי של ECM, צמיחה, ופלישת איתות בתוך microenvironment הגידול. שלא כמו תרביות 2D, מודלים במבחנה 3D יכול לספק פלטפורמה מתאימה יותר ללמוד אינטראקציה זו סרטניים-stromal17.

מודלים תלת-ממדיים נמצאים בשימוש נרחב בשדה HCC, והם משתנים באופן שבו נוצרת המיקרו-רקמה18,19,20,21,22,23. רוב הדגמים הללו השתמשו בלוחות הכריכה האולטרה-נמוכים18,19,20,21,22 או בטרנס-וולס23 בתהליך היווצרות כדורית. הפרוטוקול המתואר מציג את טכניקת הטיפה התלויה כחלופה, נטולת פלסטיק וחסכונית במודל כדורי הגידול התלת-ממדי במבחנה. זה עשוי להקל על הערכת התפקידים paracrine ו autocrine של פיברובלסטים על התפשטות של תאי הגידול בפורמט 3D.

Protocol

1. הכנת תאים

  1. בצע את כל הניסויים בתנאים סטריליים בארון בטיחות מיקרוביולוגי זרימה למינארית Class II (ראה טבלה של חומרים).
    1. הפעל את מכסה המנוע ולאפשר את ייצוב זרימת האוויר.
    2. ביסודיות לרסס את משטח מכסה המנוע הפנימי עם 70% אתנול כדי למנוע כל זיהום אפשרי ממשתמשים קודמים.
    3. הכן 5% מתמיסת חיטוי בכוס זכוכית 500 מ"ל. השלך כל תא-על-נט או פסולת תאים בתוך הפתרון.
    4. נקה ביסודיות את כל המיקרופיטים ותיבות הטיפים עם 70% אתנול.
  2. הכן מדיה של תרבית תאים טריים על ידי השלמת מדיית הגלוקוז הגבוהה של הנשר (DMEM) המותאמת של Dulbecco עם סרום בקר עוברי מנוטרל בחום 10%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל של פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין), ו-2 מ"מ ל-גלוטמין. עבור קו תאי סטולט הכבד LX2, להפחית את הריכוז של תוספת FBS ל 2%.
  3. חמימות את התקשורת התרבותית לפני תחילת הניסוי.
  4. קח את קווי תאי הגידול של Huh7 ו- Hep3B HCC ואת קווי התאים פיברובלסט COS7 ו- LX2 ממתלה האחסון שלהם בחנקן נוזלי. להפשיר במהירות תאים קריופ שמורים.
  5. לדלל תאים מופשרים עם 2 מ"ל של מדיה תרבית טרי. תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של מדיה תרבות חמה טרי.
  6. תאי זרעים בבקבוק תרבית תאים T75. לדגור את התאים באינקובטור תרבית התא ב 5% CO2 ב 37 °C בתנאים לחים 95% עד התאים להגיע 60%-70% השפעה.

2. איסוף תאים

  1. שאפו את המדיה התרבותית ושטפו תאים שלוש פעמים עם תמיסת מלח פוספט (PBS).
  2. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 1x התחמם מראש כדי לנתק תאים דבקים מתחתית צלוחיות T75. דגירה ב 37 °C (50 °F) באינקובטור במשך 4 דקות.
  3. חוסר הפעילות של טריפסין על-ידי הוספת 4 מ"ל של מדיה תרבותית שלמה. לאסוף את השעיית התא ותאי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את supernatant ו resuspend התאים במדיה תרבית טרי 4 מ"ל.

3. ספירת תאים

  1. מערבולת בעדינות את השעיית התא כדי להבטיח הפצה הומוגנית של תאים בצינור הצנטריפוגה.
  2. באמצעות פיפטה 10 μL, לערבב 10 μL של השעיית תא עם 10 μL של כחול טריפן. מקטרים בעדינות את התערובת למעלה ולמטה ארבע פעמים כדי להבטיח הכתמה מלאה של משטח התא החיצוני עם הצבע.
  3. ספירת מספר התאים באמצעות המוציטים.
    1. ראשית, מניחים כיסוי מעל אזור הספירה של המוציטומטר לפני טעינת ההשעיה המוכתמת של התא.
    2. מניחים את קצה הפיפטה המכיל את ההשעיה של התא לתוך חריץ V של המוצ'יטומטר. גרוש בעדינות את תוכן הקצה לשקופית הספירה.
    3. השאירו את ההסתעפות להסתפק בכמה דקות לפני שתתקן אותה על במת המיקרוסקופ לספירת תאים.
      הערה: כדי להימנע מספירה כפולה, ספרו רק את התאים משני צידי הריבוע הגדול.
    4. ספירה בתאים החופפים לפסיקה העליונה או הימנית והימנעו מאלה החופפים לפסיקה התחתונה או השמאלית.
  4. חשב את המספר הכולל של תאים.
    הערה: מספר תא למ"ל = figure-protocol-2793

4. אוסף מדיה מותנית פיברובלסט (CM)

  1. שאפו את מדיית התרבות ושטפו את תאי LX2 שלוש פעמים עם PBS.
  2. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 1x התחמם מראש כדי לנתק תאים דבקים מתחתית צלוחיות T75. לדגור את הבקבוקון ב 37 °C (5 °F) באינקובטור במשך 4 דקות.
  3. חוסר הפעילות של טריפסין על-ידי הוספת 4 מ"ל של מדיה תרבותית שלמה. לאסוף את השעיית התא ותאי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. ספירת התאים לפי שלב 3.
  4. זרע 1 x 106 LX2 תאים ב 10 cm3 מנות עבור 48 שעות ב 37 °C (7 °F).
  5. לאסוף את CM פיברובלסט לאחר 48 שעות. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה כל תאים צפים. מסנן סטרילי את ה- CM באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר קבוע בתחתית מזרקי 20 מ"ל.
  6. לאסוף את CM supernatant. Aliquot CM לתוך צינורות 2 מ"ל ולאחסן ב -80 °C (80 °F) ליישומים נוספים.
    הערה: הפתרון יכול להיות מאוחסן במשך 6 חודשים ב -80 °C (70 °F).

5. אימות צפיפות תאים עבור כדוריות מושלמות

  1. שאפו את המדיה התרבותית ושטפו את קווי התא של HCC שלוש פעמים עם PBS.
  2. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 1x התחמם מראש כדי לנתק תאים דבקים מתחתית צלוחיות T75. דגירה ב 37 °C (50 °F) באינקובטור במשך 4 דקות.
  3. חוסר הפעילות של טריפסין על-ידי הוספת 4 מ"ל של מדיה תרבותית שלמה. לאסוף את השעיית התא ותאי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. ספירת התאים לפי שלב 3.
  5. פיפטה בצפיפות שונה מקווי תאי הגידול (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 ו -125 תאים) ב 20 μL של מדיה על פני השטח הפנימיים של מכסה 10 cm3 של צלחת פטרי.
  6. הוסף 10 מ"ל של PBS סטרילי לתחתית המנה כדי לספק תנאים לחים לתהליך היווצרות כדורית.
  7. הפוך את המכסה של צלחת 10 cm3 כדי לאפשר את התקשורת, כולל השעיית התא, לתלות מעל סביבה לחה. תשאיר את הטיפות התלויות למשך 3 ימים.
  8. צלם תמונות של כדוריות בהגדלה של פי 50 באמצעות מיקרוסקופ הפוך 3 ימים לאחר תליית הטיפות המקוריות.

6. גידול הטרוטיפי/כדורי סטרומלי

  1. השהה 1500 תאי HCC של Huh7 עם 1500 תאי פיברובלסט יונקים COS7 (יחס 1:1) בטיפות תלויות כדי ליצור כדורים. הוסף 10 מ"ל של PBS סטרילי לתחתית המנה כדי לספק תנאים לחים עבור כדורי.
  2. הפוך את המכסה של צלחת 10 cm3 כדי לאפשר את התקשורת, כולל השעיית התא, לתלות מעל סביבה לחה. תשאיר את הטיפות התלויות למשך 3 ימים.
  3. קח תמונות של כדורי באמצעות מיקרוסקופ הפוך מהיום 3 עד היום 10 של תרבות.
    1. שים את צלחת 10 cm3 על במת המיקרוסקופ. התאם את ההגדלה של המיקרוסקופ ב 50x עבור כל כדורי.
    2. פתח את תוכנת המיקרוסקופ במחשב המצורף והתאם את המיקוד שלו כך שתהיה לו תמונה ברורה של כל כדורי. השתמש בכלי הלכידה בתוכנת המיקרוסקופ כדי לשמור את התמונות שנרכשו.

7. כדורי ההפ3B ההומוטיפיים ב-LX2 CM

  1. השהה 3000 תאי HCC Hep3B בטיפות התלויות כדי ליצור כדורים. הוסף 10 מ"ל של PBS סטרילי לתחתית המנה כדי לספק תנאים לחים עבור כדורי.
  2. הפוך את המכסה של צלחת 10 cm3 כדי לאפשר את התקשורת, כולל השעיית התא, לתלות מעל סביבה לחה. תשאיר את הטיפות התלויות למשך 3 ימים.
  3. העבר כדורי Hep3B לתוך 20 μL של CM טרי מתאי LX2 בטיפות תלויות.
    הערה: השתמש סטרילי autoclaved לא מסונן 200 טיפים פיפטה μL בתהליך של העברת כדורית כדי למנוע כל הפרעה או פגיעה כדוריות שנוצרו. זה גם כדי לחסל את כל התאים שיורית שנותרו מחוברים לספרואיד הבודד העיקרי.
    1. השתמש בצינור 20 μL משועבד אוטומטית לתהליך ההעברה. כוונן את נפח הפיפטה ל-2 מיקרו-אל. חבר את קצה הפיפטה לפיפטה.
    2. הפוך את המכסה של צלחת 10 cm3 שעליו נוצרו כדוריות. תקן את המכסה על הבמה של מיקרוסקופ אור. התאם את המוקד העדין של המיקרוסקופ כדי להפוך כל ספירואיד לגלוי.
    3. בזהירות לרוקן את האוויר מן micropipette על ידי לחיצה על כפתור הבוכנה. הכנס את קצה הפיפטה לטירה, כולל הספרואיד, להעברה. התקרבו מאוד לספרואיד מבלי לגעת בו עם הקצה.
    4. שחרר בעדינות את הלחץ על כפתור הבוכנה כדי לאפשר את היניקה של הכדור לתוך קצה micropipette במדיה 2 μL.
    5. מעבירים את הכדור לתוך טיפה חדשה התלויה על צלחת חדשה בגודל 10 ס"מ 3 , עם מדיה חדשה/ מדיה /טיפול מותנים.
      הערה: ודא כי כל כדורי מועברים בהצלחה לצלחת 10 cm3 החדשה באמצעות מיקרוסקופ אור.
  4. צלם תמונות של כדוריות בהגדלה של פי 50 באמצעות מיקרוסקופ הפוך מיום ההעברה (יום 3) ועד ליום 7 של תרבות ב- LX2 CM.

8. חישוב נפח כדורי

  1. הקצה מזהה מספרי ייחודי עבור כל כדורי כדי שניתן יהיה ללכוד תמונות מספירואידים תואמים מדי יום.
  2. נתח תמונות של כדוריות גדלות באמצעות חבילת תוכנה לניתוח תמונה.
    1. פתח כל תמונה כדורית בתוך חבילת התוכנה. בעזרת כלי הבחירה Freehand וחלוקה לרמות של כל כדורי. מהלחצן הנפתח 'ניתוח ', בחר 'הגדר מדידה' ולאחר מכן 'אזור'. לחץ על אישור.
    2. ציירו עיגול באופן ידני סביב כל כדורי. לאחר הקפת הכדור, הקש Ctrl + M כדי לאפשר לתוכנית לחשב את האזור הכדורי בפיקסלים. המר את אזור הכדוריד לאמצעי אחסון.
      הערה: נפח spheroidmm3 =0.09403 × figure-protocol-7838
    3. חשב את השינוי בנפח כדורי ביחס לאמצעי האחסון שלו ביום הראשון של לכידת התמונה.
      הערה: זה כדי לנרמל את נפח הכדוריד לנפח ההתחלתי ולשפר את הדיוק בהתחשב בווריאציה הטבעית בגודל ההתחלה.

תוצאות

תאים בתרבית בתבנית תלת-ממדית רב שכבתית משקפים בצורה מדויקת יותר את המורכבות של מיקרו-סביבה של הגידול מאשר תרביות 2D קונבנציונליות24,25. בעבר, מחקרים רבים השלימו את מדיה תרבות spheroids עם מיטוגנים שונים וגורמי גדילה26 ליזום היווצרות כדורית. במחקר זה, עם זאת, תוספת של פיברובלסטים, או CM שלהם, מספק מיטוגנים חיוניים וגורמי גדילה כדי להאיץ את הצמיחה כדורית.

איור 1 מתאר נתונים ממחקר פיילוט שבו תאי HCC אנושיים של Huh7 נזרעו בצפיפות זריעה יורדת החל מ-12,000 עד 125 תאים ב-20 μL מדיה טרייה למשך 3 ימים. צפיפות זריעה של 12,000 תאים הניבה כדוריות עם צורה אסימטרית, שלא תוקנה גם לאחר חציית צפיפות זריעת התאים. עם זאת, כדורי כדורי שנוצרו מ-3,000 תאים נראו מעוגלים יותר (איור 1, שורה עליונה). הפחתה נוספת של ריכוז התאים לא הצליחה ליצור כדורים בודדים (125, 250, 500 כדורים בצפיפות תאים) ולא הייתה להם מראה כדורי רגיל (1000 ו-1500 כדורי צפיפות תאים). ראוי להזכיר כי כדורים קטנים רבים נוצרו בצפיפות של 500 תאים סרטניים; עם זאת, רק ספרואיד קטן אחד נלכד בהגדלה של פי 50 (איור 1, שורה עליונה). אותו פרוטוקול ממוטב הוחל על קו התאים של פיברובלסט כליות הפרימטים של COS7 (איור 1, שורה אמצעית). השעיית 125, 250 ו-500 פיברובלסטים COS7 בטיפות תלויות של 20 μL הביאה לספרואיד מעוגל אחד עם מספר כדוריות קטנות יותר, בעוד שצפיפות תאים גבוהה יותר (1000, 1500 ו-3000) יצרה כדורי כדור מעוגלים למחצה בודדים. בדומה לכדורואידים של גידול Huh7, השעיות תאים גבוהות יותר (6,000 ו-12,000 תאים/כדור) גרמו להיווצרות אגרגטים לא סדירים של תאים, ולכן ריכוזי תאים גבוהים יותר הושלכו (איור 1, שורה אמצעית). צפיפות נמוכה של מתליות תאים הטרוטיפיים של Huh7/COS7 (125, 250 ו- 500 תאים/כדור) יצרו כדורי יחיד עם מספר כדוריות צפות או מחוברות למחצה (איור 1, שורה תחתונה). כדורי 1000 ו-1500 תאים הטרוטיפיים היו מעוגלים למחצה, בעוד שצפיפות זריעה של 3,000 תאים (1500 לכל סוג תא) העניקה כדורי תלת-ממדי מעוגל. כפי שצוין קודם לכן, צפיפות תאים גבוהה יותר הביאה להיווצרות אגרגטים ולא כדוריים מוגדרים היטב (איור 1, שורה תחתונה). לסיכום, 3000 כדורי צפיפות תאים היו מעוגלים, בדומה גידולים HCC אנושי, והותאמו לניסויים נוספים. תפילת ההשעיות של התאים כתליית טיפות במשך 3 ימים הספיקה כדי לקדם היווצרות כדורית.

לאחר אופטימיזציה של ריכוז התא הטוב ביותר ואת נקודת הזמן להיווצרות כדורית בהקשר הנוכחי, ההשפעה המתרבת של גידול פולחן משותף וקווי תאים פיברובלסט הוערך לאורך. איורים 2 ואיור 3 מראים שספרואידים הטרוטיפיים של Huh7/COS7 (3,000 מספרי תאים כוללים לכל כדורי) מנוטרים מהיום השלישי ועד היום העשירי. כדורי האה 7 ו- COS7 הומוטיפיים (1500 תאים כל אחד) שימשו כלפקדים. החל מהיום הרביעי, כדורי כדורי הטרוטיפיק גדלו בצורה עגולה אידיאלית בהשוואה לספרואידים הומוטיפיים (איור 2). הנפח ההתחלתי של הכדורואיד ההטרוטיפי היה גדול מזה של כל ספרואיד הומוטיפי. הצמיחה של כדורי כדורי חושבה כשינוי בנפח שלהם ביחס לנפח הראשוני ביום היווצרות כדורית כדי למנוע שונות נורמלית בנפח כדורי (יום 3, איור 3). כדוריות הטרוטיפיק הראו בתחילה שלב צמיחה מהיר החל מהיום הרביעי ועד היום השביעי ואחריו שלב איטי יותר של צמיחה ביום 8 (איורים 2, שורה עליונה ואיור 3). נפח הכדוריד ירד בימים 9 ו -10, אולי משקף את דלדול של חומרים מזינים או ליבה היפוקסית ומוות תאים.

לעומת זאת, כדורי האץ' ו-COS7 ההומוטיפיים צמחו בקצב איטי בהרבה (איור 2, שורות אמצעיות ותחתונות; איור 3). כדוריות הומוטיפיות הציגו עקומת גדילה סטטית יחסית עד היום החמישי של התרבות (יומיים לאחר היווצרות כדורית). החל מהיום השישי החלו הכדורואידים ההומוטיפיים להראות עלייה הדרגתית בעקומת הצמיחה שלהם, אם כי בשיעור נמוך משמעותית מזה של כדורי ההטרוטיפיק (איור 3). לסיכום, כדורים הטרוטיפיים של גידול/פיברובלסט גדלים בקצב גבוה יותר מאשר כדוריות הומוטיפיות המצביעות על כך שהמגע הישיר של תאים סרטניים ופיברובלסטים מגדיל את גודל כדורי הגידול.

לבסוף, כדי לאמת את הממצאים הנ"ל ולחקור את ההשפעה הפאקרינית של תאים מזנכימליים על התפשטותם של כדורי HCC בהקשר הקשור לכבד, כדורי HCC הומוטיפיים בני 3 ימים גדלו במדיה טרייה רגילה או CM מתאי כוכבי כבד LX2 (איור 4 ואיור 5) למשך 4 ימים נוספים. במבט ראשון, 3,000 תאי Hep3B יצרו כדוריות מעוגלות לחלוטין לאחר 3 ימים (איור 4). כדורי Hep3B הראו התפשטות מתמשכת בתקשורת הטרייה מהיום השלישי ועד היום השביעי (איור 4, שורה עליונה). קצב הצמיחה הוגבר כאשר כדורי Hep3B נשמרו ב- LX2 CM (איור 4, שורה תחתונה). המרה תלוית מדיה זו בצמיחת כדורית Hep3B הציגה מובהקות סטטיסטית מהיום הרביעי ועד סוף הניסוי (איור 5), דבר המצביע על התפשטות מונעת פיברובלסט של כדורי גידול.

לסיכום, מחקר זה שינה בהצלחה את תרביות הכדורידים בתלת-ממד הקיימות כדי לנצל את ההצלבה בין תאי הגידול של HCC לבין קווי תאים פיברובלסט שונים ולחקור את המשמעות המתרבת של אינטראקציה תאית ישירה ועקיפה זו (איור 6). יש צורך באפיון נוסף של כדוריות שנוצרו כדי לשפר את האופן שבו תאים סרטניים מתקשרים עם המיקרו-סביבה שמסביב.

figure-results-5438
איור 1: אופטימיזציה של צפיפות התאים האופטימלית להיווצרות כדורית. עמודות מייצגות צפיפות זריעה שונה של תאים, ושורות מייצגות כדוריות שנוצרו מתאי Huh7 (שורה עליונה), תאי COS7 (שורה אמצעית) ותאים הטרוטיפיים של Huh7/COS7 (שורה תחתונה). תמונות מייצגות כדוריות שנוצרו לאחר השעיית 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 ו- 12000 תאים (משמאל לימין) במדיה של 20 μL למשך 3 ימים. מחקר הפיילוט כלל שני כדורי כל מצב, והתמונות צולמו בהגדלה של פי 50, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6239
איור 2: גידול הטרוטיפיק לעומת הומוטיפי. עמודות מייצגות את היום שבו צולמו תמונות כדוריות, ושורות מציגות תמונות מייצגות עבור כדוריות שנוצרו מתאי Huh7 (שורה עליונה), תאי COS7 (שורה אמצעית) ותאי Huh7/COS7 (שורה תחתונה). התמונות מייצגות את כדורי הכדור שנוצר לאחר השעיית 3000 תאים מכל תנאי (הומוטיפיק Huh7, COS7 או כדורי ההטרוטיפיק של Huh7/COS7) של נקודות זמן שונות משמאל לימין. הניסוי כלל 10 כדורי ספירה לכל מצב, והתמונות צולמו בהגדלה של פי 50, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7046
איור 3: ניתוח אורך של צמיחה הטרוטיפית לעומת הומיפית. הגרף מציג את עקומת הצמיחה של כדורי Huh7/COS7 הטרוטיפיים לעומת כדורי Huh7 ו-COS7 הומוטיפיים. הנתונים מוצגים כממוצע ± s.e.m; n = 10 כדוריות עצמאיות. ** p < 0.01; עמ' < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7611
איור 4: צמיחת כדורי ההפ3B ההומוטיפיים ב-LX2 CM. עמודות מייצגות את היום שבו צולמו תמונות כדוריות, ושורות מציגות תמונות מייצגות של כדורי Hep3B המתרבתים במדיה טרייה של תרבות DMEM (שורה עליונה) או LX2 CM (שורה תחתונה). הניסוי כלל שבעה כדורים לכל מצב (מדיה טרייה או LX2 CM), ותמונות צולמו בהגדלה של פי 50, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8279
איור 5: ניתוח אורך של גידול כדורי ההפ3B ההומוטיפיק. הגרף מציג את עקומת הצמיחה של כדורי Hep3B במדיה לתרבות DMEM טרייה או LX2 CM. הנתונים מוצגים כממוצע ± s.e.m; n = 7 כדוריות עצמאיות. עמ' < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8813
איור 6: ייצוג סכמטי של תהליך היווצרות כדורי. מתלה התא הוא pipetted על המכסה הפנימי של 10 cm3 צלחת פטרי. המכסה הפוך ונשמר במשך 3 ימים כדי לאפשר היווצרות כדורית הומוטיפית או הטרוטיפית. תמונות כדוריות נלקחות בהגדלה של פי 50. האיור נוצר באמצעות כלי איור מדעי מבוסס אינטרנט (ראה טבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ההקשר שבו קווי התא הניסיוני גדלים משפיע על פרופיל ביטוי הגנים שלהם, ניתוח מסלולים וקריטריונים פונקציונליים. לדוגמה, בתאי סרטן השד, הקואורדינציה בין מסלולים אונקוגניים שונים נשמרת רק אם תאים סרטניים גדלים בקונפורמציה תלת-ממדית27. גנים מבודדים בסלנומה תלת-ממדית ובספרואידים לסרטן השד, אך לא בתאי המונו-שכבתייה, רלוונטיים יותר לגידול האנושי in vivo28,29. לדוגמה, רמות האינטל β1 בתאי אפיתל של המארית ועמיתיו הגידול היו נמוכות מהרמות שגדלו בתבנית דו-יומית29. יתר על כן, פיברובלסטים במבנים תלת-ממדיים נוטים לנדוד באופן מובהק במונחים של מורפולוגיה ומהירות בהשוואה לאלה מתורבתים על פלסטיק30. בנוסף, הנוקשות המכנית של מצע הצמיחה מפעילה מסלולים ספציפיים המעודדים טרנספורמציה ממאירה של תאי אפיתל רגילים באמצעות הסרת הפיקוח על הקינאז המוסדר על ידי אותות (ERK)/רו בתאי אפיתל31. גורמים אלה מעדיפים את המעבר מתרבות דו-ממדית קונבנציונלית לדגמים כדוריים תלת-ממדיים, שכן תרבויות תלת-ממד עולות יותר על תם למחלות אנושיות.

המחקר הנוכחי השתמש בכלי מעבדה ואספקה קונבנציונליים כדי לייצר מודל כדורי גידול תלת-ממדי. כדורי הכדורים שנוצרו הגיבו לאותות ההתפשטות המגיעים מפיברובלסטים, כפי שניתן לראות על ידי הצמיחה המוגברת באופן משמעותי שלהם. מודל זה שייך לקטגוריית כדורי הגידול הרב-תאיים. ישנן שלוש קטגוריות אחרות של כדורי גידול תלת-ממדיים, כולל tumorospheres32, כדורי גידול שמקורם ברקמות33,34, וספירואידים רב תאיים אורגנוטיפיים35. בספירואידים של גידול רב-תאי, תאים סרטניים מושעים בתנאי הידבקות נמוכה כדי לאפשר להם להצטבר יחד כדי ליצור כדורים מבלי לגעת בתחתית כלי התרבות36. מספר גישות שימשו כדי לספק טכניקה זו ללא עיגון עצמאית, החל מערכות מסתובבות, טכניקות כיסוי נוזלי, וצלחות U מצורף אולטרה נמוך לא מזוהה37. ב- HCC, רוב תרביות הפריה הפריה משתמשות בלוחות 24 או 96-בארות אולטרה-נמוכים כדי ליצור כדוריות מעוגלות18,19,20,21,22. טכניקה זו, עם זאת, אינה חסכונית ואינה שוללת כל מגע תאי-פלסטיק בשוגג. מערכות אחרות משתמשות בטרנס-בארות23 או בפרוסות כבד12 כדי לייצר מיקרו-רקמות בכבד. שימוש ברקמות אנושיות בעבודה תרגומית הוא תקן הזהב אך לא תמיד זמין או נגיש על ידי קבוצות מחקר רבות. הגישה הנוכחית נהנתה מתיאוריית הטיפות התלויות. השעיית התא מתווספת כך שהספרואידים של הגידול נוצרים בממשק אוויר נוזלי נגיש ליצירת כדורים מעוגלים בודדים38. היתרונות של שימוש בטכניקה זו הם היעדר כל מגע תא-פלסטיק ואת הקלות של לימוד autocrine ו paracrine crosstalk בין גידול ותאי פיברובלסט. מודל זה אומת עוד יותר במחקר אחר המפענח את החשיבות של TREM2 שאינו א-פרנסימלי בהגנה על הכבד מפני פיתוח HCC39. עבודה זו הראתה כי נפח של כדורי Hep3B ו- PLC / PRF5 היה גבוה יותר בשליטה LX2 CM לעומת TREM2-overexpressing LX2 CM באופן תלוי Wnt39.

במחקר הנוכחי, פיברובלסטים היו מעורבים עם תאים סרטניים לפני היווצרות כדורית כדי לחקור את ההשפעההתרבותית של תרבות משותפת זו. אחרים הוסיפו פיברובלסטים, תאי אנדותל ותאי מערכת החיסון עם השעיית תאי הגידול לאחר יצירת כדורי גידול כדי לחקור את נדידת התאים הסטרומליים לתוך הגידול40,41. המודל ההטרוטיפי הנוכחי של הכדורואיד הראה דפוס גדילה דומה לדגמים שדווחו בעבר ולגידול המקורי ב-vivo; spheroids להראות צמיחה מעריכית ואחריו שלב צמיחה מאוחר, ככל הנראה בשל דלדול של חומרים מזינים והגדלת הליבה הנמקית42. במקום להוסיף גורמי גדילה ומיטוגנים כדי לעזור היווצרות כדורית, מחקר זה השתמש בגישה פיזיולוגית יותר על ידי כך שיש גורמי גדילה אלה ממגע ישיר עם פיברובלסטים או הפרשתם ב- CM פיברובלסט. זה חיוני להזכיר כי תאי LX2 ניתן להפעיל עוד יותר על ידי טיפול עם TGFβ1 או PDGF43. תאי LX2 טופלו ב- 10 ng/mL TGFβ1 למשך 48 שעות לפני הסרת המדיה עבור הגדרות ניסיוניות שונות. תאי LX2 נשטפו שלוש פעמים עם PBS (כדי לא לכלול כל אפקט TGFβ1 ישיר), ולאחר מכן מדיה טרייה נוספה עבור 24 שעות נוספות לפני איסוף CM. ה- CM שנאסף מ- LX2 מגורה TGFβ1 גרם לצמיחת כדורי ההפ3B בקצב גבוה יותר מה- CM מה- LX2 שליטה (נתונים שאינם מוצגים). מערכת גמישה זו יכולה להשאיל את עצמה לתרבויות משותפות של תאים סרטניים שונים פלוס / מינוס פיברובלסטים, כמו גם קווים שמקורם בחולים. זה יכול גם להציע בדיקת סינון תפוקה בינונית עבור תרופות שניתן לאמץ במהירות ולהכניס לתוך צינור גילוי סמים תרגום ליידע מנון למחקרי vivo.

מגבלה של המחקר הנוכחי היא השימוש בקווי התא המונצחים בהיווצרות כדורית ולא בתאי גידול HCC מבודדים טריים ופיברובלסטים הקשורים לסרטן. מגבלה נוספת היא השוואת הצמיחה ההומוטיפית של ה-Hep3B בין CM מ-LX2 למדיה טרייה ולא CM מקווי תאים אחרים שאינם פיברובלסט. המגבלה האחרונה יכולה להיות מטופלת על ידי שינוי גנטי של גן של עניין בפיברובלסטים ואחריו החלת CM מסוג פראי לעומת פיברובלסט מהונדס גנטית לספרואידים הומוטיפיים.

Disclosures

FO הוא דירקטור ובעל מניות של פיברופיד מוגבלת.

Acknowledgements

MYWZ ממומן על ידי מזכיר המדינה לאסטרטגיה עסקית, אנרגיה ותעשייה ופרס ניוטון 2020 כחלק מקרן הסיוע הרשמית לפיתוח "ODA" וניוטון. SS נתמך על ידי מחקר סרטן בריטניה מתקדם מדען מדענים C53575/A29959. SS, FO, ו HR לקבל מימון כחלק האנטר, במימון שותפות בין חקר הסרטן בבריטניה, Fondazione AIRC, ו Fundacion Cientifica דה לה אסוציאיון אספנולה קונטרה אל סרטן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x TrypsinSigma Aldrich59429C
2 mL tubesEppendorf
BiorenderBiorender.comOnline
Class II laminar flow BioMAT2 hoodMedair Technologies
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)BioseraM-D1107
Excel sofwareMicrosoft office 365
Graphpad prism sofwareGraphPad software
Heat deactivated fetal bovine serum (FBS)life tech105000064
Image J softwareFiji
L-glutamineSigma AldrichG7513-100ml
Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin)Sigma AldrichP0781-100ml
Petri dish 90 mm, triple ventedGreiner633175
Trypan blueSigma AldrichT8154
Virkon™ Broad Spectrum Disinfectant, 5kg BucketRely+On™SCI-129999
Ziess inverted microscopeZiess

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer statistics for the year 2020: an overview. International Journal of Cancer. , (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 6(2021).
  3. Reeves, H. L., Zaki, M. Y., Day, C. P. Hepatocellular carcinoma in obesity, Type 2 diabetes, and NAFLD. Digestive Diseases & Sciences. 61 (5), 1234-1245 (2016).
  4. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  5. Reig, M., et al. Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Update of the consensus document of the AEEH, AEC, SEOM, SERAM, SERVEI, and SETH. Medicina Clinica (Barc). 156 (9), 1-30 (2021).
  6. Pfister, D., et al. NASH limits anti-tumour surveillance in immunotherapy-treated HCC. Nature. 592 (7854), 450-456 (2021).
  7. Llovet, J. M., et al. Trial design and endpoints in hepatocellular carcinoma: AASLD consensus conference. Hepatology. 73, Suppl 1 158-191 (2021).
  8. Llovet, J. M., Hernandez-Gea, V. Hepatocellular carcinoma: reasons for phase III failure and novel perspectives on trial design. Clinical Cancer Research. 20 (8), 2072-2079 (2014).
  9. Brown, Z. J., Heinrich, B., Greten, T. F. Mouse models of hepatocellular carcinoma: an overview and highlights for immunotherapy research. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 15 (9), 536-554 (2018).
  10. Nikolic, M., Sustersic, T., Filipovic, N. In vitro models and on-chip systems: Biomaterial interaction studies with tissues generated using lung epithelial and liver metabolic cell lines. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 120(2018).
  11. Clark, A. M., Ma, B., Taylor, D. L., Griffith, L., Wells, A. Liver metastases: Microenvironments and ex-vivo models. Experimental Biology and Medicine. 241 (15), 1639-1652 (2016).
  12. Paish, H. L., et al. A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
  13. Brassard-Jollive, N., Monnot, C., Muller, L., Germain, S. In vitro 3D systems to model tumor angiogenesis and interactions with stromal cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 594903(2020).
  14. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  15. Kleinman, H. K., Philp, D., Hoffman, M. P. Role of the extracellular matrix in morphogenesis. Current Opinion in Biotechnology. 14 (5), 526-532 (2003).
  16. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  17. Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W., Koteliansky, V. E., Bissell, M. J. The origin of the myofibroblasts in breast cancer. Recapitulation of tumor environment in culture unravels diversity and implicates converted fibroblasts and recruited smooth muscle cells. Journal of Clinical Investigations. 95 (2), 859-873 (1995).
  18. Shao, H., et al. A novel stromal fibroblast-modulated 3D tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60660(2020).
  19. Song, Y., et al. Activated hepatic stellate cells play pivotal roles in hepatocellular carcinoma cell chemoresistance and migration in multicellular tumor spheroids. Scientific Reports. 6, 36750(2016).
  20. Pingitore, P., et al. Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
  21. Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Scientific Reports. 8 (1), 14297(2018).
  22. Khawar, I. A., et al. Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
  23. Feaver, R. E., et al. Development of an in vitro human liver system for interrogating non-alcoholic steatohepatitis. Journal of Clinical Investigations Insight. 1 (20), 90954(2016).
  24. Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
  25. Chen, R., et al. Screening candidate metastasis-associated genes in three-dimensional HCC spheroids with different metastasis potential. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 7 (5), 2527-2535 (2014).
  26. Venkataraman, G., et al. Preferential self-association of basic fibroblast growth factor is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (2), 845-850 (1996).
  27. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Research. 59, 1757-1763 (1999).
  28. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  29. Delcommenne, M., Streuli, C. H. Control of integrin expression by extracellular matrix. Journal of Biological Chemistry. 270 (45), 26794-26801 (1995).
  30. Meshel, A. S., Wei, Q., Adelstein, R. S., Sheetz, M. P. Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts. Nature Cell Biology. 7 (2), 157-164 (2005).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
  33. Weiswald, L. B., et al. Newly characterised ex vivo colospheres as a three-dimensional colon cancer cell model of tumour aggressiveness. British Journal of Cancer. 101 (3), 473-482 (2009).
  34. Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6235-6240 (2011).
  35. Rajcevic, U., et al. Colorectal cancer derived organotypic spheroids maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture. Proteome Sciences. 12, 39(2014).
  36. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  37. Friedrich, J., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Experimental anti-tumor therapy in 3-D: spheroids--old hat or new challenge. International Journal of Radiation Biology. 83 (11-12), 849-871 (2007).
  38. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology & Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  39. Esparza-Baquer, A., et al. TREM-2 defends the liver against hepatocellular carcinoma through multifactorial protective mechanisms. Gut. 70 (7), 1345-1361 (2021).
  40. Dangles-Marie, V., et al. A three-dimensional tumor cell defect in activating autologous CTLs is associated with inefficient antigen presentation correlated with heat shock protein-70 down-regulation. Cancer Research. 63 (13), 3682-3687 (2003).
  41. Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumour angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
  42. Mayer, B., et al. Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas. Gastroenterology. 121 (4), 839-852 (2001).
  43. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54 (1), 142-151 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved