JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של צעדים כיצד להשתמש במערכת רב-תכליתית משולבת הניתנת לתכנות על-ידי המשתמש המאפשרת הדמיה רב-ערוצית אוטומטית וניתוח מכנוביולוגי כדי להבהיר את הרגישות המכנית של חלבון הקשור ל-Yes (YAP).

Abstract

הדמיה וניתוח רב-תכליתי לטווח ארוך של תאים חיים דורשים תיאום פונקציונלי יעיל של פלטפורמות חומרה ותוכנה שונות. עם זאת, שליטה ידנית של ציוד שונים המיוצר על ידי יצרנים שונים היא עבודה אינטנסיבית וגוזלת זמן רב, פוטנציאל הפחתת הדיוק, רבייה, ואיכות של נתונים שנרכשו. לכן, מערכת All-in-One וניתן לתכנות על-ידי המשתמש המאפשרת רכישת תמונה אוטומטית, רב-תכליתית וארוכת טווח ותואמת לרוב פלטפורמות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטיות יכולה להועיל לקהילה המדעית. מאמר זה מציג את פרוטוקולי ההפעלה המלאים של שימוש במערכת תוכנה משולבת חדשנית המורכבת מ- (1) תוכנה ביתית, שכותרתה "תוכנית אינטגרציה רב-תכליתית אוטומטית (AMFIP)," המאפשרת רכישה אוטומטית של הדמיה רב-ערוצית, ו-(2) חבילה של ניתוח הדמיה כמותית וחבילות חישוב המתיחה התאית.

מערכת משולבת זו מיושמת כדי לחשוף את הקשר שלא היה ידוע קודם לכן בין ההתפלגות המרחבית-זמנית של חלבון רגיש למכנו (YAP) לבין מכניקת התאים, כולל התפשטות תאים ומתיחה, בתאים רגילים אנושיים מהונדסים CRISPR/Cas9 (B2B) ותאי סרטן ריאות (PC9). מינוף היכולת של מערכת זו של שליטה רב ערוצית וקריאה, התוצאה מראה: (1) תאים רגילים B2B ותאי סרטן PC9 להראות קשר מובהק בין ביטוי YAP, המתיחה, ודינמיקה תא במהלך תהליכי הפצת תאים והעברה; ו-(2) תאי סרטן PC9 מיישמים כוחות פרי-גרעיניים בולטים על מצעים. לסיכום, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט על אופן השימוש במערכת משולבת הניתנת לתכנות על-ידי המשתמש המאפשרת הדמיה וניתוח רב-תכליתיים אוטומטיים כדי להבהיר את רגישות המכנית של YAP. כלים אלה פותחים את האפשרות לחקר מפורט של דינמיקת איתות רבת פנים בהקשר של פיזיולוגיה ופתולוגיה של תאים.

Introduction

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר הדמיה וניתוח רב-תכליתיים רב-תכליתיים אופטיים של תאים חיים. תוכנית הדמיה All-in-One המאפשרת תיאום אוטומטי של התקנים אופטואלקטרוניים רב-תכליתיים תפחית את הפעילות הידנית עתירת העבודה והנוטה לשגיאות והיא חיונית לחוקרים לביצוע הדמיה ארוכת טווח של תאים חיים 1,2,3,4. עם זאת, רוב התוכניות הציבוריות הקיימות בקהילת המחקר הביו-רפואי חלות רק על התקנים אופטואלקטרוניים מוגבלים או דורשות חומרה נוספת לתיאום ציוד שונה 5,6,7,8,9. לאחרונה פותחה תוכנית מבוססת קוד פתוח ותוכנה בשם "תוכנית אינטגרציה רב-תכליתית אוטומטית (AMFIP)," המאפשרת הדמיה רב-ערוצית וזמן לשגות. מבוסס על שפת Java וממשק תכנות היישומים (API) של μManager11,12, AMFIP פותח כתוסף ב- μManager המבצע סקריפטים מותאמים אישית של Java כדי להשיג תקשורת מבוססת תוכנה של פלטפורמות חומרה ותוכנה אופטואלקטרוניות מרובות, כולל אך לא מוגבל לאלה של ניקון. הקמת AMFIP פותחת את האפשרות לחקירה ניתנת לתכנות ורב תפקודית של התנהגויות תאים. מערכת ניסיונית וחישובית משולבת מפותחת בעיתון זה ומשלבת AMFIP עם ניתוח הדמיה דיגיטלית ומיקרוסקופיה של כוח משיכת התא. המערכת מאפשרת את ההבהרה של המכנוביולוגיה הייחודית של YAP בקווים של תאי B2B רגילים אנושיים (איור 1) וסרטן ריאות מסוג CRISPR/Cas9 וסרטן ריאות PC9 (איור 2). המערכת מספקת לקהילה המדעית פתרון מקיף המונע את הדרישה לרכישת מכשירי בקרה נוספים שייתכן שאינם זמינים ו/או תואמים לכל מערכת הדמיה.

הפרוטוקולים המוצגים במאמר זה מציגים כיצד (1) להחיל AMFIP כדי לבצע הדמיה אוטומטית לטווח ארוך עבור שני קווי תא מהונדסים CRISPR / Cas9 המבטאים את YAP המתויג mNEonGreen2; וכן (2) לשלב את פיג'י ImageJ, MATLAB ו-Origin לניתוח כמותי של יחס הגרעין/ציטופלסמה (N/C) של YAP בהתבסס על עוצמתם הפלואורסצנטית (איור 3 ואיור 4), שדה תזוזה תאית (איור 1C ואיור 2C) ושדה המתיחה התאית (איור 1D ואיור 2D ). התוצאות מצביעות על כך ש-(1) במהלך 10 השעות הראשונות של התפשטות התאים על המצעים בעלי קשיחות מכנית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית13,14,15,16,17,18, יחס YAP N/C של תאי B2B בודדים מראה וריאציה ותנודות תלויות זמן בולטות יותר בהשוואה לזו של תאי PC9 בודדים (איור 5 ואיור 6 ); ו-(2) תאי סרטן PC9 מייצרים אחיזה ניכרת באזורים הפרי-גרעיניים שלהם (איור 7). המערכת והמתודולוגיות המשולבות המתוארות בפרוטוקול זה מתעלה על סוגי התאים והמולקולות האופטוגנטיות הספציפיות. חוקרים יכולים ליישם את הפרוטוקולים כדי להתאים אישית את ניסויי החקירה הספציפיים שלהם בתא חי ולהבהיר דינמיקת איתות רבת פנים בהקשר של פיזיולוגיה של תאים ופתולוגיה.

Protocol

1. דור של קו תאים יציב לסרטן ריאות אנושי CRISPR/Cas9 (PC9) וקו תאי אפיתל של הסימפונות האנושיות (Beas2B) המבטאים באופן אנדוגני את חלבון YAP mNeonGreen21-10/11 מתויג

  1. בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את רצף ה- DNA קידוד הגדיל ה - 11 של חלבון פלואורסצנטיות, mNeonGreen2, באמצעות פולימראז DNA נאמנות גבוהה (ראה את טבלת החומרים).
  2. לדפוק על רצף ה- DNA המוגבר לתוך הלוקוס הגנומי YAP של קווי התא PC9 ו- B2B באמצעות מערכת עריכת הגנים CRISPR-Cas9.
    הערה: רצף DNA זה משלים גדילים 1-10 של mNeonGreen2 כדי לפלוט פלואורסצנטיות. מפת הרצף הגנומי של YAP-mNeonGreen21-10/11 מוצגת באיור S1 משלים. המפה מכילה את הרצפים הגנומיים, התורמים וה- mNeonGreen2 המסומנים.
  3. בדוק את הביטוי CRISPR/Cas9 מהונדס mNeonGreen2 באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות (ראה טבלת החומרים). מכיוון ש- mNeonGreen2 מתויג ל- YAP בכל פעם שהתאים מבטאים YAP בהקשר של רשת הרגולציה הגנטית המקורית שלו, בדוק את נוכחות עוצמת הפלואורסצנטיות בשני התאים המהונדסים CRISPR/Cas9 והשווה אותה לזו בתאי ההורים (בקרה).
    הערה: כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש (1) בלייזר 488 ננומטר (47.5 mW/mm2) להתרגשות, (2) מטרה של 40x (צמצם מספרי (NA) = 0.95) ומסנן פליטת פסים (ET525/50 ננומטר) למדידת פלואורסצנטיות, ו-(3) תוכנת ImageJ למדידת, לכמת ולהשוות את עוצמות הפלואורסצנטיות.
  4. אשר את השילוב הנכון של mNeonGreen211 על ידי חילוץ DNA גנומי מקווי התאים בעריכת CRISPR/Cas9; בצע PCR באמצעות פריימרים מאגפים את ההוספה הגנומית והרצף כדי לאשר את ההכנסה ב- loci19,20 הגנומי הנכון.
  5. הפל את mNeonGreen211 באמצעות מערכת עריכת הגנים CRISPR/Cas9, ובדוק את הפחתת עוצמת הפלואורסצנטיות בתאים באמצעות אותן מערכות מיקרוסקופ ופרמטרי הדמיה המתוארים בשלב 1.3.
    הערה: שלב זה מאשר את השילוב הנכון של mNeonGreen211 על ידי השוואה של עוצמות פלואורסצנטיות. התאים שהונדסו על-ידי CRISPR/Cas9 ללא הפלה ותאי הורים משמשים כפקד.
  6. לאסוף את התאים עם חלבון מתויג של עניין באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS).
    1. כדי להכין תאים למיון FACS, הקדישו אותם לשפוך אותם מחדש בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).
    2. לאסוף תאים עם פלואורסצנטיות mNeonGreen2 מעל רמת הרקע של קווי התא ההורי בשני סבבים מעשירים של מיון FACS.
      הערה: ציר הזמן ליצירת שורות התאים בעריכת CRISPR/Cas9 המתוארות כאן הוא בסדר גודל של 1-2 חודשים. כל קווי התאים נעשים זמינים לציבור על פי בקשה, כך שמעבדות מחקר אחרות יכולות לשחזר את התוצאות.

2. תחזוקה של תאי PC9 ו- B2B

  1. שמור על שני קווי התאים בחממות תרבית רקמות לחות עם 5% CO2 ב 37 °C (37 °F).
  2. תרבית 106 תאי PC9 ו- Beas2B מתויגים באופן אנדוגני בבקבוקונים בגודל 75 ס"מ2 עם 12 מ"ל של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין. תת-תרבות בשני קווי התאים כאשר מפגש התאים מגיע ל- ~ 80%.
  3. בדוק את שני קווי התא עבור mycoplasma כל 3 חודשים באמצעות ערכת זיהוי mycoplasma, בעקבות כל הפרוטוקולים המומלצים של היצרן בקפדנות.
  4. יש לאחסן את קווי התאים במקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C (60 °F).
  5. השתמש בקווי התא <20 קטעים מהפשרה עבור כל הניסויים.

3. התקנת סביבת חומרה ותוכנה

  1. הגדרת סביבת חומרה של הניסוי
    1. חבר את בקר הקונפוקל ואת המיקרוסקופ ההפוך למחשב (עיין בטבלת החומרים).
    2. התקן את פלטפורמת התוכנה (טבלת חומרים).
    3. הפעל את בקר הקונפוקלי ואת המיקרוסקופ ההפוך. הבא, להשיק אלמנטים.
    4. פתח את לוחות הבקרה של הקונפוקל, הלייזר והמיקרוסקופ ההפוך באלמנטים. לאחר מכן, בדוק אם שלושת הלוחות מתפקדים כראוי על ידי בדיקת התנועה של השלב הממונע, החלפת מטרות המיקרוסקופ והסריקה המרחבית של קווי הלייזר.
  2. כיוונון סביבת תוכנה של AMFIP
    1. התקן IntelliJ, ערכת פיתוח Java 14.0, μManager גירסה 2.0 גמא, ו Fiji ImageJ במחשב.
    2. פתח את פרויקט AMFIP שהורד מ- GitHub (קישור: https://github.com/njheadshotz/AMFIP) ב- IntelliJ.
    3. לחץ על הגדרות | | מהדר מעבדי ביאורים וסמן הפוך עיבוד ביאורים לזמין.
    4. לחץ על | מבנה פרוייקט חפצים ויצירת קובץ JAR. הגדר את ספריית הפלט כ - mmplugins תחת הספריה μManager .
    5. לחץ על מבנה פרוייקט | ספריות והוסף mmplugins ותוספים תחת הספריה μManager.
    6. לחץ על הוסף תצורה תחת התפריט הנפתח הפעלה וצור יישום.
    7. הזן ij. ImageJ לתוך הכיתה הראשית.
    8. הזן -Xmx3000m -Dforce.an ביאור.index=true לתוך אפשרות VM.
    9. הגדר את הספריה μManager לספריה 'עבודה'.
    10. לחץ על הפעל כדי להפעיל את μManager עם תוסף AMFIP.
  3. חבר את μManager עם המיקרוסקופ ההפוך.
    1. הוסף את מנהל ההתקן האדפטיבי של המיקרוסקופ ההפוך21 לספריה μManager .
    2. פתח μManager. לחץ על מכשירים | אשף קביעת תצורת החומרה וצור תצורה חדשה.
    3. הוסף את מנהל ההתקן Ti2 תחת התקנים זמינים.
    4. בחר את כל ההתקנים ההיקפיים ושמור את קובץ התצורה החדש.
    5. הפעל מחדש את μManager ובחר את קובץ התצורה בשלב 3.2.4 בתצורת האתחול של Micro-Manager.

4. הכנת ג'ל

  1. טפל בכיסוי הזכוכית עם 3-aminopropyltrymethoxysilane במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר (24 °C (24 °F).
  2. השתמש במים deionized (DI) כדי לשטוף את כיסוי הזכוכית ולייבש את כיסוי במשך 20 דקות ב 160 °C (60 °F).
  3. לטפל כיסוי הזכוכית עם 0.5% glutaraldehyde במשך 30 דקות ולשטוף עם מים DI.
  4. תערובת פתרון אקרילאמיד, N,N′-מתילביסאקרילמיד (bis) פתרון, וחרוזים פלואורסצנטיים תלויים ב 10 מ"מ HEPES-חוצץ תמיסת מלח. השתמש 10% (w / v) אמוניום פרסולפט פתרון N,N,N,N′,N′,N′-tetramethylethyldiamine (TEMED) כיוזמים של פילמור. שנה את האחוז של כל רכיב כדי להשיג את הנוקשות המכנית הרצויה של הידרוג'לים פוליאקרילאמיד (PAA) בעקבות פרוטוקולים שנקבעו שתוארו בעבר 13,14.
    הערה: בפרוטוקול זה, 2 kPa ג'ל: אקרילאמיד = 12.5% ו bis-אקרילאמיד = 6.5%; 5 kPa ג'ל: אקרילאמיד = 12.5% ו bis-אקרילאמיד = 21.5%; ו 40 kPa ג'ל: אקרילאמיד = 12.5% ו bis-אקרילאמיד = 31.5%. כל האחוזים המפורטים הם אחוזי נפח.
  5. לאחר 35 דקות, לקלף את כיסוי הזכוכית מן הידרוג'ל PAA מוצק לשטוף את הידרוג'ל עם 50 מ"מ HEPES-חוצץ מלוחים פעמיים (5 דקות בכל פעם).
  6. לטפל במשטח הידרוג'ל עם פתרון הידרזין לחות במשך 6 שעות.
  7. שוטפים את ההידרוג'ל בחומצה אצטית במשך 30 דקות. הסר את חומצה אצטית ולשטוף עם PBS במשך 30 דקות.
  8. לחמצן את פתרון פיברונקטין (50 מיקרוגרם / מ"ל ב- PBS) עם תקופת נתרן במשך 30 דקות.
  9. מצפים את משטח ההידרו-ג'ל בתמיסת הפיברונקטין המחומצנת וממתינים 35 דקות.
  10. הוסף PBS כדי לטבול את הידרוג'ל ולאחסן ב 4 °C (60 °F). מכסים את כל צלחות הפטרי המכילות את ההידרו-ג'לים בנייר אלומיניום כדי למנוע כל חשיפה קלה להידרו-ג'לים.

5. תרבות תאים

הערה: בצע תרבית תאים בטכניקה אספטית.

  1. קשרו את כיסויי הזכוכית עם הידרוג'לים PAA לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ כדי למנוע סחיפה פיזית של ג'לים במהלך תהליכי זריעת התא והדמיה.
    1. באמצעות פינצטה נקייה מעוקרת, הרימו את כיסוי הכיסוי (עם הידרוג'ל PAA למעלה) מצלחת הפטרי המכילה את הג'לים המוכנים.
    2. השתמשו בניגוב יבש לניקוי טיפות מים על המשטח התחתון של כיסוי הזכוכית.
    3. השתמש פינצטה מעוקרת להחזיק את כיסוי הזכוכית.
    4. מניחים טיפות קטנות (1-5 μL) של דבק ציאנואקרילט בשתי הפינות האלכסוניות על המשטח התחתון.
    5. השתמש מגבונים מעוקרים כדי להסיר דבק עודף.
    6. השתמשו בפינצטה המעוקרת כדי להחליף את כיסוי הכיסוי בצלחת הפטרי התחתונה מזכוכית. לחץ מעט על פינות כיסוי כדי להבטיח כי טיפות הדבק ליצור מגע מלא עם פני השטח של צלחת פטרי.
    7. מניחים את המכסה בחזרה על צלחת פטרי כדי למזער את האידוי של PBS הידרוג'לים PAA. המתינו 3 דקות כדי לאפשר לדבק להתמצק ולהתייבש בצלחת הפטרי.
    8. מלאו את צלחת הפטרי ב-4 מ"ל של PBS.
    9. חזור על השלבים לעיל 5.1.1-5.1.8 עבור דגימות הידרוג'ל PAA הנותרות בצלחות פטרי המשמשות להדמיה.
    10. השתמש 75% אתנול כדי לחטא את פני השטח החיצוניים של כל צלחות פטרי ולהעביר אותם לארון בטיחות ביולוגית תרבות הרקמות. הפעל את האור האולטרה סגול במשך 5 דקות וחטא את הדגימות.
  2. זרעו את התאים על פני השטח העליונים של הג'ל.
    1. כבה את האור האולטרה סגול. הוציאו את הבקבוקון (המכיל תאי B2B/PC9) מהחממה של 37 °C (37 °F) לארון הבטיחות הביולוגית. השתמשו בפיפטה המחוברת למשאבת ואקום כדי לשאוף את כל מדיום התרבות ולהוסיף 5 מ"ל של PBS כדי לשטוף את הבקבוקון.
    2. הוסף 2 מ"ל של 0.05% טריפסין כדי לנתק את התאים מתחתית הבקבוקון.
    3. מניחים את הבקבוקון באינקובטור. המתינו 5 דקות.
    4. מעבירים את הבקבוקון לארון הבטיחות הביולוגית. מוסיפים 8 מ"ל של מדיום תרבית טרייה לבקבוק ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להשעות את התאים בצורה הומוגנית.
    5. מעבירים את כל 10 מ"ל של מתלי התא לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות.
    6. בדוק את גלולה התא בתחתית הצינור. להטות לאט את הצינור אופקית ולהשתמש פיפטה שאפתנית כדי להסיר את כל מדיום התרבות מהצינור מבלי לגעת גלולה התא. לאחר מכן, מוסיפים 8 מ"ל של בינוני תרבות טרייה ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים עד שכל התאים מעורבבים הומוגנית עם המדיום.
    7. הפקד 100 μL של השעיית התא (150 תאים / μL) על משטח הג'ל ולחכות 5 דקות. לאחר מכן, לאט להוסיף 4 מ"ל של מדיום תרבות טרייה למנות פטרי; הימנעו מהוספת המדיום הטרי ישירות לג'ל.
    8. מניחים את צלחת הפטרי בחממה של 37 מעלות צלזיוס. המתן כדי לאפשר לתאים להתחבר למשטח הג'ל (B2B: 0.5-1 שעות; PC9: 4-5 שעות).

6. הדמיה תאית

הערה: AMFIP מאפשר הדמיה אוטומטית, רב-ערוצית וארוכת טווח על-ידי תיאום עם מערכות חומרה ותוכנה שונות: (1) AMFIP מתפעל את μManager כדי להעביר באופן אוטומטי את השלב הממונע של מיקרוסקופ Ti2-E לשדות ראייה מרובים (FOVs) ולרכוש תמונות שדה בהיר באמצעות מצלמה בשחור-לבן (טבלת חומרים); וכן (2) AMFIP מפעיל קבצי מאקרו מרובים בתוך Elements עם סקריפט Java מותאם אישית כדי לבצע פעולות אוטומטיות להדמיית z-stack קונפוקלית ומיתוג של ערוצי לייזר שונים (405 ננומטר ו- 488 ננומטר).

  1. הגדר את הסביבה להדמיה לטווח ארוך.
    1. הנח את תא הסביבה על הבמה הממונעת של המיקרוסקופ ההפוך. הגדר את קצב זרימת CO2 ל 160 מ"ל / דקה ולהתאים את הטמפרטורה של התא (העליון: 44 °C (למעלה: 44 °C (44 °F; אמבטיה: 42 °C (42 °F). לאחר מכן, להוסיף 40 מ"ל של מים מטוהרים לתוך האמבטיה של התא.
    2. מוציאים את צלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית עם תאים מהאינקובטור ומניחים אותה בתא הסביבה.
    3. הפעל את בקר הקונפוקלי ואת המיקרוסקופ ההפוך. החלף את נתיב האור ימינה וצפה בתאים המצורפים באמצעות μManager. אם מספיק תאים מחוברים לג'ל, מעבירים את צלחת הפטרי בחזרה לאינקובטור. אם לא מספיק תאים מחוברים לג'ל, להמשיך את הדגירה התא עוד 30 דקות עבור B2B ו 60 דקות עבור תאי PC9.
    4. חותכים שתי חתיכות קטנות של סרט הדבקה ומדביקים אותן על התא סביב החור המעגלי. לאחר מכן, להחיל דבק קטן על הסרט (רק על האזור כי צלחת פטרי יכסה).
    5. תוציא את צלחת הפטרי מהאינקובטור. לאחר מכן, לאט לאט למקם את צלחת פטרי בחדר ולתת את החלק התחתון של המנה ליצור קשר עם הדבק.
    6. לחץ על המכסה של צלחת פטרי במשך 1 דקות כדי לאפשר את הדבק ליצור מגע מלא עם צלחת פטרי ולהתמצק. לאחר מכן, בעדינות לדחוף את צלחת פטרי אופקית כדי לאשר כי צלחת פטרי הוא בלתי ניתן להסרה בתא.
    7. סגור את המכסה של התא.
  2. הגדר את פרמטרי רכישת התמונה עבור הדמיה בשדה בהיר.
    1. פתח את IntelliJ והגדר פרמטר T1 (לדוגמה, 120 s) בשורה 93 של הקובץ Elements_script.java. ודא שערך זה גדול יותר מזמן הריצה של המאקרו ברכיבים המשמשים להדמיה קונפוקלית של שדה תצוגה אחד (FOV). לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל את פרויקט AMFIP IntelliJ.
    2. לחץ על לחצן Acq חי ורב-ממדי בממשק הראשי של μManager. לאחר מכן, החלף את נתיב האור של המיקרוסקופ ההפוך ימינה להדמיית שדה בהיר, עבור למטרה 10x ופתח את אור הדיודה פולטת האור (LED) (מקור האור להדמיית שדה בהיר; עוצמה: 5%).
      1. לחץ על נתיב האור, מטרת המיקרוסקופ וכפתור מנורת LED בלוח Elements Ti2 או לחץ באופן ידני על הכפתורים המתאימים במיקרוסקופ.
    3. התאימו את ג'ויסטיק XY ואת הידית של מישור ה-Z כדי למצוא את המיקום הנכון ואת המישור הממוקד של הג'ל בצלחת הפטרי. השתמש במטרה 10x כדי למצוא את FOVs המתאים של תאים בודדים מרובים המחוברים ג'ל.
    4. סמן את התיבה מיקומים מרובים (XY) בחלון רכישה רב-ממדית . לחץ על ערוך רשימת מיקומים... לחצן וצפה בחלון רשימת מיקומי הבמה שמופיע. לאחר מכן, שנה את המטרה ל- 40x, הגדל את עוצמת נורית ה- LED ל- 15%, התאם מחדש את השלב הממונע של XY כדי לאתר את ה- FOVs, והקלט את הקואורדינטות על-ידי לחיצה על לחצן סמן בחלון רשימת מיקומי הבמה .
    5. הקלט 67 FOVs הרצויים. לחץ על לחצן שמירה בשם... בחלון רשימת מיקומי הבמה כדי להקליט את הקואורדינטות. קלט T1 (הפרמטר, לדוגמה, 120 s, המוגדר בשלב 6.2.1) למרווח הזמן של רכישת הדמיה ל - T1 במקטע נקודות זמן בחלון רכישה רב-ממדית .
  3. הגדר את רכישת התמונה עבור תמונות דו-ממדיות-YAP וחרוזים.
    1. פתח רכיבים, שנה את נתיב האור ימינה להדמיה קונפוקלית וכבה את נורית ה- LED. לאחר מכן, לחץ על לחצן הסר שילוב והפעל את ערוץ הלייזר FITC (להדמיית YAP) על-ידי סימון תיבת FITC .
    2. התאם את מהירות הסריקה למסגרת אחת לכל 2 שניות על-ידי לחיצה על לחצן 1/2 וסובב את הידית של מישור Z כדי למצוא את מיקום ה- Z של התאים המצורפים במהירות. הקלט את הגבולות התחתונים והעליונים עבור מחסנית Z.
    3. לחץ על מאקרו ברצועת הכלים העליונה, בחר עורך מאקרו תחת התפריט הנפתח מאקרו והזן את הערכים משלב 6.3.2 לקובץ מאקרו.
    4. הפעל את ערוץ הלייזר 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (להדמיית חרוזים) על ידי בדיקת תיבת DAPI כדי למצוא ולתעד את מיקום Z הממוקד של חרוזים. עבור אל עורך המאקרו והזן את הערכים המוקלטים בקובץ המאקרו.
  4. הגדר את המשימה של הזזת השלב הממונע באמצעות AMFIP.
    1. עבור אל μManager ולחץ על תוספים | אוטומציה לפתיחת ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של AMFIP. לחץ על הוסף נקודה או הסר לחצני נקודה כדי להשיג את המספר המדויק של FOVs שנבחרו. הזן את הקואורדינטות המוקלטות של FOVs ללוח הקואורדינטות.
    2. הגדר את זמן הניסוי הכולל בשדה הטקסט סה"כ זמן ניסוי .
    3. לחץ על לחצן תצורת זמן נוסף והגדר את מרווח הזמן T2 (למשל, 30 דקות) של העברת השלב הממונע לכל FOV.
    4. הגדל את גודל החלון של רכיבים וגרור את ממשק המשתמש הגרפי של AMFIP לצד ימין של המסך כדי למנוע ממשק המשתמש הגרפי שיפריע לפעולות האוטומטיות של הסמן.
    5. לחץ על לחצן הזן . לאחר סיום המאקרו הראשון, לחץ על לחצן רכישה! בחלון רכישה רב-ממדית .
  5. המיס את התאים לאחר רכישת התמונה.
    1. לאחר סיום ההדמיה ארוכת הטווח, הפסק את משימת AMFIP על-ידי לחיצה על לחצן השהה בחלון תוסף האוטומציה ועל לחצן עצור בחלון הרכישה הרב-ממדית .
    2. פתח רכיבים והגדר הדמיה של מחסנית Z על-ידי לחיצה על הלחצנים עליונים ותחתונים בחלון רכישת ND (הגדר את טווח Z כגדול מטווח Z של החרוזים). החלף את נתיב האור ימינה ופתח את נורית ה- LED (עוצמה: 15%).
    3. מסירים באיטיות ובזהירות את מכסי התא ואת צלחת הפטרי. בינתיים, לפקח על תצוגת השדה הבהיר עבור כל סחיפה של FOV.
    4. באמצעות פיפטה מפלסטיק כדי לקחת 0.5 מ"ל של פתרון נתרן דודציל סולפט (SDS), להחזיק בזהירות את פיפטת הפלסטיק קצת מעל המדיום התרבותי בצלחת פטרי ולהוסיף 1-2 טיפות של פתרון SDS למדיום התרבות.
    5. לאחר שהתאים בתצוגת השדה הבהיר מתמוססים, החליפו את נתיב האור שמאלה, סגרו את נורית ה-LED, לחצו על הלחצן הסר שילוב .
    6. תריץ את ההדמיה של מחסנית הזי. שמור את מחסנית התמונה ותן לה שם Reference_N (N הוא מספר הרצף של כל FOV).
    7. לחץ על לחצן מיקומים מרובים (XY) בחלון הרכישה הרב-ממדית . לאחר מכן, בחר את ה- FOV הבא ולחץ על לחצן עבור אל כדי להזיז את השלב הממונע ל- FOV השני.
    8. חזור על שלב 6.5.7 עבור כל FOV.

7. מדידת יחס ה-YAP N/C

  1. בצע ניתוח תמונה כדי למדוד את יחס ה-YAP N/C באמצעות תוכנת Fiji ImageJ (איור 4).
    1. פתח את פיג'י ImageJ. יבא את מחסנית התמונות של השדה הבהיר עבור כל ה- FOVs שנרכשו על-ידי μManager.
    2. פתחו את התפריט הנפתח 'תמונה' ובחרו 'ערימות' | כלים | שומר הפרוסות. לאחר מכן, יצא את מחסנית התמונות של השדה הבהיר עבור כל FOV.
    3. יבא את תמונת הפלואורסצנטיות של ערוץ FITC וכיסה אותה בתמונת השדה הבהיר עבור אותו FOV. לשם כך, בחרו בתמונה הפלואורסצנטית ובחרו 'שכבת-על' | הוספת תמונה... (תמונה להוספה: תמונת השדה הבהיר; מיקום X ו- Y תלוי בגודל תמונת השדה הבהיר שנרכשה על ידי מצלמות שונות; אטימות: 60-70).
    4. פתח את התפריט הנפתח ניתוח ובחר הגדר מדידות... בחר אזור; צפיפות משולבת וערך אפור ממוצע.
    5. לחץ על כפתור הבחירות ביד חופשית בממשק הראשי של ImageJ.
    6. צייר את קווי המתאר של גוף התא ואת הגרעין הרצוי. לאחר מכן, לחץ על נתח | מדוד או לחץ על לחצן M בלוח המקשים.
    7. שים לב לחלון התוצאות שמופיע. שים לב שהערכים תחת העמודה אזור מייצגים את האזור שנבחר (μm2) והערכים תחת העמודה IntDen מייצגים את עוצמת הפלואורסצנטיות של האזור שנבחר.
    8. חשב את יחס YAP N/C באמצעות הנוסחה הבאה (1), (2) ו- (3):
      figure-protocol-18160 (1)
      figure-protocol-18251 (2)
      figure-protocol-18342 (3)
      כאשר Inuc ו- Icel מייצגים את העוצמה היחסית של הגרעין וגוף התא, ו Anuc ו Acel מייצגים את האזור של הגרעין ואת גוף התא. R הוא יחס ה- YAP N/C.
    9. שמור את קווי המתאר לחישוב עתידי של כוח משיכת דיפול ועקירת פרי-תא/פרי-גרעינית. לשם כך, לחץ על נתח | כלים | שמירת קואורדינטות XY...

8. מדידת שדה גרירה

  1. יש למרוח מיקרוסקופיה בכוח משיכה באמצעות תוספים של פיג'י ImageJ22,23.
    1. פתח את פיג'י ImageJ.
    2. יבא את ערימת התמונות של חרוזים עבור FOV.
    3. בחר את הפרוסה המציגה את ההתפלגות הברורה ביותר של חרוזים וחלץ אותה על-ידי לחיצה על תמונות | ערימות | כלים | שומר הפרוסות.
    4. יבא את ערימת התמונות של ההפניה עבור אותו FOV.
    5. בחרו בפרוסה עם בהירות וניגודיות זהות לזו של הפרוסה בשלב 8.1.3. לאחר מכן, לחלץ אותו כתמונת ייחוס.
    6. בחירת תמונות | ערימות | כלים | שרשור כדי לשלב את שתי הפרוסות משלבים 8.1.3 ו 8.1.5 (בחר את תמונת ההפניה כפרוסה הראשונה).
    7. בחר תוספים | | התאמת תבנית יישור פרוסות בערימה או בתוספים | מייצב תמונה ליישור שתי הפרוסות.
    8. בחירת תמונה | ערימות | הערם לתמונות. לאחר מכן, בחר | תמונה | טבלאות בדיקת מידע ירוק להמרת צבע הפרוסה הראשונה לירוק ובחרו 'תמונה' | | טבלאות בדיקת מידע אדום להמרת צבע הפרוסה השנייה לאדום.
    9. בחירת | תמונה צבע | מזג ערוצים כדי למזג את שתי התמונות.
    10. חפפו את התמונה עם תמונת השדה הבהיר מאותו FOV והשתמשו בתמונה חופפת זו כדי לצפות בהעתקת חרוזים.
    11. בחר תוספים | | PIV PIV איטרטיבי (בסיסי).... הגדר את גודל חלון החקירה ל- 128/256; 64/128; 32/64 (לפחות ארבעה חרוזים לכל חלון חקירה). הגדר את סף המתאם ל- 0.6.
    12. לחץ על אישור. לאחר סיום החישוב, שמור את קובץ הטקסט עם הנתונים הגולמיים של תזוזת חרוזים בתיקיה רגילה שנוצרה על-ידי המשתמש.
    13. בחר תוספים | | FTTC FTTC ובחר את קובץ הטקסט בשלב 8.1.9.
    14. הזן את גודל הפיקסלים (מיקרומטר), את המודולוס של הג'ל של יאנג (פסקל), ואת רוחב העלילה והגובה בהתבסס על הניסוי ועל התמונה של חרוזים.
    15. לחץ על אישור כדי לשמור באופן אוטומטי את קובץ הטקסט המכיל את הנתונים הגולמיים של כוח המתיחה באותה ספריה כמו קובץ הטקסט בשלב 8.1.12.
  2. השתמשו בתוכנת גרפים (טבלת חומרים) כדי להתוות את שדה המתיחה באותו קנה מידה עבור תאים מרובים (איור 1B, C ואיור 2B, C).
    1. הוסף את קובץ הטקסט המכיל את הנתונים הגולמיים של המתיחה לגיליון אלקטרוני.
    2. צור גיליון חדש, הזן את קואורדינטות Y של המתיחה לשורה הראשונה (סדר מערכים גבוהים לערכים נמוכים) ואת קואורדינטות X לעמודה הראשונה (סדר מנמוך לגבוה).
    3. הזן את ערך המתיחה לכל קואורדינטות מהנתונים הגולמיים.
    4. שמור את הגיליון בשלב 8.2.2 כקובץ *.csv.
    5. מקור פתוח.
    6. לחץ על | קובץ פתח וייבא את הקובץ *.csv בשלב 8.2.4. בחר את כל התאים ולחץ על התווה | מתאר| מיתאר - מילוי צבע.
    7. בחלון התוויה: התוויית תוויות , בחר Y על-פני העמודות כדי להגדיר באופן אוטומטי את ערכי ה- Y לשורה הראשונה וערכי X לעמודה הראשונה. לאחר מכן, תן שם לכותרת ולחץ על אישור.
    8. בחלון הגרף שקופץ, לחץ פעמיים על מפת החום.
    9. לחץ על רמות בחלון מפת צבע/קווי מתאר . לאחר מכן, שנה את רמת קנה המידה לטווח סביר (0300 בניתוח זה) ולחץ על אישור.
    10. לחץ על קווים, בטל את הסימון הצג ברמות ראשיות בלבד וסמן את הסתר הכל. לאחר מכן, לחץ על אישור.
    11. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התרשים ובחר ייצוא גרפים.... שמור את התמונה בנתיב שצוין.
  3. השתמש MATLAB כדי לחשב את המתיחה תא דיפול.
    1. שמור את קובץ טקסט הנתונים הגולמי המתיחה (משלב 8.1.12) ואת קובץ הקואורדינטות של אזור גבול התא (ROI) (משלב 7.1.9) באותה תיקיה המוגדרת בשלב 8.1.12. העבר את כל קבצי MATLAB הנמצאים במקום בחבילת AMFIP לתיקיה זו.
    2. פתח את מטלב. פתח את התיקיה המוגדרת בשלב 8.1.12 ופתח את קובץ פונקציית חישוב המתיחה של דיפול .m שהועבר לתיקיה זו בשלב 8.3.1.
    3. קרא את שני קבצי הטקסט/csv בשלב 8.3.1 לתוך מרחב העבודה של MATLAB והקצה מטריצה לשני משתנים (לדוגמה, מתיחה ורוי).
    4. הפעל את absdiple פונקציה (המתיחה, רועי).
      הערה: העמודה הראשונה של הפלט היא כוח המתיחה דיפול ב nN (ננו-ניוטון). העמודה השנייה של הפלט היא הזווית של כוח המתיחה של הדיפול ביחס לציר האופקי.

תוצאות

התפלגות ודינמיקה ייחודיות של YAP בסרטן PC9 מהונדס CRISPR/Cas9 ובתאים רגילים מסוג B2B במהלך התפשטות תאים
תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של הפצת YAP בתאי B2B ו-PC9 בודדים על ג'לים PAA של 2, 5, 40 kPa וכיסוי זכוכית מוצגים באיור 1A ובאיור 2A. הלוקליזציה הגרעינית של YAP בתאי B2B גדלה עם נוקשות מצע גוברת (איור 1A), בעוד שתאי PC9 הראו ריכוז YAP דומה בגרעין ובציטופלסמה על מצעים בעלי קשיחות משתנה (איור 2A). תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של התפלגות YAP בתאי B2B ו-PC9 בודדים, מתפשטות במצע ההידרו-ג'ל של 5 kPa (מה-0 עד ה-10 שעות לאחר שהתאים המחוברים למצעים) מוצגות באיור 1B ובאיור 2B, בהתאמה. תא ה-B2B הגדיל באופן מונוטוני את אזור ההתפשטות לאורך זמן יחד עם ירידה ביחס YAP N/C (איור 1B), בעוד שתא ה-PC9 שמר על אזור התפשטות תאים, כיוון ויחס YAP N/C יחסית לאורך כל תהליך ההתפשטות של 10 שעות (איור 2B). במהלך 10 שעות של התפשטות מוקדמת, תא B2B הייצוגי עיוות את משטח המצע והחיל את המתיחה של התא המתפתח בזמן על פני כל אזור התא (איור 1C ואיור 1D).

לעומת זאת, תא ה-PC9 הייצוגי פיתח תזוזה ומתיחה רק בשני קצותיו של גוף התא ומתיחה, ומתיחה שלו פחתה לאחר 7.5 שעות (איור 2C ואיור 2D). תמונות נוספות של תאי B2B ו-PC9 בשלב ההתפשטות המוקדמת מסופקות באיור S2 ובאיור S3 המשלים. כמו כן נצפו מצבים אחרים של דינמיקת תאי PC9 (איור 6). במקביל למאפייני התפשטות שונים אלה, תאי B2B ו-PC9 הראו התפלגות ודינמיקה ברורות של YAP (איור 3). על ג'ל 5 kPa, YAP בתאי B2B התרכז בגרעין בשעה 0 והפך הומוגני יותר מופץ על פני גוף התא בשעה 10. עם זאת, תאי PC9 הראו התפלגות הומוגנית יותר של YAP בגרעין ובציטופלסמה לאורך כל 10 השעות של תהליך ההתפשטות. כדי לנתח באופן כמותי את פעילות ה-YAP ואת הטרנסלוקציה בתאי B2B ו-PC9, יחס ה-YAP N/C חושב באמצעות האלגוריתם המתואר באיור 4.

כדי להמשיך ולחקור את הדינמיקה הייחודית של YAP, הושוו שינויים זמניים ביחס YAP N/C, באזור התא/גרעין ובמתיחה של תאי B2B בודדים מרובים (n = 10) ותאי PC9 (n = 5) (איור 5). נמצא כי יחס YAP N/C הממוצע של תאי B2B ירד מ 2.54 ± 0.22 ל 1.79 ± 0.21 (n = 10; p = 0.0022 **; איור 5A), בעוד שיחס YAP N/C הממוצע של תאי PC9 השתנה מ- 1.92 ± 0.26 ל- 1.57 ± 0.07 (n = 5; p = 0.187 (לא משמעותי (ns)); איור 5א). המתיחה הדיפול הממוצעת של תאי B2B השתנתה מ 256.17 ± 123.69 nN ל 287.44 ± 99.79 nN (p = 0.7593 (ns); איור 5ב). המתיחה הדיפול הממוצעת של תאי PC9 השתנתה מ 141.19 ± 33.62 nN ל 168.52 ± 73.01 nN (p = 0.7137 (ns); איור 5ב). שטח התפשטות התא הממוצע של תאי B2B גדל מ 613.89 ± 102.43 מיקרומטר2 ל 942.51 ± 226.71 מיקרומטר2 (p = 0.0512 (ns); איור 5C).

אזור התפשטות התא הממוצע של תאי PC9 השתנה מ 495.78 ± 97.04 מיקרומטר2 ל 563.95 ± 89.92 מיקרומטר2 (p = 0.5804 (ns); איור 5C). שטח התפשטות הגרעין הממוצע של תאי B2B גדל מ 181.55 ± 36.18 מיקרומטר2 ל 239.38 ± 43.12 מיקרומטר2 (p = 0.1217 (ns); איור 5D) ואזור התפשטות הגרעין הממוצע של תאי PC9 השתנה מ 133.31 ± 30.05 מיקרומטר2 ל 151.93 ± 22.49 מיקרומטר2 (p = 0.5944 (ns); איור 5D). תוצאות אלה מצביעות על כך ש-(1) תאי B2B מציגים יחס YAP N/C התלוי במצע-נוקשות; (2) המתיחה של תאי B2B גבוהה מזו של תאי PC9; ו-(3) בניגוד לתאי B2B, תאי PC9 מראים עלייה מוגבלת באזור התא ושינויים ביחס YAP N/C במהלך תהליך ההתפשטות של 10 שעות.

מתאם של הפצה ודינמיקה של YAP למצבי ההעברה של תאי B2B
יחס YAP N/C ומתיחה דיפול של כל B2B (n = 10) ו PC9 (n = 5) כפונקציה של אזור התפשטות התא ואזור התפשטות הגרעין הושוו. יחס ה-YAP N/C ומתיחה דיפול של תאי PC9 לא תאמו בבירור עם טווחי התאים הקטנים והתפשטות הגרעין שלהם (איור 6). לעומת זאת, נראה כי יחס ה-YAP N/C ומתיחה דיפול של תאי B2B עקבו אחר שתי מגמות שונות (איור 6A ואיור 6C), דבר המצביע על כך שייתכן שיש שתי קבוצות של תאי B2B הקיימות בניסוי זה. בקבוצה הראשונה, יחס ה-YAP N/C ומתיחה דיפול גדלים יחד עם הגדלת אזור התפשטות התא ומגיעים למקסימום שלהם ב- ~ 1000 מיקרומטר2 (איור 6C ואיור 6D, המצוין על ידי הקו המקווקו הצהוב). בקבוצה השנייה, יחס ה-YAP N/C ומתיחה דיפול גדלים בקצב איטי יותר עם הגדלת אזור התפשטות התא ושומרים על ערכים כמעט קבועים כאשר אזור התפשטות התא ממשיך לגדול (איור 6C,D, המצוין על ידי הקו המקווקו הירוק).

תאי סרטן PC9 מייצרים מתיחה באזורים פרי-גרעיניים
תאי PC9 יחידים ומתפשטים עוקרים את המצעים באזורים הפרי-גרעיניים, החל מהשערה השישית של התרבות (איור 7C). כדי לדמיין את התזוזה הפרי-גרעינית הנגרמת על ידי משיכת תאים, חפפנו את התמונות של חרוזים פלואורסצנטיים שנלקחו לפני (אדום) ואחרי (ירוק) הסרת התאים מהמצעים (עיין בסעיף הפרוטוקול לקבלת פרטים). החרוזים שאין להם תזוזה יופיעו צהובים בתמונות החופפות, כלומר, תוספת של צבעים אדומים וירוקים. לעומת זאת, החרוזים שנעקרו ממצבי המנוחה שלהם עקב אחיזת התא יראו צבעים ירוקים ואדומים מופרדים.

ראוי לציין כי הן בתאי PC9 (איור 7C,D) והן בתאי B2B (איור 7E), נצפתה תזוזת חרוזים בציטופלסמה ובתוך הגרעין, בנוסף לאלו שבגבול התא. כדי להדגיש את ההעתקה הפרי-גרעינית, משוואת בוסינסק מתיאוריית האלסטיות הליניארית משמשת לחיזוי ההעתק התיאורטי הדו-ממדי שנוצר על ידי כוח דיפול היפותטי בגבול התא (קו מקווקו שחור באיור 7B)24. בהשוואה לעקומה תיאורטית זו עם תזוזת המצע האמיתית הנמדדת לאורך אותו ציר (קו מקווקו לבן באיור 7D), נמצא כי ההעתקים האמיתיים בתוך הגרעין גדולים פי 1.5-8 מהערך התיאורטי (איור 7B), המעיד על קיומו של כוח משיכה באזורי הפרי-גרעיניים.

figure-results-6494
איור 1: שינויים בביטוי/הפצה של YAP, בשדה תזוזת מצע ובשדה המתיחה של תא רגיל B2B על מצעים בעלי קשיחות משתנה ובמהלך התפשטות מוקדמת. (A) ביטוי YAP של תא B2B שנזרע על ג'לים PAA של 2, 5 ו- 40 kPa וכיסוי זכוכית לאחר 60 שעות מקובץ מצורף ראשוני של מצע התא. (B) תא B2B נזרע על ג'ל PAA של 5 kPa ותמונה מעל 10 שעות לאחר התקשרות ראשונית של מצע התא. ביטוי YAP מיוצג על-ידי עוצמת פלואורסצנטיות ירוקה. הערה: עוצמת YAP בתוך הגרעין פוחתת בהדרגה אך נשארת גבוהה יותר מזו שבציטופלסמה לאורך זמן. סרגלי הצבע מציינים את הרמות של ביטוי YAP (ירוק = ביטוי גבוה; שחור = ביטוי נמוך) ב - (A) ו- (B). (C) עיוות מצע (חופף לתמונת השדה הבהיר) במיקום התא מיוצג על-ידי שדה ההעתקה בכל נקודת זמן. כיוון וגודל ההזזה מוצגים על-ידי כיוון החץ והצבע, בהתאמה. ההעתק גדל בקצות גוף התא B2B ככל שאזור התפשטות התא גדל. סרגל הצבע מציין את גודל ההעתקה (ארגמן = סדר גודל גבוה; שחור = סדר גודל נמוך). (D) שדה המתיחה (חופף לתמונת השדה הבהיר) המחושב משדה ההזזה. המתיחה מתרכזת בגבול של תאי B2B. קווי המתאר המנוקדים הלבנים והצהובים מתארים את גבולות התא והגרעין, בהתאמה. סרגל הצבע מציין את גודל המתיחה (ארגמן = סדר גודל גבוה; שחור = סדר גודל נמוך). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: YAP = חלבון הקשור ל-yes; PAA = פוליאקרילמיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8106
איור 2: שינויים בביטוי/הפצה של YAP, בשדה תזוזת המצע ובשדה המתיחה של תא סרטן PC9 על מצעים בעלי קשיחות משתנה ובמהלך התפשטות מוקדמת. (A) ביטוי YAP של תא PC9 שנזרע על 2, 5, ו 40 kPa PAA ג'לים כיסוי זכוכית לאחר 65 שעות מקובץ מצורף מצע התא הראשוני. (B) תא PC9 נזרע על ג'ל PAA של 5 kPa ותמונה מעל 10 שעות לאחר התקשרות ראשונית של מצע התא. ביטוי YAP מיוצג על-ידי עוצמת פלואורסצנטיות ירוקה. הערה: רמות עוצמת YAP מ 1.5 שעות ואילך. סרגלי הצבע מציינים את הרמות של ביטוי YAP (ירוק = ביטוי גבוה; שחור = ביטוי נמוך) ב - (A) ו - (B) (B) (ג) עיוות מצע (חופף לתמונת השדה הבהיר) במיקום התא מיוצג על-ידי שדה תזוזת חרוזים פלואורסצנטי בכל נקודת זמן. כיוון וגודל ההזזה מוצגים על-ידי כיוון החץ והצבע, בהתאמה. שדה ההעתקה הנגרם על-ידי תאי PC9 קטן מזה שנגרם על-ידי תא B2B. לאורך כל תהליך ההתפשטות של 10 שעות, האזור של תאי PC9 נשאר כמעט קבוע. סרגל הצבע מציין את גודל ההעתקה (ארגמן = סדר גודל גבוה; שחור = סדר גודל נמוך). (D) שדה המתיחה (חופף לתמונת השדה הבהיר) המחושב משדה תזוזה. המתיחה שנוצרה על ידי תא PC9 מייצג זה פוחתת בהדרגה מן 6 h ל 10 h . קווי המתאר המנוקדים הלבנים והצהובים מתארים את גבולות התא והגרעין, בהתאמה. סרגל הצבע מציין את גודל המתיחה (ארגמן = סדר גודל גבוה; שחור = סדר גודל נמוך). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: YAP = חלבון הקשור ל-yes; PAA = פוליאקרילמיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9818
איור 3: התפלגות YAP בתאי B2B ו-PC9 בשלב ההתפשטות המוקדם. (A) עוצמת YAP של תא B2B נמדדת לאורך הציר האדום שהוקצה ב- 0 ו- 10 h. (B) בשעה ה - 0, עוצמת YAP מראה הבדלי ריכוז דרמטיים בין הגרעין לבין הציטופלסמה. בשעה העשירית , עוצמת YAP הופכת להומוגנית יותר בכל גוף התא. (ג) עוצמת YAP של תא PC9 נמדדת לאורך הציר הכחול שהוקצה ב- 0 ו- 10 h. (D) בשעה ה - 0, עוצמת YAP בגרעין מופיעה גבוהה יותר מזו שבציטופלסמה, אם כי ההבדל אינו יוצא דופן כמו זה בתאי B2B. בשעה העשירית , עוצמת YAP בגרעין עדיין נראית מעט גבוהה יותר מזו שבציטופלסמה, עם מגמת וריאציה דומה לזו בשעה 0. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר (A, C). קיצור: YAP = חלבון הקשור כן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10955
איור 4: מדידת יחס ה-YAP N/C. (1) החל את Fiji ImageJ כדי לצייר את קווי המתאר של הגרעין ולמדוד את האזור המוקרן הדו-ממדי שלו Anuc. (2) מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך הגרעין Inuc. (3) צייר את קווי המתאר של גוף התא ומדוד את האזור המוקרן שלו Acel. (4) מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך Icel התא. (5) חשב את צפיפות גרעין YAP Dnuc, צפיפות ציטופלסמה YAP Dcyto, ואת היחס שלהם R: Dnuc = Inuc / Anuc; Dcyto =(Icel-Inuc)/(Acel-Anuc); R = Dnuc / Dcyto. סרגל הצבע מציין את רמות ביטוי YAP (ירוק = ביטוי גבוה; שחור = ביטוי נמוך). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: YAP = חלבון הקשור ל-yes; N = גרעין; C = ציטופלסמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-12233
איור 5: ביטוי YAP מובהק, מורפולוגיה של תאים/גרעין ומתיחה תאית בסרטן PC9 ובתאים רגילים מסוג B2B במהלך התפשטות התאים. (A) שינוי ביחס YAP N/C במהלך 10 השעות הראשונות של התפשטות תא בודד. יחס YAP N/C הממוצע של תאי B2B (עמודה אדומה; n = 10) השתנה מ- 2.54 ± 0.22 ל- 1.79 ± 0.21 (n = 10; p = 0.0022**) בעוד שיחס YAP N/C הממוצע של תאי PC9 (עמודה כחולה; n = 5) השתנה מ- 1.92 ± 0.26 ל- 1.57 ± 0.07 (p = 0.187 (ns)). (ב) המתיחה הממוצעת של הדיפול כפונקציה של הזמן. המתיחה הדיפול הממוצעת של תאי B2B השתנתה מ 256.17 ± 123.69 nN ל 287.44 ± 99.79 nN (p = 0.7593 (ns)) ואת המתיחה הדיפול הממוצע של תאי PC9 השתנה מ 141.19 ± 33.62 nN ל 168.52 ± 73.01 nN (p = 0.7137 (ns)). (ג) אזור התא הממוצע כפונקציה של זמן. אזור התפשטות התא הממוצע של תאי B2B גדל מ 613.89 ± 102.43 מיקרומטר2 ל 942.51 ± 226.71 מיקרומטר2 (p = 0.0512 (ns)) ואת שטח התפשטות התא הממוצע של תאי PC9 השתנה מ 495.78 ± 97.04 μm2 ל 563.95 ± 89.92 מיקרומטר2 (p = 0.5804 (ns)). (D) אזור הגרעין הממוצע כפונקציה של זמן. שטח התפשטות הגרעין הממוצע של תאי B2B גדל מ 181.55 ± 36.18 מיקרומטר2 ל 239.38 ± 43.12 מיקרומטר2 (p = 0.1217 (ns)) ואת שטח התפשטות הגרעין הממוצע של תאי PC9 השתנה מ 133.31 ± 30.05 μm2 ל 151.93 ± 22.49 μm2 (p = 0.5944 (ns)). קיצורים: YAP = חלבון הקשור ל-yes; N = גרעין; C = ציטופלסמה; ns = לא משמעותי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-13975
איור 6: יחס YAP N/C וכוח משיכת דיפול כפונקציה של אזור התפשטות התא והגרעין. יחס YAP N/C ומתיחה דיפול של תאי B2B (n = 10) ותאי PC9 (n = 5) מחושבים מ- 6th h עד 10 h לאחר הצמדה למצע. (A) יחס YAP N/C כפונקציה של אזור התפשטות התא. יחסי YAP N/C של תאי B2B משתנים בין 1.16 ל- 2.53, בעוד שיחסי YAP N/C של תאי PC9 משתנים בין 1.27 ל- 1.88. אזור התפשטות התא של תאי B2B משתנה בין 391.94 מיקרומטר2 ל 1986.40 מיקרומטר2. אזור התפשטות התא של תאי PC9 נע בין 284.46 מיקרומטר2 ל 830.12 מיקרומטר2. (B) יחס YAP N/C כפונקציה של אזור התפשטות הגרעין. אזור התפשטות הגרעין של תאי B2B משתנה בין 107.09 מיקרומטר2 ל 514.28 מיקרומטר2. אזור התפשטות הגרעין של תאי PC9 נע בין 58.03 מיקרומטר2 ל 259.65 מיקרומטר2. דיפול המתיחה של תאי B2B כפונקציה של אזור התפשטות התא (C) ואזור התפשטות הגרעין (D). תאי B2B מתפשטים ולא נודדים מראים אחיזה גבוהה יותר (מ- 47.50 nN ל- 1051.48 nN) עם אזור תא וגרעין תחתון. בעת התפשטות ונדידה, תאי B2B מראים אחיזה נמוכה יותר (מ- 105.80 nN ל- 310.28 nN) עם טווחים גדולים יותר של שטח התא והגרעין. קיצורים: YAP = חלבון הקשור ל-yes; N = גרעין; C = ציטופלסמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-15532
איור 7: עקירה פרי-גרעינית בתאי B2B וסרטן רגילים מסוג PC9. (A) דיאגרמת תצוגה צדדית סכמטית של תזוזת פרי-גרעינית ותאי פרי הנמדדת מהעתקת חרוזים במצע. (B) תזוזת מצע מתחת לתא PC9 נמדדת לאורך ציר התא (קו מקווקו לבן ב - 7D). ההעתק התיאורטי שנוצר על ידי כוח הדיפול בגבול התא מוצג על ידי משוואת Boussinesq (עקומה מקווקו שחורה). (C) ו-(D) תמונות חרוזים פלואורסצנטיות חופפות עם תאים (אדומים) וללא תאים (ירוקים) עבור תאי PC9 בשעה השישית לאחר ההצמדה (תצוגה עליונה). חרוזי צהוב (חפיפה מדויקת של צבעים אדומים וירוקים) אינם מצביעים על תזוזה. החרוזים הירוקים והאדומים המופרדים (מחודדים על ידי חצים צהובים) מייצגים את עקירת הפרי-גרעינית. חצים צהובים מצביעים על כתמי פרי-גרעין מכווצים אלה הממוקמים בפריפריה של הגרעין. (ה) עקירה פרי-גרעינית שנוצרה על-ידי תא B2B במהירות של 1.5 שעות לאחר התקשרות עם מצע התא. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר (C-E). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור S1 משלים: מפת הרצף הגנומי של YAP-mNeonGreen21-10/11. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S2 משלים: שינויים בביטוי/הפצה של YAP, בשדה תזוזת המצע ובשדה המתיחה של תאים רגילים מסוג B2B במהלך התפשטות מוקדמת. (A, D, G, J, M) תא B2B נזרע על ג'ל PAA 5 kPa ותמונה מעל 10 שעות לאחר הקובץ המצורף הראשוני של מצע התא. ביטוי YAP מיוצג על-ידי עוצמת פלואורסצנטיות ירוקה. הערה: עוצמת YAP בתוך הגרעין פוחתת בהדרגה אך נשארת גבוהה יותר מאשר בציטופלסמה לאורך זמן. סרגלי הצבע מציינים את רמות ביטוי YAP (ירוק = ביטוי גבוה; שחור = ביטוי נמוך) ב -(A, D, G, J, M). (B, E, H, K, N) עיוות מצע (חופף לתמונת השדה הבהיר) במיקום התא מיוצג על-ידי שדה ההעתקה בכל נקודת זמן. כיוון וגודל ההזזה מוצגים על-ידי כיוון החץ והצבע, בהתאמה. ההעתקה הופכת לגדולה יותר בפריפריה של גוף התא B2B ככל שאזור התפשטות התא גדל. סרגלי הצבע מציינים גודל תזוזה (ארגמן = סדר גודל גבוה; שחור = סדר גודל נמוך) ב -(B, E, H, K, N). (C, F, I, L, O) שדה המתיחה (חופף לתמונת השדה הבהיר) המחושב משדה ההזזה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח משיכה. המתיחה מרוכזת בפריפריה של תאי B2B. סרגלי הצבע מציינים את גודל המתיחה (ארגמן = סדר גודל גבוה; שחור = סדר גודל נמוך) ב - (C, F, I, L, O). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: YAP = חלבון הקשור ל-yes; PAA = פוליאקרילמיד. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S3 משלים: שינויים בביטוי/הפצה של YAP, בשדה תזוזת המצע ובשדה המתיחה של תאי סרטן PC9 במהלך התפשטות מוקדמת. (A, D, G, J) תא PC9 נזרע על ג'ל PAA 5 kPa ותמונה מעל 10 שעות לאחר הקובץ המצורף הראשוני של מצע התא. ביטוי YAP מיוצג על-ידי עוצמת פלואורסצנטיות ירוקה. הערה: עוצמת YAP בתוך הגרעין פוחתת בהדרגה אך נשארת דומה או מעט נמוכה מזו שבציטופלסמה לאורך זמן. סרגלי הצבע מציינים את רמות ביטוי YAP (ירוק = ביטוי גבוה; שחור = ביטוי נמוך) ב (A, D, G, J). (B, E, H, K) עיוות מצע (חופף לתמונת השדה הבהיר) במיקום התא מיוצג על-ידי שדה ההעתקה בכל נקודת זמן. כיוון וגודל ההזזה מוצגים על-ידי כיוון החץ והצבע, בהתאמה. ההעתקה הופכת לגדולה יותר בשוליים של גוף התא PC9 ככל שאזור התפשטות התא גדל. סרגלי הצבע מציינים את גודל ההזזה (ארגמן = סדר גודל גבוה; שחור = סדר גודל נמוך) ב - (B, E, H, K). (C, F, I, L) שדה המתיחה (חופף לתמונת השדה הבהיר) המחושב משדה ההעתקה. המתיחה מרוכזת בפריפריה של תאי PC9. סרגלי הצבע מציינים את גודל המתיחה (ארגמן = סדר גודל גבוה; שחור = סדר גודל נמוך) ב - (C, F, I, L). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: YAP = חלבון הקשור ל-yes; PAA = פוליאקרילמיד. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

תהליך ההדמיה (שלב 6.3) הוא קריטי כדי להבטיח שתמונות הפלואורסצנטיות יהיו באיכות טובה מספיק כדי להניב תוצאות כימות תקפות. תמונות z-stack של חלבון פלואורסצנטי או חרוזים צריך להיות z-טווח כי הוא גדול מספיק כדי לכלול את התמונות בפוקוס עבור כל Z-עמדות כי המדגם משתרע. צעד קריטי נוסף הוא איסוף תמונות הייחוס של חרוזים פלואורסצנטיים לאחר המסת התאים (שלב 6.5). מכיוון שיש לצלם את תמונות הייחוס באותן עמדות בשלב 6.3, אין לגרום לתזוזה יחסית בין צלחת הפטרי, תא הסביבה והמיקרוסקופ. החוקרים המבצעים את שלב ההתמוססות חייבים להיות זהירים כדי להסיר את המכסה של צלחת פטרי ולוודא כי ההפרעה המכנית מיושמת אינה גדולה מספיק כדי לשנות את המיקום של המנה בחדר הסביבה.

פתרונות מסופקים להלן כדי לפתור שגיאות מסוימות שעלולות להתרחש במהלך ניסויים. אם אף מאקרו אינו מופעל לאחר לחיצה על Enter בשלב 6.4, סביר להניח שהסיבה לכך היא שהאזור התחתון השמאלי של המסך תפוס על-ידי חלון שאינו רכיב. במקרה כזה, יש לנקות את האזור התחתון השמאלי של החלון כך שניתן יהיה להפעיל פקודות מאקרו ברכיבים. שגיאה נפוצה נוספת היא שתמונות השדה הבהיר נראות שחורות. בעיה זו נגרמת על ידי מרווח זמן לא מספיק בין הרכישות של תמונות פלואורסצנטיות ותמונות שדה בהיר. עיכובים קלים בספירת זמן הדמיית הפלואורסצנטיות יכולים להצטבר לאורך זמן ולגרום לעיכובים ניכרים ולהפריע להדמיית שדה בהיר. פתרון אחד הוא להתאים את משך מחזור הדמיה אחד של כל העמדות להיות קטן (לא שווה) מרווח הזמן בין תחילת תנועות רצופות. פעולה זו מרעננת את ספירת הזמן ומבטלת את השגיאה המצטברת בתחילת כל מחזור הדמיה.

טכנולוגיית חקירה כל-אופטית זו תומכת (1) במגוון רחב של חומרה/תוכנה, כולל ניקון, (2) סוגים שונים של מערכות הידרוג'ל מאומתות, כולל ג'לטין, PEG, מטריגל וקולגן I ג'לים, ו-(3) התאמה אישית הניתנת לתכנות המבוססת על צרכים שונים של חוקרים. עם זאת, אם אחת מפונקציות הבקרה ברמה התחתונה אינה זמינה ממיקרוסקופ מסחרי, התאמה אישית של הפונקציות באמצעות AMFIP הופכת למאתגרת. מגבלה נוספת של טכניקה זו היא הסחף המרחבי של המדגם הן במישור XY והן במישורי המיקוד (Z). למרות מגבלה זו ניתן להתגבר במהלך לאחר עיבוד של התמונות, זה חיוני כדי לשפר את פונקציית המיקוד האוטומטי כדי לתקן את הסחף בזמן אמת של הדגימות. שיפור זה יגדיל את התפוקה של תהליך ההדמיה ולהפחית את השגיאה הפוטנציאלית הנגרמת על ידי הסחף במהלך ניסויים.

Mechanotransducers, כגון YAP, עשוי לשמש כיעדים טיפוליים חדשים לפיתוח טיפולים מבטיחים לסרטן25,26,27. נתונים חדשים מצביעים על כך ש-YAP מקדמת את התפשטותם ופלישה לתאים סרטניים. טרנסלוקציה YAP המושרה על ידי מכניקה מהציטופלסמה לגרעין מפעילה את שעתוק הגנים הקשורים להגירת תאים, התפשטות, פלישה ואפופטוזיס, מה שמוביל להתנהגויות תאים חריגות28,29,30,30,31. עבודה זו נועדה לחקור את המתאם הפוטנציאלי של יחס YAP N / C ומכניקת תאים בשני סרטן ריאות אנושי טיפוסי וקווי תאים נורמליים. במהלך תקופת התפשטות התאים של 10 שעות, תאי PC9 מראים ריכוזי YAP דומים בגרעין ובציטופלסמה (איור 3D ואיור 5A). תאי B2B מראים ריכוז YAP גבוה יותר בגרעין מאשר בציטופלסמה (איור 3C ואיור 5A). קשר זה שנמצא בשלב ההתפשטות המוקדמת שונה מרוב הממצאים שפורסמו המשווים ריכוז YAP בגרעין בין תאים נורמליים לסרטניים. אמנם לא בהכרח בשלב ההתפשטות המוקדמת, רוב הממצאים שפורסמו מראים כי YAP מרוכז יותר בגרעין של תאים סרטניים מאשר בגרעין של תאים נורמליים27,28. רק מחקר אחד על סרטן השד דיווח על חריג 32 שמראה YAP מרוכז יותר ציטופלסמה, אשר מסכים עם התצפיות הנוכחיות שלנו שנעשו בתאי PC9 סרטן ריאות. למיטב ידיעת המחברים, עבודה זו היא הראשונה להראות יחס נמוך יותר של YAP N/C בקו תאי סרטן ריאות אנושיים. המחברים משערים כי הסיבה ליחס יציב של YAP N/C בתאי PC9 עשויה לנבוע מהשינוי הנמוך באזור התפשטות התא/גרעין ומתיחה בתאי PC9 בשלב ההתפשטות המוקדם. הניתוח של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של יחס YAP N/C נמוך בתאי PC9 ו- B2B נמשך.

במהלך 10 השעות הראשונות של ההתפשטות, שני קווי תאים אלה מציגים קשר ברור בין יחס YAP N/C, המתיחה של התא ואזור ההתפשטות (איור 5). עבור תאי B2B, יחס YAP N/C גבוה יותר מתואם עם אזור התפשטות גבוה יותר של תאים וגרעין (איור 6A,B), התואם את הנתונים המדווחים של תאים נורמליים אחרים33. מעניין, למרות המגמה ההתפתחותית של קשר זה נמצא בדרך כלל בכל תאי B2B שנרשמו, שתי מעלות שונות (גבוה ונמוך) של קשר זה נמצאים. תאי B2B המתפשטים ומעבירים בו-זמנית מראים אחיזה נמוכה יותר ואזור התפשטות גבוה יותר של תאים וגרעין עם יחס YAP N/C גבוה יותר (2.05 ± 0.32). עבור תאי B2B המתפשטים ונשארים באותו מיקום, הם מראים אחיזה גבוהה יותר ואזור התפשטות תאים וגרעין תחתון עם יחס YAP N/C נמוך יותר (1.74 ± 0.21). שתי דרגות אלה של קשרי גומלין מודגמות בקבוצות הנתונים הפזורות (איור 6C, D). כפי שדווח בספרות, תאים רגילים נייחים, כגון תאי פיברובלסט עוברי NIH 3T3, יש המתיחה גבוהה יותר מאשר תאים נודדים34. הנתונים שדווחו במאמר זה מצביעים על כך שתאי B2B המתפשטים והלא נודדים הפעילו מתיחות גבוהות יותר מאשר הפצה והעברה של תאי B2B, מה שמצביע ככל הנראה על כך שנדרשת משיכה גבוהה כדי שתאים שאינם נודדים יתייצבו על המצע.

בנוסף, נתונים אלה מראים כי תאי B2B רגילים נייחים מייצרים כוח פרי-גרעיני גבוה יותר, ואילו מחקרים קודמים שנערכו על ידי חוקרים אחרים דיווחו רק על אחיזת תאים גבוהה יותר שנוצרה בשוליים של תאים נייחים34,35,36,37. המחברים סבורים כי ההבדל בנטייה המהותית של הגירה בניסויים עלול לגרום לתוצאות סותרות אלה. בניסויים שפורסמו, micropatterning בצורת ריבוע שימש כדי להגביל תאים בודדים מלהתפשט ולעכב הגירה; לא ידוע אם לתאים הייתה נטייה לנדוד. מכיוון שתאים נודדים מראים לעתים קרובות כוח משיכה גבוה בשולי התאים38, סביר להניח שתאים בעלי נטייה לנדוד עדיין ישמרו על אחיזה גבוהה בפריפריה למרות שהנדידה שלהם מוגבלת. במחקר הנוכחי, התאים הנייחים אינם מוגבלים על ידי כל micropattern אבל לא נודדים, המציין כי התאים נוטים לשמור על מצבם שאינו נודד. אפשרות נוספת היא שצורת התא המוגדרת על ידי המיקרו-פאטרן עשויה להשפיע על התפלגות הידבקויות המוקד וכוחות המתיחה39. התוצאות במחקר זה נוצרו ללא כל micropatterning confining ומייצגים את התפלגות הכוח של תאים נייחים בצורתם המקורית.

למיטב ידיעת המחברים, רק פרסום אחד עד כה דיווח באופן ספציפי על מציאת כוחות פרי-גרעיניים בתאים רגילים (פיברובלסטים עובריים של עכבר), שעלולים להיגרם על ידי כובע האקטין המשתרע על פני הגרעין40. טרנסלוקציה של ציטופלסמה לגרעין YAP מתואמת עם הגידול בכוח הפרי-גרעיני40. חיפוש מעמיק בספרות הרלוונטית לא הניב פרסומים המדווחים על כוח פרי-גרעיני או על מכסה אקטין בתאים סרטניים. מחקר עקיף על תאי סרטן מלנומה הראה כי שפת האקטין (ארגון אחר של אקטין פרי-גרעיני הממוקם סביב אך לא מכסה את הגרעין) מפחית את שיעורי נדידת התאים41, מה שמרמז בעקיפין על קיומו של כוח פרי-גרעיני. עם זאת, לא מדווחים נתונים ניסיוניים ישירים. במחקר זה, המחברים מצאו כי הן PC9 והן B2B תאים להראות עקירה פרי גרעיני ומתיחה. המנגנונים של דור הכוחות הפרי-גרעיניים והשפעותיהם נותרו שנויים במחלוקת. בתאים רגילים, כובע actin דווח לשחק תפקיד בוויסות גרעין מורפולוגיה וארגון כרומטין42, העברת אותות מכניים מהידבקויות מוקד לתוך הגרעין באמצעות קישורים של נוקלאוסקלטון ו cytoskeleton (LINC) complex43, ויסות נדידת תאים44. Lamin מיזוג אוויר קשור להיווצרות ושיבוש של cap actin cap40,41,42,43,44. עם זאת, הדו"ח שטען כי מכסה actin מייצר כוח פרי גרעיני לא לקח בחשבון את התפקיד הפוטנציאלי של rim40 actin. בתאים סרטניים, ביטוי יתר של Lamin A מקל על היווצרות שפת אקטין ומגביל את נדידת התא הסרטני. ביטוי יתר של לאמין B מפחית את היווצרות שפת האקטין ומקדם הגירה. הכוח הפרי-גרעיני עשוי להיות מעורב בתהליך זה בשל קיומו של ארגון פרי-גרעיני אקטין ואת ההשפעה של Lamin A. עם זאת, תוצאות מחקר זה לא הראו כל עדות לכוחות פרי-גרעיניים מדודים או להתנהגות של כובע actin. לכן, גילוי כוחות פרי-גרעיניים בתאי PC9 במחקר הנוכחי הוא הדו"ח הראשון המציג כוחות פרי-גרעיניים ועקירות בתאי סרטן ריאות. המחברים חוקרים כעת את המנגנונים המולקולריים והפונקציות של כוחות פרי-גרעיניים בתאי PC9 ו- B2B מהונדסים CRISPR/ Cas9.

מעבר לחקירת המכנוביולוגיה הכל-אופטית המודגמת במאמר זה, ניתן ליישם את המערכת הרב-תכליתית המשולבת כדי לחקור אופטית מספר עצום של אותות פיזיולוגיים ופתוביולוגיים חיוניים אחרים במערכות חיות. לדוגמה, המעבדה של המחברים הקימה לאחרונה מספר רב של קווי תאים סרטניים אנושיים שעברו ביציבות, המבטאים במשותף שלושה חלבוני קרום מגיבים לאור: מחוון מתח הממברנה QuasAr2 (עירור: 640 ננומטר; פליטה: 660 nm-740 ננומטר), depolarizer מתח הממברנה CheRiff (עירור: 488 ננומטר), ומתח ממברנה hyperpolarizer eNpHR3 (עירור: 590 ננומטר). שלושת החלבונים הפונקציונליים האלה יכולים להיות מופעלים על ידי קווי לייזר ספקטרום אורתוגונליים באופן נטול מגעים צולבים, ומאפשרים תקשורת איתות דו-כיוונית כל-אופטית (קריאה ובקרה) של אלקטרופיזיולוגיה של הממברנה. באמצעות מערכת אופטו-אלקטרוניקה משולבת ומהדק תיקון ידני, המחברים אימתו את השליטה והכל אופטית ואת הקריאה של מתח הממברנה (Vm) בתאי סרטן אנושיים בודדים וספרואידים גידול רב תאיים. חקירת האלקטרופיזיולוגיה האופטית פותחת את האפשרות לחקירה מפורטת של ביואלקטריות בלתי נגישה בעבר בתאים סרטניים, אשר עשויה לסייע בקידום הביולוגיה של הגידול מציר חדש.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים להצהיר.

Acknowledgements

פרויקט זה נתמך כלכלית על ידי פרס פיילוט הסרטן מטעם המרכז לסרטן בריאות UF (X. T. ו- D. S. ) וחבילת הסטארט-אפ פרס Gatorade (X. T.). המחברים מעריכים בכנות את הדיונים האינטלקטואליים עם ואת התמיכה הטכנית של ד"ר ג'ונתן ליכט (UFHCC), ד"ר רולף רן (UFHCC), ד"ר ג'י-היון לי (ביוסטטיסטיקה, UF), ד"ר יו פאן (MAE, UF), ד"ר וורן דיקסון (MAE, UF), ד"ר Ghatu Subhash (MAE, UF), ד"ר מארק Sheplak (MAE & ECE, UF), ד"ר מליסה Sarntinoranont (MAE, UF), ד"ר סקוט בנקס (MAE, UF), ד"ר סקוט בנקס (MAE, UF, UF), ד"ר מתיו טראום (MAE, UF), ד"ר דיוויד האן (אוניברסיטת אריזונה), ד"ר וויהונג וואנג (תאגיד אורקל), ד"ר יוחואה טאן (האוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג) וצוות התמיכה של ניקון (ד"ר חוזה סראנו-ולז, לארי קורדון וג'ון אקמן). המחברים אסירי תודה על התמיכה הנדיבה והיעילה של כל חברי מעבדות המחקר של טאנג, סימנס וגואן וכל אנשי הצוות של MAE & ECE & המחלקות האונקולוגיות לפיזיקה וקרינה, UF.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilaneSigma-aldrich440140
0.05 % TrypsinCorning25-051-CI
75 cm2 flaskCorning430641U
8 Benchtop CentrifugeThermo75007210
A1R confocal systemNikonHD25
Acetic acidSigma-aldrich695092glacial, ACS reagent, ≥99.7%
BEAS-2B (B2B) cellsSigma-aldrich95102433human epithelial cells from lung tissue
Carboxylate-Modified MicrospheresInvitrogenF8797
Culture medium (RPMI-1640)Gibco11875093
Desktop ComputerDell2018with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZBTokai HitTIZB
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140
Fibronectin Human Protein, PlasmaGibco33016015
Fiji ImageJNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation1.53k
Glass-bottom petri dishMatTekP35G-1.5-14-C
HEPES buffered salineSigma-aldrich51558
Hydrazine hydrate solutionSigma-aldrich53847
IntelliJ IDEAJetBrains2020Java development platform
Java Development KitOracle14.0
KimwipeKimtech Science3066-05
MATLABMathWorks2020b
Monochrome CameraFLIRBFS-U3-70S7M-C
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonzaLT07-218
N,N′-Methylenebisacrylamide solutionSigma-aldrichM1533
NIS-Elements software platformNikon4.50software platform
OriginOriginLabOriginPro 2017 (Learning Edition)data analysis and graphing software
Penicillin-streptomycinGibco15140122
PC9 cellsSigma-aldrich90071810human adenocarcinoma cells  from lung tissue
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010023
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England Biolabs F-553Shigh-fidelity DNA polymerase
Scotch tapeScotchadhesive tape
Sodium dodecyl sulfate solutionSigma-aldrich05030
Super glueGorillacyanoacrylate glue
Ti2-E inverted microscopeNikonMEA54000
TI2-S-SE-E Motorized Stage with EncoderNikonMEC56120
μManagerversion 2.0 gammaopen source microscopy software (https://micro-manager.org/)

References

  1. Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology. Nature Communications. 11 (1), 3881 (2020).
  2. Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
  3. Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. Spatiotemporal force and motion in collective cell migration. Scientific Data. 7 (1), 197 (2020).
  4. Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer. Extreme Mechanics Letters. 48, 101438 (2021).
  5. Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. Molecular tools for imaging and recording neuronal activity. Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).
  6. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  7. Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. A call for bioimaging software usability. Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).
  8. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  9. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  10. Luo, Q., et al. Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation. bioRxiv. , (2021).
  11. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using manager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  12. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  13. Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system. PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631 (2014).
  14. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  15. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  16. Phelps, E. A., et al. Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery. Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).
  17. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).
  18. Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).
  19. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  20. Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH. Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).
  21. . Micro-Manager Available from: https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2 (2021)
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Martiel, J. L., et al. Measurement of cell traction forces with ImageJ. Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).
  24. Okumurai, I. A. On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space. Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).
  25. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  26. Hong, W. W., Guan, K. L. The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway. Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).
  27. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the roots of cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  28. Wang, Y., et al. Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer. Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).
  29. Li, H., et al. Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134 (2016).
  30. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13, 131 (2014).
  31. Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).
  32. Yuan, M., et al. Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast. Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).
  33. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. bioRxiv. , (2020).
  34. Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. Migration regulates cellular mechanical states. Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).
  35. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  36. Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  37. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  38. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  39. Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
  40. Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction. Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).
  41. Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization. Cells. 9 (10), 2161 (2020).
  42. Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization. Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).
  43. Khatau, S. B., et al. A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).
  44. Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap. Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved