JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

Abstract

מתילציה של דנ"א, סוג של ויסות גנים אפיגנטי, חשובה לתפקוד תקין של התאים. בתאים, חלבונים הנקראים דנ"א מתיל-טרנספראזות (DNMTs) קובעים ומתחזקים את תבנית המתילציה של הדנ"א. שינויים בתבנית המתילציה הרגילה של הדנ"א קשורים להתפתחות והתקדמות הסרטן, מה שהופך את ה-DNMTs למטרות פוטנציאליות של תרופות לסרטן. לפיכך, יש חשיבות רבה לזיהוי ואפיון מעכבי מולקולות קטנות חדשות של אנזימים אלה. מאמר זה מציג פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לסנן מעכבי DNA מתיל-טרנספראז. בדיקת הקינטיקה המצומדת הרציפה מאפשרת לקבוע מהירויות ראשוניות של מתילציה של דנ"א בנוכחות ובהיעדר מעכבי מולקולות קטנות פוטנציאליות. הבדיקה משתמשת באנדונוקלאז Gla I הרגיש למתיל כדי להצמיד מתילציה של מצע DNA המימתילציה ליצירת פלואורסצנציה.

בדיקה רציפה זו מאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת. ביצוע הבדיקה בכמויות קטנות בלוחות מיקרוטיטר מפחית את עלות הריאגנטים. באמצעות בדיקה זו, נערך בדיקה קטנה לדוגמה עבור מעכבי DNMT1, איזוזימה DNMT הנפוצה ביותר בבני אדם. המוצר הטבעי אנתרקווינון בעל תחליף גבוה, חומצה לקית A, הוא מעכב דנ"א חזק ותחרותי של DNMT1. כאן אנו בוחנים שלושה מעכבי מולקולות קטנות פוטנציאליות - אנתרקווינונים או מולקולות דמויות אנתרקווינון עם תחליפים אחד עד שלושה - בשני ריכוזים כדי לתאר את פרוטוקול הבדיקה. מהירויות ראשוניות משמשות לחישוב אחוז הפעילות שנצפתה בנוכחות כל מולקולה. אחת משלוש התרכובות שנבדקו מציגה עיכוב תלוי ריכוז של פעילות DNMT1, מה שמצביע על כך שהיא מעכבת פוטנציאלית של DNMT1.

Introduction

מתילציה של דנ"א היא סימן אפיגנטי חשוב המווסת את ביטוי הגנים ואת מבנה הכרומטין. מתילציה מתרחשת בעיקר בדינוקלאוטידים של CpG — ציטוזין ואחריו גואנוזין; קבוצת המתיל מתווספת למיקום 5 של ציטוזין. יש צורך בתבניות מתילציה נכונות של DNA, ובכך בביטוי גנים תקין, להתפתחות ותפקוד מתאימים של התאים. מצבי מחלה רבים נקשרו לשינויים בתבנית המתילציה הרגילה 1,2,3. לדוגמה, קיים קשר בין התחלת סרטן והתקדמותו לבין שינויים בתבנית המתילציה של הדנ"א. בדרך כלל, תאים סרטניים מציגים רמות כלליות נמוכות יותר של מתילציטוזין, אשר תורם לחוסר יציבות הגנום. יחד עם זאת, המתילציטוזין שנמצא בגנום מרוכז באזורים המקדמים של גנים מדכאי גידול, מה שמוביל להשתקת גנים של חלבונים חשובים אלה. יש לציין כי שינויים אפיגנטיים הם דינמיים והפיכים, בניגוד למוטציות הדנ"א הקשורות לגידול. זה הפך את החלבונים המעורבים בוויסות גנים אפיגנטיים למטרות מעניינות של תרופות 2,4.

מתיל-טרנספראזות דנ"א (DNMTs) הם החלבונים האחראים על ייצור ושמירה על תבניות מתילציה של דנ"א. שלושה איזוזימים פעילים קטליטיים, DNMT1, DNMT3a ו-DNMT3b, קיימים בבני אדם. במהלך הפיתוח וההתמיינות קובעים המתיל-טרנספראזות של דה נובו, DNMT3a ו-DNMT3b, תבניות מתילציה. שני האנזימים יכולים לקשור את חלבון ה-DNMT3L שאינו פעיל באופן קטליטי ליצירת קומפלקסים המציגים פעילות מוגברת 1,5. לאחר חלוקת התא, תאי הבת מכילים דנ"א שעבר המימתילציה - דנ"א המכיל מתילציטוזין בגדיל אחד בלבד של הדופלקס - מאחר שהדנ"א המסונתז החדש נטול סימני מתילציה. תפקידו העיקרי של DNMT1 הוא לבצע מתילציה של דנ"א המימתילציה זה, ובכך לבסס מחדש את תבנית המתילציה המלאה 1,5.

הקשרים בין פעילות DNMT לסרטן מבוססים היטב. ביטוי יתר של DNMT1, בין אם על ידי מנגנוני שעתוק או לאחר תרגום, הוא תוצאה של מספר מסלולים אונקוגניים נפוצים 6,7,8,9. גישות גנטיות להפחתת פעילות DNMT1 באמצעות אללים היפומורפיים גורמות לירידה בהיווצרות הגידול בעכברי Apc(Min) 10. אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסים שמפילים DNMT1 מעכבים ניאופלזיה בתרבית תאים ובמודלים של גידולי עכברים11,12. לפיכך, עיכוב פעילות DNMT1 נראה כמו גישה מבטיחה לטיפול בסרטן. עם זאת, התפקידים שהאיזוזימים של DNMT3 ממלאים אינם כה פשוטים. מוטציות DNMT3a נמצאות בלוקמיה מיאלואידית חריפה13 ובתסמונת מיאלודיספלסטית14. לפחות אחת מהמוטציות שזוהו הוכחה כמפחיתה את פעילות המתילציה של הדנ"א של האנזים15. עם זאת, DNMT3b מתבטא יתר על המידה בסרטן השד16 ובסרטן המעי הגס17. כאשר איזוזימים שונים של DNMT ממלאים תפקידים שונים בסרטן, זיהוי מעכבים ספציפיים לאיזוזים יהיה קריטי. לא רק שתרכובות אלה יהיו שימושיות לפיתוח טיפולים, אלא שמעכבים ספציפיים לאיזוזים יהיו גם כלי רב ערך לנתח את התפקיד של כל איזוזימה DNMT באטיולוגיה של סרטן.

מספר מעכבי DNMT דווחו בספרות. מעכבי DNMT ידועים ניתן לחלק לשני סוגים: נוקלאוזיד ולא נוקלאוזיד. מעכבי נוקלאוזיד הם בדרך כלל אנלוגים של ציטידין. תרכובות אלה משולבות בדנ"א ולוכדות באופן קוולנטי DNMTs. 5-azacytidine ו-5-aza-2'-deoxycytidine אושרו לטיפול בתסמונת מיאלודיספלסטית ולוקמיה מיאלואידית חריפה 4,18. הרעילות הגבוהה, הזמינות הביולוגית הנמוכה וחוסר היציבות הכימית של תרכובות אלה מהווים בעיות. עבודה שוטפת בוחנת את היעילות של הדור הבא של מעכבי נוקלאוזידים; SGI-110, המופק מ-5-aza-2'-deoxycytidine, הוא דוגמה אחת19,20. מעכבי נוקלאוזידים אינם ספציפיים לאיזוזימים וישביתו כל איזוזימה DNMT שנתקלים בה. לכן, טיפול בחומר מתיל של נוקלאוזיד גורם לדלדול כל האיזוזימים של DNMT 4,18. מעכבים שאינם נוקלאוזידים אינם צריכים להיות משולבים בדנ"א כדי להפעיל את ההשפעות המעכבות שלהם. במקום זאת, מולקולות אלה נקשרות ישירות ל-DNMTs, מה שמציג את האפשרות לעיכוב ספציפי לאיזוזימים. מספר מעכבי נוקליאוזיד התגלו עד כה, כולל SGI-1027 21, הידרלזין 22, פרוקאינאמיד 23, RG108 ונגזרותיו24, ומוצרים טבעיים, (−)-אפיגלוקטכין 3-גלאט (EGCG)25 וחומצה לאקאית A 26,27. רוב המעכבים שאינם נוקלאוזידים שהתגלו עד כה אינם איזוזימים סלקטיביים או מציגים העדפות חלשות לאיזוזימה אחת של DNMT. בנוסף, יש לשפר את העוצמה של מולקולות אלה, במיוחד בתאים 4,18. לכן, יש צורך לגלות או לפתח מעכבי DNMT חזקים יותר, איזוזימים-סלקטיביים.

מכשול לגילוי מעכבי מולקולות קטנות חדשות של DNMTs הוא המבחנים המייגעים המשמשים באופן מסורתי לבחינת פעילות DNMT28. מבחנים הם בדרך כלל רציפים עם מספר שלבים. הפעילות האנזימטית של DNMTs עדיין נבדקת באופן שגרתי באמצעות S-אדנוזיל מתיונין רדיואקטיבי (SAM)29,30,31,32,33,34. כמו כן פותחו בדיקות לא רדיואקטיביות למתילציה של DNA. לדוגמה, בדיקות המשתמשות באנדונוקלאזות הגבלה רגישות למתיל ובאלקטרופורזה כדי להפריד בין תוצרי העיכול תוארו35,36. סוגים אלה של מבחנים רציפים, מרובי שלבים, אינם ניתנים בקלות לגילוי תרופות. מאז אמצע שנות ה-2000 פותחו מספר מבחני מתילציה של דנ"א עם תפוקה גבוהה יותר28. בדיקת קרבה של סינטילציה שימשה לבדיקת מעכבי DNMT137. בדיקה נוספת המשתמשת באנדונוקלאז הגבלה רגיש למתיל שימשה לבדיקת מעכבי DNMT3a25,38. בעוד ששני המבחנים אפשרו תפוקה גבוהה יותר מאשר מבחני מתילציה מסורתיים של DNA, הבדיקות דורשות שלבים מרובים ואינן מאפשרות תצפית על פעילות מתילציה בזמן אמת. לאחרונה תוארה בדיקת קינטיקה רציפה המשלבת את היווצרותו של S-אדנוזילהומוציסטאין (SAH), תוצר אחד של תגובת המתילציה, לשינוי הספקטרוסקופי ב-340 ננומטר הקשור לחמצון NADPH39. בדיקה זו משתמשת בשלושה אנזימי צימוד כדי ליצור אות ספקטרוסקופי.

פיתחנו בדיקת מתילציה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז המבוססת על פלואורסצנציה, המשתמשת באנזים צימוד יחיד הזמין מסחרית ויכולה להפיק נתונים בזמן אמת (איור 1). אוליגונוקלאוטיד סיכת שיער המכיל שלושה מתילציטוסינים משמש כמצע. דנ"א המצע מכיל פלואורופור בקצה 5' וקוונצ'ר בקצה 3'. מתילציה של אתר ה-CpG ההמימתילציה יוצרת את אתר המחשוף של האנדונוקלאז Gla I - GCGC שעבר מתילציה מלאה. מחשוף Gla I של המוצר אוליגונוקלאוטיד משחרר את הפלואורופור מהקוונצ'ר ומייצר פלואורסצנטיות בזמן אמת. ניתן להשתמש בבדיקה כדי לבחון את הפעילות של כל איזופורם של DNMT; עם זאת, פעילות גבוהה יותר נצפית עם DNMT1 מכיוון שאיזוזים אלה מעדיפים מתילטים של דנ"אהמימתילציה 1,5. פעילות חזקה עוד יותר נצפתה אם התחום רצף מיקוד מוקדי שכפול אוטומטי (RFTS) מוסר מ- DNMT1. תחום זה, שנמצא באזור הרגולטורי N-terminal, נקשר לאתר הקטליטי ומונע קשירת DNA. הסרת ~600 חומצות האמינו הראשונות גורמת לאנזים חתוך שפעיל יותר באופן משמעותי מהאנזים באורך מלא (עלייה של ~פי 640 ב-kcat/Km)40. צורה פעילה זו של האנזים, המכונה DNMT1 חסר RFTS (חומצות אמינו 621-1616), מאפשרת זיהוי קל יותר של מעכבים בשל הכוח הקטליטי המוגבר שלו. מאמר זה מציג פרוטוקול לשימוש ב-DNMT1 חסר RFTS במבחנים כדי לסנן מעכבי מולקולות קטנות פוטנציאליות. באמצעות הבדיקה הרציפה המצומדת לאנדונוקלאז, המהירות הראשונית נקבעת בנוכחות ובהיעדר כמה מולקולות קטנות. כל מעכב פוטנציאלי נבדק בשני ריכוזים כדי לחפש עיכוב DNMT1 תלוי ריכוז. אחוז הפעילות שנצפתה בנוכחות המולקולות הקטנות חושב בכל מקרה.

figure-introduction-8026
איור 1: בדיקת מתילציה של DNA. דנ"א של סיכות שיער המימתילציה עם פלואורופור בקצה 5' וקוונצ'ר בקצה 3' משמש כמצע. DNMT1 מזרז את העברת קבוצת המתיל מ-S-אדנוזיל-מתיונין לאתר CpG שאינו מתילציה, ויוצר S-אדנוזילהומוציסטאין ודנ"א שעבר מתילציה מלאה. מוצר הדנ"א מכיל את אתר הבקיעה של האנדונוקלאז Gla I, אשר מבקע אתרי GCGC שעברו מתילציה מלאה. ביקוע של דנ"א המוצר משחרר את הפלואורופור 5' מהקוונצ'ר 3', ויוצר פלואורסצנציה. קיצורים: Fl = פלואורופור; Q =quencher; DNMT1 = דנ"א מתיל-טרנספראז 1; SAM = S-אדנוזיל-מתיונין; SAH = S-אדנוזילהומוציסטאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

1. הכן פתרונות בדיקה למסך

הערה: ניתן להתאים את ריכוזי המצעים המשמשים בבדיקה זו. עבור DNMT1 חסר RFTS, ערכי Km שנקבעו בניסוי עבור מצע הדנ"א של סיכת השיער ו-SAM הם 1-2 ננומטר ו-2 מיקרומטר,בהתאמה 26,40.

  1. הכן 600 μL מכל מצב בדיקה הנבדק בצינורות מיקרוצנטריפוגה על קרח.
    הערה: הנפח הכולל של פתרון הבדיקה הדרוש תלוי במספר המשכפלים המתבצעים. כל תנאי בדיקה הופעל במשולש עבור פרוטוקול זה.
    1. הוסף ddH2 O ו-5x חיץ מתילציה (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 500 mM אשלגן גלוטמט, 5 mM dithiothreitol (DTT), 25% גליצרול) לכל צינור כדי להשיג ריכוז סופי של חיץ 1x. עבור בדיקות המכילות תרכובת של 20 μM, הוסף 472 μL של ddH2O ו- 120 μL 5x buffer. עבור בדיקות המכילות תרכובת של 50 μM, הוסף 470 μL של ddH2O ו- 120 μL של חיץ 5x.
    2. יש להוסיף 3.15 μL של 20 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA) לכל דגימה.
    3. הוסף 2 μL של 3.15 μM מצע DNA סיכת שיער ו-1.33 μL של 4.75 mM SAM לכל דגימה.
      הערה: ריכוז המצעים בתערובת תמיסת הבדיקה הוא פי 1.05 מהריכוזים הסופיים הרצויים.
    4. הוסף מעכב לריכוז סופי של 21 μM (1.26 μL של 10 mM) או 52.5 μM (3.15 μL של 10 mM) לדגימות המתאימות. הוסף כמות שוות ערך של דימתיל-סולפוקסיד (DMSO) לדגימת בקרה.
      הערה: ריכוז המעכב המשמש במסך יכול להיות מגוון. ריכוז ה-DMSO הסופי המרבי צריך להיות ≤5% (v/v). לריכוזי DMSO של עד 5% (v/v) אין השפעה על הפעילות שנצפתה במבחן26.
  2. ערבבו את הפתרונות על ידי מערבולת (3,000 סל"ד) במשך 3 שניות. סובבו את הדגימות למשך מספר שניות בצנטריפוגה שולחנית (1,200 × גרם) כדי להבטיח שהתמיסה נאספת בתחתית הצינור.
  3. Aliquot 95 μL של כל תמיסת בדיקה ל-6 בארות רצופות בלוח שחור של חצי אזור 96 בארות (איור 2).
    הערה: בדיקות סינון אלה בוצעו בשתי אצוות. ראשית, נבדקו 20 דגימות מעכבי μM (4 תנאים סה"כ), ולאחר מכן דגימות מעכבי 50 μM (4 תנאים סה"כ).

figure-protocol-2034
איור 2: הגדרת צלחת בדיקה. כל תמיסת בדיקה מתחלקת לשש בארות בלוח השחור של 96 בארות: בקרת DMSO (כחול), תרכובת 1 (ירוק), תרכובת 2 (אדומה) ותרכובת 3 (צהוב). גם DNMT1 חסר RFTS וגם Gla I יתווספו לשלוש בארות. כבקרה, Gla I לבדו יתווסף לשלוש הבארות האחרות. קיצורים: RFTS = רצף מיקוד מוקדי שכפול; DNMT1 = דנ"א מתיל-טרנספראז 1; DMSO = דימתילסולפוקסיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. הכן פתרונות אנזימים למסך

הערה: DNMT1 חסר RFTS יכול לבוא לידי ביטוי ב - E. coli ולטהר להומוגניות. הליכי ביטוי וטיהור עבור DNMT1 חסר RFTS תוארו בעבר41. נפח האנזים הדרוש תלוי במספר הבדיקות המתבצעות. כאן מבוצעים ארבעה מבחנים שונים בכל סט; כל בדיקה הושלמה במשולש.

  1. הכן 75 μL מכל תמיסת אנזים בצינורות מיקרוצנטריפוגה על קרח.
    הערה: יהיה צורך בשתי תמיסות אנזימים. פתרון אחד יכיל DNMT1 ו-Gla I; השני יכיל רק את Gla I.
    1. הוסף ddH2 O ו-5x חיץ מתילציה (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 500 mM אשלגן גלוטמט, 5 mM DTT, 25% גליצרול) לכל צינור כדי להשיג ריכוז סופי של חיץ 1x. עבור תמיסת האנזים Gla I, יש להוסיף 15 μL של 5x buffer ו- 58.8 μL ddH2O. עבור תמיסת האנזים DNMT1+Gla I, יש להוסיף 15 μL של חיץ 5x ו-58.2 μL ddH2O.
    2. הוסף 1.2 μL של 10 U/μL Gla I לכל תמיסה לקבלת ריכוז סופי של 0.16 U/μL.
    3. הוסף 0.6 μL של 5 μM חסר RFTS DNMT1 לקבלת ריכוז סופי של 40 ננומטר לתמיסת DNMT1+Gla I.
  2. הקש בעדינות כדי לערבב את הפתרונות. סובבו את הדגימות למשך מספר שניות במיני צנטריפוגה שולחנית (1,200 × גרם) כדי לוודא שהתמיסה נאספת בתחתית הצינור.
  3. Aliquot 12 μL של כל תמיסת אנזים לתוך 6 בארות בלוח 96 בארות עם תחתית חרוטית (איור 3).

figure-protocol-4057
איור 3: הגדרת צלחת אנזים. הפתרונות Gla I (אפור) ו-DNMT1+Gla I (כחול) מתמזגים כל אחד בשש בארות בלוח 96 הבארות. באמצעות פיפט רב-ערוצי, ניתן להוסיף את האנזים לשורה של תמיסות בדיקה בו זמנית. עבור כל תנאי בדיקה (שש בארות), שלוש בארות יקבלו DNMT1+Gla I, ושלוש בארות יקבלו את Gla I בלבד. קיצור: DNMT1 = DNA מתיל-טרנספראז 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. הפעל את הבדיקה ונתח את הנתונים.

  1. מחממים את קורא הצלחות ל-37 מעלות צלזיוס. הכנס את הלוח השחור המכיל את פתרונות הבדיקה. נערו את הלוח (אורביטל כפול ב-425 פעימות לדקה במשך 5 שניות) וקראו את הפלואורסצנציה עם אורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 528 ננומטר. לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במסננים עם ניתוקי אורך גל מתאימים לקריאות הפלואורסצנטיות.
  2. הסר את צלחת הבדיקה. הוסיפו 5 μL של תמיסת אנזימים לכל באר וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    הערה: השתמש בפיפטים רב-ערוציים כדי שניתן יהיה להפעיל שורת דגימות בו-זמנית.
  3. הכנס את הצלחת לקורא הלוחות. הקלט פלואורסצנטיות כל 53 שניות במשך 30 דקות. נערו את הצלחת (אורביטל כפול ב-425 עותקים לדקה במשך 4 שניות) לפני כל קריאה.
  4. ממוצע משולש Gla אני שולט במבחנים עבור כל מצב. הפחת את עקבות תגובת הבקרה הממוצעת המכילה Gla I מהעקבות המשולשים המתקבלים בנוכחות DNMT1 חסר RFTS. קבע את הממוצע ואת שגיאת התקן של הממוצע עבור המשוכפלים המתוקנים.
  5. התווה את עקבות התגובה המתוקנת הממוצעת והתאם את החלק הליניארי ההתחלתי לקו כדי לקבוע את המהירות ההתחלתית.
  6. קבע את אחוז הפעילות על ידי חלוקת המהירות שנצפתה בנוכחות תרכובת על ידי המהירות שנצפתה בתגובת הבקרה המכילה DMSO והכפלתה ב -100.

4. בקרת בדיקה נוספת - תוספת רציפה של אנזימים

  1. הכן 550 μL של תמיסת בדיקה בצינור microcentrifuge על קרח. הוסף 110 μL של 5x מאגר מתילציה, 3.88 μL של 3.15 μM מצע DNA סיכת שיער, 6.43 μL של 47.5 mM SAM, 3.06 μL של 20 מ"ג / מ"ל BSA, ו 426.6 μL של ddH2O.
  2. מערבבים את התמיסה על ידי מערבולת (3,000 סל"ד) במשך 3 שניות. סובבו את הדגימות למשך מספר שניות במיני צנטריפוגה שולחנית (1,200 × גרם) כדי לוודא שהתמיסה נאספת בתחתית הצינור.
  3. Aliquot 90 μL של תמיסת הבדיקה לתוך 6 בארות רצופות בלוח שחור חצי שטח 96 באר.
  4. הכן את תמיסות האנזים DNMT1 על קרח. הוסף 4 μL של מאגר מתילציה 5x, 0.76 μL של 5 μM חסר RFTS DNMT1, ו 15.24 μL של ddH2O לצינור אחד. הוסף 4 μL של חיץ מתילציה 5x ו-16 μL של ddH2O לצינור אחר.
  5. הקש בעדינות כדי לערבב את הפתרונות. סובבו את הדגימות למשך מספר שניות במיני צנטריפוגה שולחנית (1,200 × גרם) כדי לוודא שהתמיסה נאספת בתחתית הצינור.
  6. הוסף 5 μL של תמיסה המכילה DNMT1 לשלוש בארות בצלחת 96 בארות שחורות בחצי אזור. הוסף 5 μL של פתרון בקרת החיץ לשלוש הבארות האחרות.
  7. הכניסו את צלחת המיקרוטיטר לקורא הצלחות שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. נערו את הלוח (אורביטל כפול ב-425 פעימות לדקה במשך 3 שניות) וקראו את הפלואורסצנציה עם אורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 528 ננומטר. יש לחזור על השייק ולקרוא כל 60 שניות למשך 30 דקות.
  8. בזמן שצלחת הבדיקה נמצאת בקורא הצלחות, הכינו את תמיסת Gla I על קרח. הוסף 8 μL של מאגר מתילציה 5x, 0.64 μL של 10 U/μL Gla I, ו-31.4 μL של ddH2O לצינור מיקרוצנטריפוגה. הקש בעדינות כדי לערבב את הפתרון. סובבו את הדגימה למשך מספר שניות במיני צנטריפוגה שולחנית (1,200 × גרם) כדי להבטיח שהתמיסה נאספת בתחתית הצינור.
  9. Aliquot 6 μL של תמיסת Gla I לתוך 6 בארות בלוח 96 בארות עם תחתית חרוטית.
  10. לאחר הקריאה הראשונית של 30 דקות, הסר את הלוח השחור מקורא הלוחות. הוסף 5 μL של תמיסת Gla I לכל 6 הבארות ומערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    הערה: השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי שניתן יהיה ליזום את כל הבארות בו-זמנית.
  11. החזירו את הלוח השחור לקורא הלוחות. הקלט פלואורסצנטיות כל 35 שניות במשך 35 דקות. נערו את הצלחת (אורביטל כפול ב-425 עותקים לדקה למשך 3 שניות) לפני כל קריאה.

תוצאות

DNMT1 פעיל הוא תנאי מוקדם לניתוח זה. DNMT1 חסר RFTS התבטא ב - E.coli וטוהר להומוגניות בעקבות נהלים שפורסמו בעבר41. כדי להבטיח שהאנזים המטוהר היה פעיל, נעשה שימוש בבדיקה רציפה מצומדת אנדונוקלאז כדי לבחון את פעילות המתילציה של הדנ"א36. בדיקה זו משתמשת בדנ"א דו-צדדי של זוג בס?...

Discussion

כדי לזהות ולאפיין מעכבים של מתיל-טרנספראזות DNA, יש למדוד את פעילות האנזים. קיימות מספר שיטות לבדיקת פעילות הדנ"א מתיל-טרנספראז. הפעילות מנוטרת בדרך כלל באמצעות רדיואקטיביות; העברה של קבוצת המתיל המסומנת של SAM ניתנת לכימות 29,30,31,32,33,34

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לאוניברסיטת באקנל ולמחלקה לכימיה על תמיכתם בעבודה זו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated MicroplateCorning3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom PlatesThermoFisher249570
Bovine Serum AlbuminNEBB9000S
compound 1ChemBridge5812086screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2ChemBridge6722175screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3ChemBridge5249376screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
DithiothreitolSigmaD0632
Gla ISibEnzymeE494methyl-sensitive endonuclease
GlycerolRPIG22025
Magnesium ChlorideSigmaM0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)IDTcustom synthesizedinternally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium GlutamateSigmaG1501
S-adenosylmethionineSigmaA4377methyl-donating co-factor (substrate)
Tris BaseRPIT60040

References

  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved