הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ובצירי עצם מבודדים

Summary

פרוטוקול זה מציג בדיקת ספיגת חומצות אמינו עם תווית רדיו, אשר שימושית להערכת צריכת חומצות אמינו בתאים ראשוניים או בעצמות מבודדות.

Abstract

התפתחות העצם וההומאוסטזיס תלויה בהתמיינות ובפעילות של אוסטאובלסטים יוצרי עצם. התמיינות אוסטאובלסט מאופיינת ברצף על ידי התפשטות ואחריה סינתזת חלבונים ובסופו של דבר הפרשת מטריצת עצם. התפשטות וסינתזת חלבונים דורשות אספקה מתמדת של חומצות אמינו. למרות זאת, מעט מאוד ידוע על צריכת חומצות אמינו באוסטאובלסטים. כאן אנו מתארים פרוטוקול רגיש מאוד שנועד למדוד צריכת חומצות אמינו באמצעות חומצות אמינו מסומנות ברדיו. שיטה זו מותאמת לכימות שינויים בספיגת חומצות אמינו הקשורים להתרבות או התמיינות של אוסטאובלסט, טיפולים תרופתיים או גורמי גדילה, או מניפולציות גנטיות שונות. חשוב לציין שניתן להשתמש בשיטה זו לסירוגין כדי לכמת את צריכת חומצות האמינו בקווי תאים בתרבית או בתאים ראשוניים במבחנה או בפירי עצם מבודדים ex vivo. לבסוף, השיטה שלנו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי למדוד את ההובלה של כל חומצות האמינו, כמו גם גלוקוז וחומרים מזינים אחרים radiolabeled.

Introduction

חומצות אמינו הן תרכובות אורגניות המכילות קבוצות פונקציונליות של חומצות אמינו (-NH₂) וקרבוקסיל (-COOH) עם שרשרת צדדית משתנה הספציפית לכל חומצת אמינו. באופן כללי, חומצות אמינו ידועות כמרכיב הבסיסי של חלבון. לאחרונה הובהרו שימושים חדשים ותפקודים של חומצות אמינו. לדוגמה, חומצות אמינו בודדות יכולות לעבור מטבוליזם כדי ליצור מטבוליטים ביניים התורמים לביו-אנרגיה, מתפקדים כקופקטורים אנזימטיים, מווסתים מיני חמצן תגובתי או משמשים לסינתזה של חומצות אמינו אחרות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . מחקרים רבים מראים כי חילוף חומרים של חומצות אמינו הוא קריטי עבור פלוריפוטנטיות, שגשוג והתמיינות של תאים בהקשרים שונים 3,6,11,12,13,14,15,16,17^.

אוסטאובלסטים הם תאים מפרישים המייצרים ומפרישים את מטריצת העצם החוץ-תאית העשירה בקולגן מסוג 1. כדי לשמור על שיעורים גבוהים של סינתזת חלבונים במהלך היווצרות העצם, אוסטאובלסטים דורשים אספקה מתמדת של חומצות אמינו. כדי לענות על דרישה זו, osteoblasts חייב לרכוש באופן פעיל חומצות אמינו. בהתאם לכך, מחקרים אחרונים חושפים את החשיבות של ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים בפעילות אוסטאובלסטים וביצירת עצם 15,16,17,18,19,20.

אוסטאובלסטים רוכשים חומצות אמינו תאיות משלושה מקורות עיקריים: סביבה חוץ-תאית, פירוק חלבונים תוך-תאיים וביוסינתזה של חומצות אמינו דה-נובו. פרוטוקול זה יתמקד בהערכת ספיגת חומצות אמינו מסביבה חוץ-תאית. השיטות הנפוצות ביותר למדידת ספיגת חומצות אמינו מסתמכות על חומצות אמינו בעלות תווית רדיו (למשל, ³שעות או ¹⁴מעלות צלזיוס) או על איזוטופים כבדים המסומנים (למשל, ¹³מעלות צלזיוס). מבחני איזוטופומרים כבדים יכולים לנתח ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים בצורה יסודית ובטוחה יותר, אך לוקח להם זמן רב יותר להשלים מספר ימים מכיוון שלוקח יום להכין ולהפיק דגימות ומספר ימים לנתח בספקטרומטר המסה בהתאם למספר הדגימות^21,22. לשם השוואה, מבחני ספיגת חומצות אמינו מסומנים ברדיו אינם אינפורמטיביים לגבי חילוף החומרים במורד הזרם, אך הם זולים ומהירים יחסית, וניתן להשלים אותם תוך 2-3 שעות מתחילת הניסוי^23,24. כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי הניתן לשינוי בקלות, שנועד להעריך קליטת חומצות אמינו בתרבית או בקווי תאים במבחנה או בצירי עצם בודדים ex vivo. ניתן להרחיב את היישום של שני פרוטוקולים אלה לחומצות אמינו אחרות המסומנות ברדיו ולסוגי תאים ורקמות אחרים הקשורים לעצמות.

Protocol

כל הליכי העכבר המתוארים כאן אושרו על ידי ועדות המחקר בבעלי חיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן בדאלאס. פרוטוקול הקרינה אושר על ידי הוועדה המייעצת לבטיחות קרינה במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן בדאלאס.

1. ספיגת חומצות אמינו בתאים (פרוטוקול I)

1. צלחת 5 x 10⁴ תאי ST2 בכל באר של צלחת תרבית רקמה 12 בארות. תאי צלחת ב-α-MEM המכילים 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-0.1 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (Pen/Strep). צלחת בארות נוספות של תאים כדי לכמת את מספר התא לכל תנאי עבור הנורמליזציות בשלב 1.12. דגירה של תאים באינקובטור של תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
2. תרבית את התאים במשך 2-3 ימים עד למפגש.
3. ביום הניסוי, הכינו את הפתרונות הבאים: 1x פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.4 וחיץ קרבס רינגרס HEPES (KRH), pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl₂, NaHCO₃, 5 mM HEPES, 1 mM D-גלוקוז). מחממים ל-37 מעלות צלזיוס.
4. שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של 1x PBS, pH 7.4.
   הערה: פרוטוקול זה מתאים גם לחלוקה מהירה של תאים שאינם מתמזגים. במקרה זה, חשוב לנרמל את הרדיואקטיביות למספר תאים מוחלט או לתוכן DNA. בנוסף, שקול להגדיל את גודל צלחת התרבית או בקבוק כדי להגדיל את מספר התא הכולל ואת ערכי cpm. זה חשוב כדי לקבוע אמפירית על בסיס אישי.
5. שאפו 1x PBS ושטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל KRH.
6. צור 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-מדיה עובדת של גלוטמין על ידי דילול 4 μL של [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-גלוטמין לכל ¹ מ"ל של KRH.
   הערה: לפני השימוש בחומרים רדיואקטיביים, אנא צור קשר עם המשרד לבטיחות קרינה במוסד הבית שלך כדי לקבל אישורים. כל ההליכים הקשורים לקרינה חייבים להתבצע מאחורי מגן הפרספקס.
7. דגירה של תאים עם 0.5 מ"ל של KRH המכילים 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-מדיה עובדת גלוטמין במשך 5 דקות.
8. לאסוף את המדיום הרדיואקטיבי ולטפטף לתוך מיכל פסולת נוזלית. שטפו את התאים שלוש פעמים לזמן קצר עם KRH קר כקרח כדי לסיים את התגובה. לאסוף ולהשליך את כל השטיפות במיכל פסולת נוזלית רדיואקטיבית.
9. הוסיפו 1 מ"ל של 1% SDS לכל באר וטריטוראט פי 10 כדי לליז ולהומוגניזציה של התאים. העבר את התא lysates ל 1.5 מ"ל צינורות. יש להשליך צלחות תרבית תאים, פיפטות סרולוגיות וקצות פיפטה במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה.
10. צנטריפוגה ב->10,000 x גרם למשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנטים לבקבוקוני ה-scintillation המכילים 8 מ"ל מתמיסת ה-Scintillation. מערבבים על ידי ניעור בקבוקוני הנצנוץ במרץ. יש להשליך צינורות וקצות פיפטה במיכל פסולת רדיואקטיבית מוצקה.
11. קרא רדיואקטיביות בספירות לדקה (cpm) באמצעות מונה Scintillation. יש להשליך את בקבוקוני ה-Scintillation במיכל פסולת הבקבוקונים של Scintillation.
12. טריפסיניזציה, החייאה וספירה של התאים מהלוחות הלא רדיואקטיביים הנותרים של התאים (ראו שלב 1.1) כדי להעריך את מספר התאים בתרביות הרדיואקטיביות המוזנחות. באמצעות המוציטומטר, לספור את מספר התאים לכל באר לא רדיואקטיבית עבור כל מצב ניסיוני. נרמל את ה-cpm משלב 1.11 למספר התא המשוער מהלוחות הלא רדיואקטיביים.
13. לאחר השלמת הניסוי, יש לפרק את מכסה המנוע של תרבית התאים, הספסל וכל המכשירים באמצעות תרסיס רדיואקטיבי. לבסוף, בצע בדיקות מחיקה כדי לוודא שאזור העבודה נקי מקרינה.

2. ספיגת חומצות אמינו ברקמות עצם שבודדו טריות (פרוטוקול II)

1. מחממים KRH ל-37 מעלות צלזיוס.
2. להרדים עכבר בן 3 ימים ולהסיר את העור על הזרועות. יש לפרק את ההומרי מהכתף באמצעות מספריים ולנתח את שני ההומרים. הסר את כל הרקמות extemporaneous באמצעות אזמל ומלקחיים. הסר את epiphyses מן העצם.
   הערה: בנוסף ל- humerii, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לפמורה ילודים, tibiae ו calvariae, כמו גם humerii, פמורה ו tibiae מבודדים מעכברים בני 2 ו -4 חודשים (נתונים שלא פורסמו).
3. יש לשטוף את מח העצם מהעצם ולשקול את פירי העצם כדי לנרמל בשלב 2.14.
4. מרתיחים הומרוס אחד ב-PBS אחד בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להפוך את העצם לשונה. עצם מבושלת decellularized משמש שליטה שלילית.
   הערה: כבקרת איכות, פרפין מטמיע את העצמות המבושלות והלא מבושלות לכתמים היסטולוגיים כדי לאשר חזותית שהרתחה הייתה יעילה בדה-צלוליזציה של העצם.
5. שיווי משקל הן humeri ב 1 מ"ל של KRH במשך 30 דקות באינקובטור תרבית התא ב 37 מעלות צלזיוס.
6. צור פתרון עובד של 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-ארגינין ב-KRH על-ידי דילול 4 μL של 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- מלאי ארגינין לכל 1 מ"ל KRH.
   הערה: פרוטוקול זה מתאים כדי להעריך את הספיגה של כל חומר מזין עם תווית רדיו שנבחר. L-[2,3,4-3 H]-גלוטמין, L-[¹⁴C_U]-אלנין ו-L-[2,3-3 H]-פרולין נבדקו עם תוצאות דומות. נתוני ארגינין מוצגים כדי להדגיש את התועלת של פרוטוקול זה.
   התראה: כל ההליכים באמצעות קרינה חייבים להתבצע מאחורי מגן הפרספקס תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE).
7. דגירה הן של עצם הבקרה הניסיונית והן של עצם הבקרה המבושלת בנפרד ב-KRH המכילה 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-ארגינין למשך עד 90 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
   הערה: חשוב לקבוע באופן אמפירי את זמני הדגירה עבור תנאים שונים, כולל גיל העכברים, אלמנטים שונים בשלד וסוגי חומצות אמינו radiolabeled על ידי ביצוע קורס זמן. הרוויה מתרחשת לרוב לאחר כ-3-4 שעות. יש להעריך את הקליטה בנקודת זמן בזעם הליניארי של הקליטה.
8. יש להסיר את המדיום הרדיואקטיבי ולהשליך למיכל הפסולת הרדיואקטיבית הנוזלית. יש לשטוף את humeri שלוש פעמים באמצעות קור כקרח 1 מ"ל של KRH כדי לסיים את התגובה. יש להשליך את כל השטיפות במיכל הפסולת הרדיואקטיבית הנוזלית.
9. מעבירים כל עצם לצינור של 1.5 מ"ל. הוסף 500 μL של מאגר RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8.0); 0.5% NP40 (v/v); 0.5% DOX (w/v); 0.1% SDS (w/v)]. השליכו את לוחות התרבית, הפיפטות הסרולוגיות וקצות הפיפטה במיכל פסולת מוצקה רדיואקטיבית.
10. הומוגני את humeri על ידי קיצוץ 100 פעמים עם מספריים במאגר RIPA.
11. סוניקט (משרעת: 35%, דופק 1 שניות) העצם ההומוגנית המתקבלת במשך 10 שניות.
    הערה: סוניקציה ידועה גם כמייצרת אירוסולים. ניתן לבצע צעדי סוניקציה בארון בטיחות ביולוגי. כדי להפחית את היווצרות אירוסול, חשוב לא למלא את הצינורות. סוניקציה של נפחי דגימה קטנים עלולה לגרום לסוניקציה לא שלמה או לאובדן דגימה עקב קצף. אם מתרחשת הקצפה, צנטריפוגה את הדגימה במשך 5 דקות כדי לשקוע.
12. להבהיר את הליזאט על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב >10,000 x גרם בטמפרטורת החדר. מעבירים 200 μL של ה-supernatant לבקבוקוני scintillation המכילים 8 מ"ל של תמיסת ה-scintillation. מערבבים על ידי ניעור בקבוקוני הנצנוץ במרץ. השליכו את כל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה (למשל, צינורות משומשים, קצוות פיפטה, צלחות וכו') במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה.
13. קרא רדיואקטיביות (cpm) באמצעות מונה Scintillation. יש להשליך בקבוקוני scintillation משומשים במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המיועד לבקבוקוני scintillation.
14. הפחת את ה- cpm של עצם מבושלת (ערך בסיסי) מה- cpm של עצם ניסיונית. לנרמל את הרדיואקטיביות עם משקל העצם משלב 2.3.
15. רססו את מכסה המנוע, המכשירים והספסל של תרבית התאים בחומר מתפרק רדיואקטיביות. בצע בדיקות מחיקה כדי לוודא שאזור העבודה נקי מקרינה.

תוצאות

הובלת חומצות אמינו מווסתת על ידי מובילי חומצות אמינו רבים הקשורים לממברנה אשר סווגו למערכות הובלה נפרדות המבוססות על מאפיינים רבים, כולל ספציפיות מצע, קינטיקה, כמו גם תלות יונים ו- pH²⁵. לדוגמה, ספיגת גלוטמין יכולה להיות מתווכת על ידי מערכות ההובלה התלויות Na+ A, ASC, γ+L ו- N או ?...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה מהירה ורגישה להערכת ספיגת חומצות אמינו בתגובה לתמורות ניסיוניות שונות במבחנה או ex vivo. בהשוואה לערכות הזמינות מסחרית (למשל, גלוטמין וערכת קביעת גלוטמט), שיטה זו הרבה יותר רגישה, מהירה ופחות דורשת^{עבודה של 16,17,25}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200
12-well plate	Corning	3513
1 mL syringe	BD precision	309628
30G Needle	BD precision	305106
Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi	PerkinElmer	NET1123001MC
Beckman LS6500 scintillation counter
Calcium chloride	Sigma	C1016
Choline chloride	Sigma	C7077
D-(+)-Glucose solution	Sigma	G8769
Dissection Tool			Forceps, scissors, scapels
DPBS	Gibco	14190
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E9884
HEPES(1M)	Gibco	15630
L-[3,4-3H(N)]-Glutamine	PerkinElmer	NET551250UC
Liquid scintilation vials	Sigma	Z190535
Lithium chloride solution, 8M	Sigma	L7026
Magnesium chloride	Sigma	M8266
MEMα	Gibco	12561
Microcentrifuge tube, 15mL	Biotix	89511-256
NP-40	Sigma	492016
Potassium chloride	Sigma	P3911
Sodium bicarbonate	Sigma	S6014
Sodium chloride	Sigma	S9888
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	436143
Sonicator	Sonic&Materials	VCX130
Tris Base	Sigma	648311
Ultima Gold (Scintillation solution)	PerkinElmer	6013329
α-(Methylamino)isobutyric acid	Sigma	M2383