הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון לניטור גיוס לויקוציטים במהלך דלקת עורקים במודל מורין גפיים אחוריות

Summary

גיוס לויקוציטים וטסיות דם מהווה מרכיב חיוני הדרוש לצמיחה יעילה של עורקי בטחונות במהלך העורקים. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא כלי יעיל למעקב אחר דינמיקה של תאים עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה in vivo ופחות רעילות לאור לחקר גיוס לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך העורקים.

Abstract

Arteriogenesis תלוי מאוד לויקוציטים וגיוס טסיות לחלל perivascular של כלי בטחונות גדלים. הגישה הסטנדרטית לניתוח עורקים בטחוניים ולויקוציטים בארטריוגנזה היא מתודולוגיה היסטולוגית ex vivo (immuno-). עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת מדידה של תהליכים דינמיים כגון זרימת דם, מתח גזירה, אינטראקציות בין תאים ומהירות חלקיקים. מאמר זה מציג פרוטוקול לניטור תהליכי in vivo בצמיחת עורקים בטחוניים במהלך ארטריוגנזה באמצעות הדמיה תוך חיונית. השיטה המתוארת כאן היא כלי אמין למדידת דינמיקה ומציעה ניתוח ניגודיות גבוהה עם ציטוטוקסיות פוטו מינימלית, המסופקת על ידי מיקרוסקופ עירור מולטיפוטונים. לפני ניתוח העורקים הבטחוניים הגדלים, הושרה ארטריוגנזה בשריר האדוקטור של עכברים על ידי קשירה חד צדדית של עורק הירך.

לאחר הקשירה, העורקים הקולטרליים הקיימים החלו לגדול עקב לחץ גזירה מוגבר. עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח הוסרו העור והשומן התת עורי שמעל עורקי הצידית, ונוצר כיס לניתוחים נוספים. כדי להמחיש את זרימת הדם ואת תאי החיסון במהלך הדמיית in vivo , CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (טסיות) ונוגדנים CD45-phycoerythrin (PE) (לויקוציטים) הוזרקו תוך ורידי (i.v.) באמצעות קטטר שהונח בווריד הזנב של עכבר. מאמר זה מציג דימות מולטיפוטון תוך-חיוני כחלופה או כהשלמה in vivo לניתוחים ההיסטולוגיים הסטטיים הנפוצים ex vivo (immuno-) כדי לחקור תהליכים רלוונטיים לעורקים. לסיכום, מאמר זה מתאר שיטה חדשנית ודינמית in vivo לחקר סחר בתאי מערכת החיסון, זרימת הדם ולחץ גזירה במודל גפיים אחוריות של ארטריוגנזה, אשר משפר את אפשרויות ההערכה באופן משמעותי.

Introduction

למרות העניין המחקרי האינטנסיבי בשנים האחרונות, מחלות לב וכלי דם, כגון מחלות לב איסכמיות ושבץ, הן עדיין סיבת המוות העולמית המובילה¹. הטיפולים הנוכחיים למחלות אלה הם טיפולים פולשניים ביותר כגון אנגיופלסטיקה טרנסלומינלית מלעורית, אנגיופלסטיקה כלילית טרנסלומינלית מלעורית, או ניתוח מעקפים². לכן, יש צורך דחוף בפיתוח אפשרויות טיפוליות אלטרנטיביות, לא פולשניות. הגוף יכול ליצור מעקפים טבעיים סביב כלי דם היצרות או חסום כדי להפנות את זרימת הדם המופרעת לחלק הדיסטלי של ההיצרות. תהליך זה נקרא arteriogenesis². מחקרים רבים שנערכו לאחרונה הראו כי גזירה מוגברת של נוזלים משפיעה על גיוס לויקוציטים, אשר ממלא תפקיד חשוב במהלך arteriogenesis³. האפשרויות הנוכחיות העיקריות לנתח את גיוס לויקוציטים במהלך arteriogenesis הן ex vivo (immuno-) ניתוחים היסטולוגיים או מתודולוגיית מיון תאים מופעל פלואורסצנטיות (FACS)⁴. כדי לאפשר הערכה של דינמיקה לויקוציטים במהלך ארטריוגנזה, מאמר זה מציג פרוטוקול הדמיה תוך חיוני עם מיקרוסקופ מולטיפוטון.

לויקוציטים הם תאי הדם העיקריים שגויסו בתהליך של arteriogenesis³. פרוטוקול זה משתמש בהדמיית מולטיפוטונים כדי להראות את הזחילה של לויקוציטים דבקים המסומנים בנוגדנים מוזרקים נגד CD45-PE בעורקים בטחוניים, 24 שעות לאחר השראת העורקים על ידי קשירת עורק הירך (FAL) תוך שימוש באיסכמיה של גפיים אחוריות מורין^{מודל 5,6}. לחלופין, ניתן לתייג תאי חיסון ex vivo ולהזריק בזהירות לעכברים, כפי שהוכח במחקרים על אנגיוגנזה באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני⁷. זרימת הדם בתוך כלי דם ועורקים יכולה להיות דמיונית על ידי CD41-FITC (כדי לסמן טסיות), dextran-FITC (פלזמה), או על ידי הדור ההרמוני השני (SHG), אשר מדמה קולגן סוג 1 נוכח בקרום המרתף של חלק כלשהו של עץ כלי הדם. SHG הוא אפקט תיוג חופשי ייחודי של עירור מולטיפוטונים. דימות מולטיפוטונים מאפשר מעקב תאים ארוך טווח מבלי לפגוע ברקמה ולהפעיל את התאים על ידי עירור כוח לייזר. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא שיטת ההדמיה המועדפת להדמיית תאים ומבנים המסומנים באופן פלואורסצנטי בבעלי חיים בשל יכולתה לעורר את הפלואורופורים עמוק יותר לתוך הרקמה/איברים עם רעילות אור מינימלית⁸.

השימוש בלייזרים אינפרא אדום מכווננים עם פולסים המועברים במרווחי פמטו-שניות מעורר את הפלואורוכרום רק במישור המוקד, ללא עירור מעל ומתחת למישור המוקד⁸. לפיכך, מיקרוסקופ מולטיפוטונים מאפשר רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה, פחות נזקי אור והדמיית חדירה מוגברת של רקמות לחקר אירועים ביולוגיים דינמיים בתוך האיברים. זהו כלי מיקרוסקופיה אידיאלי להדמיית בעלי חיים חיים. עם זאת, מולטיפוטון וכל אמנות אחרת של מיקרוסקופיה תוך חיונית מוגבלת על ידי תנועת רקמות עקב פעימות לב, נשימה, תנועות פריסטלטיות, טונאליות שרירים ותפקודים פיזיולוגיים אחרים, מה שמפריע לרכישת הדימות ולניתוחו. מכיוון שתנועות אלה פוגעות ברזולוציה הזמנית והמרחבית ולעיתים אף אוסרות על ניתוח עוקב, יש להתייחס אליהן כראוי כדי לאפשר ניתוח ופרשנות מדויקים של נתונים. מספר אסטרטגיות פותחו כדי להוריד או למנוע ממצאים מתנועת רקמות. פרוטוקול זה מיישם תוכנה לתיקון סחף באתרו בשם VivoFollow⁹ כדי לתקן סחף רקמות במהלך רכישת תמונה. גישה זו מספקת את ייצוב התמונה הנדרש, ומאפשרת הדמיה ארוכת טווח וניתוח מעקב אחר תאים.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי הוועדה הבווארית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אושר על ידי הקוד האתי: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); ניסויים אלה בוצעו בהתאמה קפדנית להנחיות החקיקה הגרמנית בנושא בעלי חיים.

1. בעלי חיים וקשירת עורק הירך (FAL)

הערה: כדי לגרום לדלקת סטרילית ולדלקת עורקים, נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני 8-10 שבועות. אף אחד מהעכברים לא מת או סבל מזיהום פצעים או מהפרעה בריפוי פצעים במהלך או אחרי ניתוח FAL או דמה, בהתאמה.

1. הרדמה
   הערה: לפני הזרקת הרדמה MMF-mix, מומלץ להרדים תחילה עם איזופלורן 5% עד שהעכבר ישן.
   1. שקלו את העכבר והכינו תערובת MMF עם מינון של מידזולם 5.0 מ"ג/ק"ג, מדטומידין 0.5 מ"ג/ק"ג ופנטניל 0.05 מ"ג/ק"ג.
   2. ממלאים מזרק 1 מ"ל במיקס MMF ומזריקים נפח סופי של 100 μL s.c. באמצעות מחט 30 גרם (לאחר הרדמה עם 5% איזופלורן).
   3. הניחו את העכבר על כרית חמה והמתינו עד שהעכבר מורדם לחלוטין. כוונו את הטיימר ל-35 דקות. לאחר זמן זה, להזריק s.c. מחצית המינון (50 μL) של MMF-mix.
   4. בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת הדוושה והרפלקסים הבין-דיגיטליים (על ידי צביטת בוהן מוצקה) של העכבר.
      הערה: היעדר תגובה מצביע על עומק מספיק של שיכוך כאבים.
2. קשירת עורק הירך (FAL)
   הערה: יש להשתמש בכלי ניתוח סטריליים ובתפרים. יש לחטא את העור בחומר חיטוי לפני הפתיחה ולאחר הסגירה.
   1. הניחו את העכבר המרדים על פלטת חימום (35-37°C) כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הפיזיולוגית. יש למרוח קרם עיניים (דקספנתנול) על כל עין כדי למנוע התייבשות של העיניים תחת הרדמה.
   2. העבירו את העכבר המרדים לתא דימות דופלר לייזר (LDI) לפני ואחרי FAL כדי לבדוק את זרימת הדם והזילוח (איור 1A-C).
   3. הסר שיער, חטא את העור ובצע חתך כדי לגשת לעורק הירך. תחת מיקרוסקופ כירורגי, יש לקשור את עורק הירך הימני של הגפה האחורית של העכבר באמצעות תפר משי קלוע (7-0) ולבצע ניתוח דמה בעורק הירך השמאלי כדי לשמש כבקרה פנימית כפי שתואר קודם לכן⁶ (איור 1D-K).
      הערה: החתך בעור נעשה באמצעות מספריים קטנים כדי למנוע פגיעה ישירה בכלי הדם הקרובים לעור.
   4. סוגרים את העור באמצעות תפר משי קלוע (6-0). יש לתת buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) s.c. כל 12 שעות, החל 10 דקות לפני אנטגוניזם את ההרדמה להקלה על הכאב. התבונן בבעל החיים לאותות של כאב, כלומר, פעילות טיפוח מופחתת, חוסר רצון לזוז, או יציבה כפופה במשך 24 שעות לאחר הניתוח.
   5. הזריקו (s.c.) שילוב של נלוקסון (1.2 מ"ג/ק"ג), פלומזניל (0.5 מ"ג/ק"ג) ואטיפמזול (2.5 מ"ג/ק"ג) כדי לנטרל את ההרדמה לאחר סיום ה-FAL וסגירת העור.
   6. לאחר הניתוח, יש להשאיר את העכבר על הכרית החמה ולהשגיח ברציפות על בעל החיים עד שהוא יכול לשמור על יציבה זקופה ולהתחיל ללכת כרגיל סביב הכלוב.
   7. כאשר העכבר ער לחלוטין, החזירו אותו לכלוב יחד עם העכברים האחרים והחזירו את הכלוב לחדר המגורים של בעלי החיים.

2. הכנת רקמות להדמיה תוך-חיונית של מולטיפוטונים

1. הזרקת ורידים בזנב
   הערה: בעל החיים צריך להיות תחת הרדמה לפני תחילת ההכנה להדמיה תוך חיונית. לפני החדרת המחט של קטטר הווריד, מומלץ להחיל חומר חיטוי העור על הזנב. זה גם יעזור לדמיין את כלי.
   1. הכינו צנתר הזרקת ורידים זנב באמצעות מחט 2 x 30 גרם, 10 ס"מ של צינור פוליתן דק (קוטר פנימי 0.28 מ"מ וקוטר חיצוני 0.61 מ"מ), מזרק 1 מ"ל ודבק היסטואקריל כדי לקבע את הצנתר על זנב העכבר להזרקות i.V נוספות במהלך הדמיה (איור 2A,B ואיור 2F).
   2. הכן את תמיסת הנוגדנים להזרקת i.v: CD45-PE ו- CD41-FITC (20 מיקרוגרם / עכבר) בנפח סופי של 100 μL.
   3. בדוק את הזנב עבור ורידי הזנב הממוקמים לרוחב וסכר את הווריד כדי לזהות את וריד הזנב. חיטאו את הזנב, הכניסו את צנתר הווריד וקבעו אותו באמצעות דבק היסטואקריל רקמתי (איור 2B).
   4. יש להזריק את הנוגדנים לפני ההדמיה (לפחות 15 דקות לפני) ולאחר סיום הכנת הרקמות.
2. הכנת רקמות
   הערה: יש להשתמש תמיד בפד חם ולתת טיפת קרם עיניים (דקספנתנול) בכל עין לפני הכנת הרקמות. השתמש בכלי ניתוח סטריליים ותפרים. יש לחטא את העור בחומר חיטוי לפני הפתיחה ולאחר הסגירה.
   1. הניחו את העכבר המורדם על פד יציב ונייד. תקנו את העכבר במצב שכיבה עם קיבוע של 4 נקודות על הפד באמצעות סרט הדבקה (איור 2B).
   2. עצבו שתי חתיכות של חימר מידול והניחו את החתיכות מתחת לגפה האחורית העליונה של העכבר כדי להבטיח מיקום מישורי של שריר האדוקטור (איור 2B, מסומן על-ידי חיצים אדומים).
   3. כדי להבטיח טמפרטורת גוף יציבה של 37°C של העכבר, הניחו את הפד עם העכבר על פלטת חימום מתחת למיקרוסקופ כירורגי עם זום של פי 0.64-4.0 (איור 1L).
   4. הסירו את השיער משתי הרגליים, חיטאו את העור וחתכו את העור במעגל סביב הצלקת של קשירת עורק הירך הקודמת של הגפה האחורית הימנית (איור 1M).
   5. הסירו את העור ואת שכבת השומן מהחלק העליון של הרגל (איור 1N,O), ומשכו הצידה את העור שנותר באמצעות תפרים כדי ליצור כיס סביב שריר ה-adductor (איור 1P,Q).
   6. הסירו שומן תת-עורי כדי לקבל ראייה ברורה של שריר האדוקטור והעורק/וריד העמוקים, כמו גם של כלי הדם הנלווים (איור 1Q,R).
   7. התחילו בזהירות להסיר את שכבת השריר השטחית שמעל כלי הדם הצדיים על-ידי חתכתם אותה בזהירות בעזרת מלקחיים עדינים (איור 1R).
      הערה: העורק הקולטרלי והווריד הקולטרלי נראים בבירור ומוכנים להדמיה (איור 1S).
   8. מלאו את הכיס המוכן במי מלח כדי למנוע התייבשות של הרקמה והמשיכו באותו הליך עבור הגפה האחורית השמאלית המופעלת בדמה. לפני ההדמיה, הוסיפו ג'ל על-קולי בשני הכיסים, שמונע התייבשות ומשמש כמדיום טבילה לצימוד אופטי עם המטרה (איור 2C ואיור 2F).

3. מיקרוסקופ מולטיפוטון תוך חיוני

1. הכנה
   הערה: שמור מזרק עם ג'ל קולי בתוך תא האינקובטור של המיקרוסקופ כדי לשמור על טמפרטורה חמה למילוי מחדש של הכיסים במהלך הדמיה לטווח ארוך.
   1. הסירו את המלח משני הכיסים המוכנים והחליפו אותו בג'ל על-קולי כדי לכסות את כלי הדם הנלווים (איור 2C).
   2. להזריק את תמיסת הנוגדנים דרך קטטר וריד הזנב. 15 דקות לאחר הזרקת הנוגדנים, העבירו את הפד עם העכבר הקבוע לתוך תא הדמיה מולטיפוטון מחומם (איור 2F).
   3. לאחר השלמת רכישת התמונה, להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם תחת נרקוזיס עמוק.
2. רכישת תמונה במיקרוסקופ מולטיפוטון
   הערה: הפעל את המיקרוסקופ 30 דקות לפני ההדמיה כדי לאפשר ייצוב לייזר. לקבלת היציבות האופטית הטובה ביותר של המיקרוסקופ, מומלץ לשמור על תא המיקרוסקופ מחומם לצמיתות.
   1. הפעילו את המפתח של קופסת הלייזר Ti:Sapphire, את קופסאות הממשקים האלקטרוניים, את יחידת החימום של תא הדגירה, את מנורת הפלואורסצנט ואת המחשב (איור 2D,E).
   2. הפעל את תוכנת הרכישה (תוכנת מפקח). כוונו את אורך הגל ל-800 ננומטר ופתחו את תריס המיקרוסקופ (איור 3A ii).
   3. בתיבת הדו-שיח 'אשף המדידה', בחרו 'מצב מכשיר' (אלומה יחידה) ו'מצב מדידה' (קיטועי זמן לסריקה תלת-ממדית) (איור 3A i).
   4. מעבירים את העכבר המרדים לתא הדגירה המחומם מראש של המיקרוסקופ. מקמו את האזור עם הג'ל העל-קולי (שלב 2.2.8) ישירות במגע עם העדשה הקדמית האובייקטיבית (איור 2F).
   5. פתח את תריס המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי, בחר מסנן מתאים / הגדרה דיכרואית להדמיית FITC (4) כדי למצוא את אזור העניין על ידי מעקב אחר זרימת הדם תחת תאורה אפיפלואורסצנטית. לאחר הכנסת אזור העניין לשדה הראייה המרכזי, סגרו את תריס המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי.
   6. בתיבת הדו-שיח xy-Scanner, הגדר את הפרמטרים הבאים: גודל תמונה (554x554), פיקסל (512x512), תדירות (400), ממוצע קו (1) (איור 3A iii). כוונן את עוצמת הלייזר (5%) (איור 3A iv), והגדר את רווח מכפיל האור (PMT) עבור הערוצים ירוק (66), אדום (66) וכחול (63) (איור 3A v).
   7. בחר יעד מתאים להגדרות הדמיה תוך-חיונית ותיקון סחף (ראה פירוט ב-3.2.11).
      הערה: כאן, המטרה שנבחרה הייתה Nikon LWD 16x (איור 3A vi).
   8. הגדירו את טווח אוסף התמונות באמצעות הפעלת מצב רכישת התצוגה המקדימה בלחיצה על הלחצן האדום בפינה השמאלית העליונה של חלון הדו-שיח 'אשף המדידות ' (איור 3A i).
   9. הגדר את האזור ואת המבנה של עניין על ידי התמקדות כדי לקבל תמונה טובה. לאחר מכן, תוך כדי התבוננות במסך, שנו את המיקוד על ידי הזזת המטרה כלפי מעלה עד להיעלמות התמונה, והגדירו אותה כאפס (ראשון=0). שנו את המיקוד בכיוון ההפוך על-ידי הזזת המטרה כלפי מטה עד שהתמונה תיעלם שוב מהמסך, והגדירו אותה כמיקום האחרון (סוף=40 מיקרומטר) בכיוון הצירי (איור 3A vii).
   10. הגדר את גודל המדרגה ל- 2 מיקרומטר. לחצו על הלחצן האדום בפינה השמאלית העליונה של תיבת הדו-שיח 'אשף המדידות ' כדי להפסיק את סריקת התצוגה המקדימה.
       הערה: מספר התמונות יחושב ויוגדר באופן אוטומטי (21 תמונות), כפי שמצוין באיור 3A vii.
   11. אם המיקרוסקופ מצויד בתיקון סחף חי⁹, הפעל את תוכנת תיקון הסחף (לדוגמה, VivoFollow) ובצע את השלבים המתוארים להלן.
       1. בתיבת הדו-שיח אשף המדידה, בחרו בציר Python (Python Ax) (איור 3A viii) כהתקן הציר הראשון; אל תפעיל את מצב השמירה האוטומטי. סמן את תיבת השמירה האוטומטית (AS) רק בציר הזמן (Time Time). לחץ על סמל Python בחלון Available Devices (איור 3A ix) כדי לפתוח את חלון הדו-שיח Python.
       2. בהגדרות ציר הדו-שיח Python , הזן From (0 zero) ו- To ( - 40). הזן את מספר השלבים (21) כפי שמצוין באיור 3A x.
       3. עבור אל חלון הדו-שיח xyz שלב Z והגדל את טווח הסריקה ב- 200 מיקרומטר בשני הקצוות: בהתחל, הזן (200 מיקרומטר) ובסוף, הזן (-240 מיקרומטר), הטווח יוגדר אוטומטית (-440 מיקרומטר). שמור על גודל המדרגה (2 מיקרומטר) כפי שמוצג באיור 3A xi.
       4. פתחו את תיבת הדו-שיח VivoFollow Frontend ולחצו על התיבה Motion Profile (איור 3A xii).
       5. התחל רכישת תמונה על-ידי לחיצה על ראש החץ הירוק בפינה השמאלית העליונה של תיבת הדו-שיח אשף המדידה של תוכנת המפקח (איור 3A i).
       6. אם נעשה שימוש בתיקון סחף חי, חפש תיבת דו-שיח שבה תצורת תיקון הסחף תופיע כפי שמוצג באיור 3A xiii. הגדר את ערוץ הרכישה שישמש כהפניה לציון דרך לא נייד (עבור פרוטוקול זה, בחר ערוץ 2, שבו יש להקליט את אות נותב כלי הדם). הזינו את הסטת התיקון המרבית במיקרומטר שנוספה למיקום z הראשון והאחרון (כאן, 200 מיקרומטר) ולחצו על הלחצן ' אשר'.
       7. נטרו את הסטת הסחף הנוכחית ב-x, y ו-z בזמן אמת במהלך רכישת התמונה בחלון הדו-שיח הקדמי של VivoFollow איור 3A xiv.
       8. הפסק את רכישת ההדמיה לאחר ~ 35 דקות כאשר נדרש מחזור נוסף של הזרקה חוזרת של הרדמה. הזריקו חצי מנה של MMF-mix (50 μl s.c) והתחילו מחדש את רכישת ההדמיה על ידי לחיצה נוספת על ראש החץ הירוק (שלב 3.2.11.5).
       9. חזור על הליך זה עד לסיום הניסוי.

תוצאות

מיקרוסקופ מולטיפוטונים מציע רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה למעקב אחר לויקוציטים, שבו ניתן לעקוב אחר שלבי נדידת תאים ומהירותם ולנטר אותם (איור 4A,B). עם זאת, התנועה הפיזיולוגית של הדגימה מהווה אתגר, במיוחד עבור רכישות ארוכות טווח של תמונות מיקרוסקופיה תוך חיונית. לכ...

Discussion

השיטה המתוארת של ניתוח multiphoton in vivo של גיוס לויקוציטים מייצגת תוספת לכלים נפוצים למחקרי גיוס לויקוציטים כגון ניתוחים היסטולוגיים (חיסוניים) או FACS. בשיטת הדמיה זו, ניתן לדמיין בפירוט רב יותר את התהליכים הדינמיים בהידבקות לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך ארטריוגנזה¹⁰. למרות ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (7-0)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9