JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

Abstract

הידבקות מתגלגלת, הקלה על ידי אינטראקציות בתיווך סלקטיבי, היא תנועתיות דינמית מאוד, פסיבית בגיוס לויקוציטים לאתר של דלקת. תופעה זו מתרחשת venules postcapillary, שבו זרימת הדם דוחפת לויקוציטים בתנועה מתגלגלת על תאי האנדותל. גלגול יציב דורש איזון עדין בין היווצרות קשר הידבקות לבין הניתוק המכני שלהם, ומאפשר לתא להישאר מחובר לפני השטח תוך כדי גלגול לכיוון הזרימה. שלא כמו תהליכי הידבקות אחרים המתרחשים בסביבות סטטיות יחסית, הידבקות מתגלגלת היא דינמית מאוד כאשר התאים המתגלגלים נעים על פני אלפי מיקרון בעשרות מיקרון לשנייה. כתוצאה מכך, שיטות מכניות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה אינם מתאימים למדידת אירועי הידבקות בודדים ואת הכוחות המולקולריים הקשורים בשל ציר הזמן הקצר ורגישות גבוהה הנדרשים. כאן, אנו מתארים את היישום האחרון שלנו של טביעת הרגל הידבקות assay כדי לדמיין את P-selectin: אינטראקציות PSGL-1 בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית. שיטה זו משתמשת רצועות מד מתח מבוססות DNA בלתי הפיכות כדי לייצר היסטוריה קבועה של אירועי הידבקות מולקולרית בצורה של מסלולי פלואורסצנטיות. ניתן לדמיין מסלולים אלה בשתי דרכים: (1) תפירת אלפי תמונות מוגבלות עקיפה כדי לייצר שדה ראייה גדול, המאפשרת הפקת טביעת רגל של הידבקות של כל תא מתגלגל לאורך אלפי מיקרון, (2) ביצוע DNA-PAINT כדי לשחזר תמונות ברזולוציית-על של מסלולי הפלואורסצנטיות בתוך שדה ראייה קטן. במחקר זה, נעשה שימוש ב-90% מטביעת הרגל של הידבקות כדי לחקור תאי HL-60 המתגלגלים בלחצי גיסה שונים. בעשותנו כן, הצלחנו לדמיין את ההתפלגות המרחבית של P-selectin: אינטראקציית PSGL-1 ולקבל תובנה על הכוחות המולקולריים שלהם באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות. לפיכך, שיטה זו מספקת את היסודות לחקירה כמותית של אינטראקציות פני התא השונות המעורבות בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית.

Introduction

מפל ההדבקה המתגלגל מתאר כיצד תאים במחזור לקשור ולהתגלגל לאורך קיר כלי הדם1. גלגול פסיבי הוא בעיקר בתיווך selectins, מחלקה עיקרית של מולקולות הידבקות הסלולר (CAMs)1. תחת זרם הגיזה של דם, לויקוציטים המבטאים P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1) יוצרים קשרים ארעיים מאוד עם P-selectin, אשר עשוי לבוא לידי ביטוי על פני השטח של תאי אנדותל מודלקים. תהליך זה הוא קריטי עבור לויקוציטים לעבור לאתר של דלקת2. בנוסף, PSGL-1 הוא גם קולטן mechanosensitive מסוגל להפעיל את שלב הידבקות המשרד הבאים של מפל הידבקות מתגלגל על מעורבותו עם P-selectin3.

מוטציות גנטיות המשפיעות על תפקוד CAM יכולות להשפיע קשות על המערכת החיסונית, כגון במחלה הנדירה של מחסור בהידבקות לויקוציטים (LAD), שבה תקלה במולקולות הידבקות המתווכות בגלגול מובילה לאנשים אימונו-מוגעים קשות4,5,6. בנוסף, תאים סרטניים במחזור הוכחו לנדוד בעקבות תהליך גלגול דומה, המוביל גרורות7,8. עם זאת, מכיוון שגלגול תאים הוא מהיר ודינמי, שיטות מכניות ניסיוניות קונבנציונליות אינן מתאימות לחקר אינטראקציות מולקולריות במהלך גלגול תאים. בעוד ששיטות מניפולציה של תאים יחידים ומולקולה אחת כמו מיקרוסקופיה של כוח אטומי ופינצטה אופטית הצליחו לחקור אינטראקציות מולקולריות כגון האינטראקציה התלויה בכוח של P-selectin עם PSGL-1 ברמת המולקולה הבודדת9, הן אינן מתאימות לחקירת אירועי הידבקות חיה במהלך גלגול תאים. בנוסף, האינטראקציה המאופיינת במבחנה אינה יכולה לענות ישירות על השאלה על הידבקות מולקולרית ב- vivo. לדוגמה, איזה טווח מתח מולקולרי רלוונטי מבחינה ביולוגית כאשר תאים מתפקדים בסביבתם הטבעית? שיטות חישוביות כגון סימולציית דינמיקה דבק10 או מודל מצב יציב פשוט11 לכדו פרטים מולקולריים מסוימים וכיצד הם משפיעים על ההתנהגות המתגלגלת אך תלויים מאוד בדיוק הפרמטרים וההנחות של המודל. טכניקות אחרות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה יכול לזהות כוחות במהלך נדידת תאים אבל לא מספקים רזולוציה מרחבית מספקת או מידע כמותי על מתח מולקולרי. אף אחת מהטכניקות הללו אינה יכולה לספק תצפיות ניסיוניות ישירות של הדינמיקה הזמנית, ההטרוגניות המרחבית וההטרוגניות בעוצמה של כוחות מולקולריים, המתייחסים ישירות לתפקוד התא ולהתנהגות בסביבתם הטבעית.

לכן, יישום חיישן כוח מולקולרי המסוגל למדוד במדויק אינטראקציות בתיווך סלקטיבי חיוני לשיפור הבנתנו של הידבקות מתגלגלת. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור טביעת הרגל הידבקות assay12 שבו חרוזים מצופים PSGL-1 מגולגלים על משטח המציג p-selectin פונקציונלי מד צמיגים (TGTs)13. TGTs אלה הם חיישני כוח מבוססי DNA בלתי הפיכים שגורמים להיסטוריה קבועה של אירועי קרע בצורה של קריאת פלואורסצנטיות. זה מושג באמצעות הקרע של TGT (dsDNA) ולאחר מכן תיוג לאחר מכן של TGT קרוע (ssDNA) עם גדיל משלימה תווית פלואורסצנטית. אחד היתרונות העיקריים של מערכת זו הוא התאימות שלה הן להדמיה מוגבלת עקיפה והן עם רזולוציית-על. הגדיל המשלים המסומן באופן פלואורסצנטי יכול להיות מאוגד לצמיתות (>12 bp) להדמיה מוגבלת עקיפה או כבול באופן חולף (7-9 bp) להדמיה ברזולוציית-על באמצעות DNA PAINT. זוהי מערכת אידיאלית לחקור הידבקות מתגלגלת כמו TGTs נקרעים במהלך גלגול פעיל, אבל קריאת פלואורסצנטיות מנותח לאחר גלגול. שתי שיטות ההדמיה מספקות גם למשתמש יותר חופש לחקור הידבקות מתגלגלת. בדרך כלל, הדמיה מוגבלת עקיפה שימושית לחילוץ כוח קרע מולקולרי באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות13, ואילו הדמיה ברזולוציית-על מאפשרת ניתוח כמותי של צפיפות הקולטן. עם היכולת לחקור תכונות אלה של הידבקות מתגלגלת, גישה זו מספקת פלטפורמה מבטיחה להבנת מנגנון ויסות הכוח על הידבקות מולקולרית של תאים מתגלגלים תחת זרימת גיסת.

Protocol

1. תיוג והיברידיה של אוליגונוקלאוטיד

  1. הפחתת קשרים דיסולפידים של חלבון G
    1. יש להמיס 10 מ"ג חלבון G (ProtG) ב-1 מ"ל של מים אולטרה-תותים.
      הערה: החלבון G כאן משתנה עם שאריות ציסטאין בודדות בטרמינל C ותג פולי-היסטידין N-טרמינוס.
    2. חילופי חוצצים ≥20 μL של ProtG (10 מ"ג /מ"ל) לתוך 1x PBS (pH 7.2) עם עמודת P6.
    3. מדוד את ריכוז החלבון לאחר חילופי חיץ.
      הערה: ריכוז אופייני של 7-8 מ"ג/מ"ל.
    4. הכן 120 mM טריס (2-קרבוקסיתיל)פוספין (TCEP) על ידי המסת 3 מ"ג TCEP לתוך 90 μL של 1x PBS (pH 7.2) ואחריו 10 μL של 0.5 M EDTA.
      הערה: TCEP צריך להיות מוכן טרי.
    5. הוסף 4 μL של 120 mM TCEP (480 נמול) ל 20 μL של ProtG (4-5 נמול).
      הערה: כוון ליחס טוחנת של ~ 100:1 TCEP לחלבון.
    6. אפשר לתגובה להמשיך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    7. הסר TCEP עודף מה- ProtG המופחת עם עמודת P6 (מאגר שהוחלף ב- 1x PBS, pH 7.2).
    8. למדוד את הריכוז של ProtG מופחת עם ספקטרופוטומטר UV / Vis ולשמור את הספקטרום.
      הערה: ריכוז אופייני של 3.5-4.5 מ"ג/מ"ל.
  2. תגובת SSDNA עם סולפו-SMCC עם תוויות אמין
    1. יש להמיס ssDNA (amine-ssDNA) עם תווית אמין במים נטולי נוקלאז לריכוז של 1 מ"מ. אמת את ריכוז הגדילים עם ספקטרופוטומטר UV/Vis.
    2. הכן 11.5 mM סולפו-SMCC (קישור הטרו-ביפונקטורי עם אסתר סולפו-NHS ו maleimide) פתרון טרי על ידי המסת 2 מ"ג של סולפו-SMCC ב 400 μL של מים אולטרה-סעיפים מערבולת לערבב.
    3. הוסף 6 μL של 1 mM אמין-ssDNA (6 נמול) כדי 5.2 μL של 11.5 מ"מ סולפו-SMCC (60 נמול) ו 88.8 μL של 1x PBS (pH 7.2). מערבולת עבור 5 s ואחריו צנטריפוגה ב 8600 x g במשך 3 דקות.
    4. אפשר לתגובה להמשיך במשך 30 דקות ב- RT.
    5. הסר עודף גופרתי-SMCC מן SMCC מצומד אמין-ssDNA (mal-ssDNA) עם עמודת P6 (חוצץ הוחלף 1x PBS, pH 7.2).
    6. למדוד את הריכוז של mal-ssDNA עם ספקטרופוטומטר UV / Vis ולשמור את הספקטרום.
      הערה: ריכוז אופייני של 35-45 מיקרומטר.
  3. הטיות ProtG-ssDNA
    1. הוסף 21 μL של 4.5 מ"ג / מ"ל פרוטG מופחת (3 נמול) למאל-SSDNA (~ 4-5 נמול).
      הערה: אמצעי אחסון וריכוזים כאן הם ערכים אופייניים. התאימו בהתאם למדידה ניסיונית אישית. תמיד להבטיח כמות עודפת של mal-ssDNA על ProtG ביחס של ~ 1.5:1.
    2. מערבולת עבור 5 s ולאפשר את התגובה להמשיך במשך 3 שעות ב RT.
  4. טיהור ואפיון ProtG-ssDNA
    1. לטהר את ProtG-ssDNA מצומד באמצעות בידוד תג שלו עם חרוזים מגנטי ניקל-nitrilotriacetic (Ni-NTA).
    2. הסר imidazole עודף (מאגר elution Ni-NTA) מהמוצר עם עמודת P6 (חוצץ הוחלף 1x PBS, pH 7.2).
      הערה: שלב זה חיוני לכימות ההטיות, שכן לאמידזול יש ספיגה משמעותית ב-280 ננומטר.
    3. השתמש בספקטרופוטומטר UV/Vis כדי להקליט את הספקטרום של המוצר ProtG-ssDNA, כמו גם את מאגר ה- Elution Ni-NTA (1x).
      הערה: ספיגת ProtG-ssDNA טיפוסית ב- 260 ננומטר ו- 280 ננומטר היא 0.8 ו- 0.6, בהתאמה.
    4. כדי לקבוע את יעילות ההטיה ואת היחס של ProtG ל- ssDNA, השתמש בתסריט MATLAB הכתוב בהתאמה אישית (קובץ קידוד משלים 1) כדי לפרק את ספקטרום המוצר הסופי בהתבסס על שלוש הספקטרום שנאסף בעבר (ProtG, SMCC-strand, חיץ חרוז Ni-NTA).
      הערה: בקצרה, הקוד פועל כמתואר בשלבים 1.4.5-1.4.8. הריכוז הטיפוסי הוא 4 מיקרומטר של ProtG-ssDNA עם ProtG ו- ssDNA ביחס טוחנת ~ 1:1 (איור 2A).
    5. Input ProtG, SMCC-strand, חיץ חרוז Ni-NTA, ואת ספקטרום ProtG-ssDNA UV/Vis לתוך סקריפט MATLAB
    6. בצע מזעור לא ליניארי רב-ממדי בלתי מרוסן כדי לשחזר את ספקטרום הספקטרום ProtG-ssDNA מפרטטרום המקור (ProtG, SMCC-strand, וספקטרום מאגר חרוז Ni-NTA)
      הערה: פונקציית המזעור מפיקה שלושה גורמי טרנספורמציה, אחד עבור כל ספקטרום מקור.
    7. לשחזר את ספקטרום ProtG-ssDNA על ידי הכפלת הספקטרום על ידי הגורם המתאים שלהם ושילוב ספקטרום המקור שהשתנה.
    8. הכפל את הריכוז הראשוני של ProtG ו- SMCC-גדיל על ידי גורמי הטרנספורמציה המתאימים כדי לקבוע את הריכוזים של SMCC-גדיל ו ProtG במוצר ProtG-ssDNA.
    9. (אופציונלי) הפעל דף מקורי לפי איור 2B כדי להבטיח שכל רכיב וצעד יפעלו כצפוי.
  5. הכלאה של TGT
    1. היברידי ProtG-ssDNA (גדיל עליון) עם גדיל תחתון ביוטיניל ביחס טוחנת של 1.2:1 עם ריכוזים של 240 ננומטר ו 200 ננומטר בהתאמה במאגר T50M5 (10 mM טריס, 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl2) כדי להיברידי את מבנה TGT המלא. בואו היברידית ב RT ≥1 h.

2. חלוקת פני השטח

  1. ניקוי משטחים
    1. נקה בקבוק ארלנמייר אחד ושתי צנצנות מכתימות על כל 8 כיסויים. מלאו כל מיכל בתמיסת 1 M KOH וסוניאט למשך שעה אחת ב-RT. שטפו היטב כל מיכל במים אולטרה-תפוניים ויבשו עם N2 או בתנור.
      הערה: מלאו את ה-KOH למעלה כדי לגעת במכסה, כך שהם גם מנוקים.
    2. שוטפים היטב כל כיסוי במים אולטרה-תותים ומניחים אותם באחת מצנצנות הכתמים המנוקות.
      הערה: ודא שהם לא דבוקים זה לזה או לקיר צנצנות הכתמים.
    3. במכסה המנוע אדים, להכין טרי פתרון פיראנה על ידי הוספת 30 מ"ל של מי חמצן (30%) עד 90 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת (95%-98%) בכוורת 250 מ"ל.
      זהירות: חומצה גופרתית מרוכזת היא מאכלת מאוד. מוסיפים את מי חמצן לאט מאוד לחומצה הגופרתית ומערבבים בזהירות לערבב.
    4. שקועים באופן מלא את כיסויי הכתמים בצנצנת הכתמים עם תמיסת פיראנה. השאירו כיסויים בפיראנה למשך 30 דקות במכסה המנוע.
      אזהרה: מצננים את תמיסת הפיראנה ללא יותר מ-80 מעלות צלזיוס לפני ההשפכה כדי למנוע פיצוח צנצנת הכתמים.
    5. יש להשליך את תמסת הפיראנה לכוס 1000 מ"ל ולנטרל עם 1 M KOH מניקוי זכוכית.
    6. (אופציונלי) יש לחזור על ניקוי פיראנה (שלבים 2.1.3-2.1.5) עם תמיסה טרייה של פיראנה.
    7. לשטוף את כיסויים עם כמויות גדולות של מים אולטרה-תפירה כדי להסיר את כל פתרון פיראנה שיורית. יש לנער בעדינות את צנצנת הכתמים במהלך כל עלייה כדי להקל על ההסרה (מומלץ לבצע 10 שטיפות).
    8. שוטפים את כיסויי המכסים במתנול 3 פעמים כדי להסיר מים מפני השטח של כיסוי ולשמור על כיסויים שקועים מתנול.
  2. סילאניזציה של פני השטח
    1. הכן פתרון אמינוסילן 1% על ידי ערבוב יסודי של 94 מ"ל של מתנול, 1 מ"ל של אמינוסילן, ו 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית בבקבוק ארלנמאייר המנוקה והמיובש. יוצקים לתוך השני ניקה מיובש מכתים צנצנת 14.
    2. מעבירים את כיסויי הכיסוי השקועים מתחת לתמיסת המתנול לצנצנת הכתמים המכילה תמיסת אמינוסילן של 1% ושומרים על הצנצנת מכוסה.
      הערה: אין לאפשר כיסויים להתייבש בעת המעבר aminosilane כדי להגביל את החשיפה משטח זכוכית לאוויר.
    3. לדגור על צנצנת הכתמים המכילה כיסויים באמינסילאן במשך שעה אחת ב 70 °C בתנור15.
    4. יש להשליך בזהירות את תמיסת אמינוסילן במיכל פסולת נפרד ולשטוף את כיסויי המכסים בצנצנת הכתמים במתנול 5 פעמים כדי להסיר את תמיסת אמינוסילן.
    5. יש לשטוף את הכיסויים בצנצנת הכתמים במים אולטרה-תפומיים 5 פעמים ולייבש אותם ב-N2.
    6. אופים את הכיסויים היבשים בצנצנת הכתמים בתנור ב 110 °C (20 דקות). אפשר כיסויים להתקרר RT, ולאחר מכן למקם אותם על מדף PEGylation.
      הערה: מכסים את צנצנת הכתמים במכסה במהלך האפייה כדי למזער תצהיר מיוחד וכימי על פני השטח15.
  3. הכנת פתרון PEG
    1. הפשר PEG (פוליאתילן גליקול) ו PEG-ביוטין ל- RT במשך כ -30 דקות.
      הערה: שלב זה ממזער עיבוי לחות שיכול לבזות את אסתר NHS על PEG.
    2. הפוך חוצץ PEG על ידי הוספת 84 מ"ג של סודיום ביקרבונט ל 10 מ"ל של מים אולטרה-תות. ניסוח זה אמור לספק חוצץ ב- pH 8.4.
    3. עבור 8 כיסויים, כל אחד עם צד PEGylated אחד עם 20:1 PEG:PEG-ביוטין: למדוד 100 מ"ג של PEG ו 5 מ"ג של PEG-ביוטין להוסיף 400 μL של חוצץ PEG. מערבולת הפתרון עבור 30 s וצנטריפוגה במשך 1 דקות במהירות המרבית (≥18000 x גרם).
      הערה: שלב זה הוא זמן רגיש, כמו הידרוליזה SVA NHS-אסתר מתחיל מיד ויש לו מחצית חיים של 34 דקות ב pH 8.0, עם מחצית חיים קצרה יותר ב pH 8.4.
  4. PEG דגירה ואחסון כיסוי
    1. הגדירו את תא הלחות והכניסו פנימה את כיסויי המכסים.
    2. הוסף 90 μL של פתרון PEG לכיסוי בתא הלחות והנח כיסוי שני על גבי פתרון PEG באמצעות פינצטה מחזיקה כיסוי כדי להפיץ באופן שווה את פתרון PEG.
    3. ודא שאין בועות בפתרון שהושלכו על כיסוי. מנמיכים קצה אחד של השני מכסה על כיסוי הראשון לאט טיפה הקצה השני, כך שאין בועות תקועים בין כיסויים.
      הערה: בועות יגרמו לאזורים מסוימים להיות PEGylated גרוע.
    4. חזור על הפעולה עד שלכל כיסויי הכיסוי יש PEG (כלומר, 8 כיסויים = 4 כריכי PEG). לדגור על פתרונות PEG בן לילה (~ 12 שעות) ב RT בתא לחות בחושך16.
    5. מפרידים את זוגות הכיסויים ומניחים אותם בצנצנת כתמים. שימו לב לצדדים המנומרים.
    6. יש לשטוף היטב את הכיסויים במים אולטרה-תפופים ולייבש עם N2.
      הערה: החזק את כיסויי עם פינצטה ולפוצץ N2 על פני השטח לכיוון פינצטה כדי למנוע מזהמים להתייבש על פני השטח.
    7. סמן את הצד שאינו מנוצל באמצעות נקודה בפינה באמצעות סמן קבוע או עט יהלום.
    8. מקם 2 כיסויי PEGylated בצינורות דואר עם הצדדים PEGylated אחד מול השני כדי לעזור לזהות את הצד PEGylated לפני השימוש.
    9. שואבים את הצינור במשך 5 דקות ומילוי אחורי עם N2. לאטום את הצינור עם parafilm.
    10. יש לאחסן את כיסויי PEGylated ב-20 °C (70 °F) בצינורות הדיוור האטומים למשך עד 6 חודשים.
      הערה: חממו את צינורות האחסון ל- RT לפני הרכבת השבבים. עיבוי על כיסויים במהלך האיטום יגרום לדליפה.

3. הכנת תא זרימה

  1. הרכבת שבב
    1. מורחים דק כמות קטנה של אפוקסי משני צידי הסרט הדו-צדדי עם סכין גילוח.
      הערה: אפוקסי רב מדי עלול להתפשט לערוץ במהלך ההרכבה.
    2. חותכים בלייזר את הסרט מצופה אפוקסי כדי ליצור 4 ערוצים. צרו את שבב הזרימה על ידי כריכת סרט האפוקסי בין שקופית בת 4 גומות לכיסוי PEG (איור 1A).
    3. בעזרת קצה פיפטה, יש להפעיל לחץ עדין לאורך הערוצים כדי ליצור אטם טוב. רפא את האפוקסי ≥1 שעות.
      הערה: אין לגזז את הזכוכית כדי למנוע החלקה נגד אפוקסי.
  2. הרכבה קאמרית
    1. יישר את השבב כך שפתיחת כל ערוץ תוצב במרכזי המתאם (איור 1A). מניחים שני מרווחי אקריל שקופים על גבי השבב, מפעילים לחץ מוצק באמצע הבלוק, ומברגים בשני ברגים 4-40 בקצת כל מרווח.
      הערה: אין לכפות את הבורג או ללחוץ חזק מדי על המרווחים, או שהשבב עלול להיסדק.
    2. בצד השני של הסוגר, בורג הכניסות לתוך החורים המושרשרים. נטר את מצב האיטום דרך בלוק האקריליק השקוף.
    3. כאשר הצינורות יוצרים קשר עם פתח השבב, אטמו את החיבור על ידי פיתול עדין של הצינורות בכיוון השעון.
      הערה: מפרצונים לחוצים עלולים לגרום לחסימת זרימה, בעוד שמגעים רופפים יגרמו לדליפה.

4. הכנת משטח

הערה: עיין באיור 1B עבור זרימת העבודה הכוללת.

  1. חסימת סוכנים למניעת איגוד לא מינוי
    1. השתמש pipette להזרים 200 μL של חוצץ לשטוף (10 mM טריס, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 ו 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20) לתוך התא כדי לבדוק דליפה. אם נוצרות בועות בערוץ, דחוף באגרסיביות 200 μL נוספים כדי להסיר את הבועות.
      הערה: בועות אוויר גדולות שלא הוסרו בשלב זה יכולות להתנתק ולהרוס פונקציונליזציה של פני השטח מאוחר יותר.
    2. הוסף 40 μL של BSA (1% w/v) לתא הזרימה כדי למנוע כריכה לא-מינית ודגרה למשך 10 דקות.
    3. הקפד להוסיף מספיק נפח במהלך כל תקופת דגירה כדי למלא את תאי הזרימה וליצור טיפות בפרצונים ובשקעים. התאם את נפחי הדגירה בהתאם ובצע את כל הדגירה בתא לחות.
    4. הוסף 40 μL של Tween 20 (5% v/v) לתא הזרימה. דגירה במשך 10 דקות כדי להפחית עוד יותר כריכה לא מינית.
    5. (אופציונלי) בדוק את פני השטח עבור פסיביציה נאותה על ידי זרימת חרוזי פוליסטירן דרך הערוץ. הוסף 40 μL של חרוזי פוליסטירן מצופים ProtG (0.01% w/v) ותמונה באמצעות מיקרוסקופ Darkfield עם מטרה 10x. אם חרוזים אינם נדבקים לפני השטח, המשך לשלב הבא.
    6. לשטוף את הערוץ עם 200 μL של חוצץ לשטוף כדי להסיר את כל סוכני passivation.
  2. פונקציונליזציה של פני השטח של התא
    1. הוסף 40 μL של סטרפטאבידין (100 מיקרוגרם / מ"ל) לתא הזרימה ודגרה במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם 200 μL של חוצץ לשטוף.
    2. הוסף 40 μL של ProtG-TGT היברידי (100 ננומטר) לתא הזרימה ודגרה במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם חוצץ לשטוף 200 μL.
    3. הוסף 40 μL של גדיל עליון ProtG-TGT (100 ננומטר) למשך 20 דקות כדי להשלים כל גדיל תחתון TGT לא מרוסן על פני השטח. לשטוף עם 200 μL של חוצץ לשטוף.
    4. הוסף 40 μL של P-selectin-Fc (10 מיקרוגרם / מ"ל) לתא הזרימה ודגרה במשך 60 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם 200 μL של חוצץ לשטוף.
      הערה: משך הדגירה הוא קריטי.

5. ניסויים והדמיה

  1. כיוונון מערכת זרימה
    1. מלא מזרק זכוכית 5 מ"ל עם חוצץ מתגלגל (HBSS עם 2 מ"מ CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0.1% BSA). ודא שאין בועות אוויר במזרק על ידי הקשה על צידי המזרק כדי להוציא את הבועות ולדחוף אותם החוצה כפי שהם צפים לכיוון הקצה.
    2. הכנס מחט סטרילית (26 G, 5/8 אינץ 'אורך) לתוך ~ 200 מ"מ של צינורות פוליאתילן (I.D. : 0.38 מ"מ; O.D: 1.09 מ"מ) ולחבר את המחט למזרק הזכוכית.
      הערה: ודא שאין אוויר לכוד בשום מקום במחבר המחט.
    3. תקן את המזרק על משאבת המזרק והטה את משאבת המזרק כך שצד הבוכנה מוגבה כדי למנוע מבועות אוויר להיכנס לערוץ. הכנס את קצה הצינור לתוך הכניסה של תא הזרימה.
      הערה: יש להבטיח מגע נוזלי לנוזל בעת ביצוע החיבור על ידי הפקדת טיפות על המפרצונים והשלכת טיפות בסוף צינורות המזרק. ודא שאין בועות אוויר להיכנס לערוץ על ידי מתן טיפה קטנה להיווצר בקצה צינורות המזרק לפני החדרת אותו לתוך הכניסה.
    4. הכנס קצה אחד של עוד 200 ממ של צינורות פוליאתילן לתוך השקע, ואת הקצה השני שקוע פסולת.
  2. הגדרה עבור גלגול תאים
    1. לגדל תאי HL-60 ב 25 ס"מ2 צלוחיות תרבית מאווררת במדיה IMDM בתוספת 20% סרום בקר עוברי ו 1% אנטיביוטיקה ב 37 °C עם 5% CO2. לשמור על צפיפות תאים בין 1 x 105-2 × 106 תאים / מ"ל.
    2. (אופציונלי) להבדיל את תאי HL-60 במדיום IMDM מלא המכיל 1.25% DMSO בצפיפות ראשונית של 2 x 105 תאים /mL. תאי דגירה להיות הפעיל ביותר במשך 5-6 ימים.
    3. קח דגימה (1-2 מ"ל) מהשעיית התא וצנטריפוגה (200 x גרם, 3 דקות) כדי לכדור את התאים.
    4. הסר את המדיום בעדינות resuspend התאים ב 500 μL של המאגר המתגלגל. חזור על שלב הכביסה פעמיים כדי להסיר פסולת סלולרית.
    5. מדוד את צפיפות התא עם המוציטומטר. resuspend כדורי התא עם חוצץ מתגלגל לצפיפות של 2 x 105 תאים / מ"ל.
    6. בזהירות לנתק את הצינורות מן הכניסות / שקע ו pipette 40 μL של השעיית התא לתוך תא הזרימה. קשר מחדש את הצינורות כמתואר קודם לכן, ודא שלא הוכנסו בועות לערוץ הזרימה.
    7. התחל ניסוי גלגול תאים על ידי הפעלת משאבת המזרק בקצבי הזרימה הרצויים.
      הערה: עוצמת מסלולי הפלואורסצנטי תלויה בלחץ הגיסה, ומהירות הגימור/מהירות התא של מהירות התא נמוכה יותר תיצור בדרך כלל רצועות עמומות יותר (איור 4A). הימנע מצפיפות תאים גבוהה על פני השטח או ממשך גלגול מוגזם כדי להבטיח רצועות חד-תאיות נפרדות (איור 4B,C).
    8. השתמש במיקרוסקופ Darkfield עם מטרה של פי 10 כדי להבטיח שצפייה בגלגול תאים.
    9. לאחר השלמת הניסוי, הסר את התאים מהערוץ על ידי החדירה של המאגר המתגלגל במהירות של 100 מ"ל/שעה עד שהמשטח יהיה נקי מתא.
  3. הדמיית מסלולים מקומיים על ידי "הצטברות נקודות מבוססת DNA להדמיה בטופוגרפיה ננומטרית" (DNA-PAINT)
    1. הוסף 40 μL של גדיל צלם DNA-PAINT (500 pM) במאגר DNA-PAINT (0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) לערוץ.
    2. בצע מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת (TIRF) באמצעות עדשת יעד TIRF טבילת שמן 100x. רכוש 40000+ פריימים עם זמן חשיפה של 25 אלפיות שניים לכל מסגרת ברווח של 300 אלקטרון באמצעות מצלמת התקן מצמיד מטען (EMCCD) המתרבה אלקטרונים.
    3. השתמש בחבילת התוכנה של פיקאסו17 כדי להתאים לשפות לשפות ועבד את התמונות ברזולוציית-על (איור 4D) בעקבות שלבים 5.3.4-5.3.5.
    4. טען את סרט DNA-PAINT לתוכנית לוקליזציה כדי לקבוע את לוקליזציה של כל פלואורופור בכל פריים.
      הערה: מטב את אורך הצד של התיבה ואת הפרמטרים של Min. Net Gradient עד למעקב מדויק אחר פלואורופורים בלבד. הפרמטר Min. Net Gradient יכול לעתים קרובות לעבור מעל 100000 כדי להשיג מעקב אופטימלי. הגדרת התאמה: MLE, שיטת גאוס משולבת מייצרת את התוצאה הטובה ביותר. לבסוף, אם הסרט ארוך מדי, פצל אותו לערימות של 10000 פריימים כדי שעקבות התצוגה המקדימה ב- Localize יפעלו כראוי לפני שילובן מחדש לקובץ HDF5 סופי.
    5. לאחר מכן, טען את קובץ HDF5 המתקבל לתוכנית Render כדי לבצע תיקון ועיבוד סחף.
      הערה: בצע תיקון סחף מרובה באמצעות Undrift על-ידי RCC כדי לשפר את התוצאה הסופית.
  4. הדמיית מסלולים ארוכים על-ידי תיוג קבוע
    1. הוסף את גדיל הדמיה הקבוע ודגרה עבור 120 s במאגר T50M5. לשטוף את הערוץ על ידי infusing 200 μL של חוצץ לשטוף.
    2. הקלט תמונה עם לייזר העירור כבוי כדי להשיג רעש מצלמת רקע. תמונה של שטח גדול בתבנית רשת על-ידי מיקרוסקופיית TIRF.
      הערה: מומלץ לתפרר לאחר מכן חפיפה של מסגרת מעל מסגרת של 10% ≥.
    3. תכנת את המיקרוסקופ כדי לסרוק את השטח של 400 x 50 תמונות (20000 תמונות בסך הכל). באמצעות תוכנית FIJI, לפצל נתונים גולמיים לתוך קבצי tiff בודדים, כל אחד המכיל מקסימום של 10000 תמונות.
    4. שיטחו את כל התמונות באמצעות פרופיל התאורה (איור 3A-C) בעקבות שלבים 5.4.5-5.4.7.
    5. הפחת את רעש מצלמת הרקע מכל פריים. השג את הקרנת הערימה הממוצעת (פרופיל תאורה) של כל מסגרת מופחתת ברקע.
    6. נרמל את פרופיל התאורה לפי הערך המרבי שלו. חלק כל מסגרת מופחתת ברקע לפי פרופיל התאורה המנורמל.
    7. שינוי קנה המידה של המסגרות המתוקנות לטווח המתאים עבור עומק הסיביות המתאים.
    8. השתמש ב- MIST18 כדי לתפור את התמונות (איור 3D,E).

תוצאות

הפרוטוקול לעיל מתאר את ההליך הניסיוני של תוחם טביעת הרגל של הידבקות. זרימת העבודה של הניסוי הכללי מודגמת באיור 1, החל מהרכבת תא הזרימה (איור 1A) וכלה בפונקציונליזציה של פני השטח (איור 1B) ושלבי הניסוי וההדמיה (איור 1C).

Discussion

טביעת הרגל של הידבקות מאפשרת הדמיה של אירועי הידבקות מולקולרית בין PSGL-1 ו- P-selectin במהלך הידבקות מתגלגלת תאים. תהליך זה מופעל על ידי לכידה בתיווך P-selectin ואחריו מתגלגל תחת לחץ גיזום נוזלי. בעיות פוטנציאליות במהלך הניסוי כרוכות בדרך כלל גלגול תאים עניים או חסר מסלולי פלורסנט גם כאשר תאים מתגלגל...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנדה לחדשנות (CFI 35492), המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה דיסקברי גרנט (RGPIN-2017-04407), גבולות חדשים בקרן המחקר (NFRFE-2018-00969), קרן מייקל סמית לחקר הבריאות (SCH-2020-0559) וקרן אמיליה הבריטית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-channel drill guideCustom made3D printed with ABS filament
4-holes slideCustom madeDrill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
AcetoneVWRBDH1101-4LP
Acrylic spacerCustom madeCut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holderCustom madeMachine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
AminosilaneAlfaAesarL14043CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solutionCytiva HyCloneSV3007901Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyreneSpherotechPGP-60-5
Bovine serum albuminVWR332
Buffer, DNA PAINT0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M510mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, RollingHBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chlorideVWRBDH9224
Cell culture flasksVWR10062-868
Concentrated sulfuric acidVWRBDH3072-2.5LG95-98%
Coverslip holding tweezersTechni-Tool758TW150
Diamond-coated drill bitsAbrasive technologyC52505100.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand)IDT DNACustom oligoCCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)IDT DNACustom oligo/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINTIDT DNACustom oligoGAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labellingIDT DNACustom oligoCCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tapeScotch2373/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTAThermofisher155750200.5 M EDTA, pH 8.0
EpoxyGorilla420015 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-085
GelGreenBiotium41005
Glacial acetic acidVWRBDH3094-2.5LG
Glass, CoverslipsFisher Scientific12-548-5P
Glass, Microscope slideVWR48300-02675 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jarVWR74830-150Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)Lonza04-315Q
HemocytometerSigma-AldrichZ359629-1EA
HL-60 cellsATCCCCL-240
Humidity chamber slide supportCustom made3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxideVWRBDH7690-130%
ImidazoleSigma-AldrichI2399
Inlets/outletsCustom madeDrill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)Lonza12-722F
Magnesium chlorideVWRBDH9244
Magnetic Ni-NTA beadsInvitrogen10103D
Mailer tubesEMSEMS71406-10
MethanolVWRBDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel ColumnsBiorad7326200In SSC Buffer
PEGLaysan BioMPEG-SVA-5000
PEG-biotinLaysan BioBiotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxideVWR470302-132
Protein, Protein GAbcamab155724N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-FcR&D System137-PSRecombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, StreptavidinCedarlaneCL1005-01-5MG
Pump SyringeHarvard Apparatus704801
Sodium bicarbonateWard’s Science470302-444
Sodium chlorideVWR97061-274
Sulfo-SMCCThermofisher22322
SyringeHamilton81520Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needlesBD305115Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEPSigma-AldrichC4706-2G
TrisVWRBDH4502-500GP
Tubing, AdaptorTygonABW00001Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, PolyethyleneBD Intramedic427406Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20Sigma-Aldrich93773

References

  1. McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
  4. Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
  5. van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
  6. Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
  7. Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
  8. Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
  9. Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
  10. Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
  11. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
  12. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
  13. Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
  14. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
  15. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  16. Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  17. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  18. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
  19. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  20. Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
  21. Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
  22. Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
  23. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  24. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175P selectin 1 PSGL 1TGTDNA DNA PAINT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved