איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בצמח המארח כדי לזהות חלבוני רוק של חלבונים נגיפיים צמחיים וחלבונים נגיפיים צמחיים המשתחררים על ידי וקטורי עלים.

Abstract

וקטורי חרקים מעבירים אופקית וירוסים צמחיים רבים בעלי חשיבות חקלאית. יותר ממחצית הנגיפים הצמחיים מועברים על ידי חרקים המיפטרניים שיש להם חלקי פה מוצצים חודרים. במהלך העברה ויראלית, רוק החרק מגשר בין הנגיף-וקטור-מארח מכיוון שווקטורי הרוק נגיפים, וחלבוני החרקים, מעוררים או מדכאים את התגובה החיסונית של צמחים מחרקים לפונדקאים צמחיים. הזיהוי והניתוחים הפונקציונליים של חלבוני רוק הופכים לתחום חדש של התמקדות בתחום המחקר של אינטראקציות ארבו-וירוס-מארח. פרוטוקול זה מספק מערכת לזיהוי חלבונים ברוק של עלעלים באמצעות הצמח המארח. וקטור ההופר Nephotettix cincticeps הנגוע בנגיף ננס האורז (RDV) משמש כדוגמה. ויטלוגנין וחלבון הקפסיד החיצוני העיקרי P8 של RDV וקטור על ידי הרוק של N. cincticeps ניתן לזהות בו זמנית בצמח האורז כי N. cincticeps ניזון ממנו . שיטה זו ישימה לבדיקת חלבוני הרוק הנשמרים באופן זמני בצמח המארח לאחר הזנת חרקים. הוא האמין כי מערכת זו של זיהוי יועיל המחקר של hemipteran-virus-צמח או hemipteran-צמח אינטראקציות.

Introduction

מצב השידור הווקטורי-מארח של ארבו-וירוסים, בעיה בסיסית, נמצא בחזית המדע הביולוגי. וירוסים צמחיים רבים בעלי חשיבות חקלאית מועברים אופקית על ידי וקטורים של חרקים¹. יותר ממחצית הנגיפים הצמחיים הם וקטורים על ידי חרקים המיפטרניים, כולל כנימות, זבובים לבנים, עלים, פלנטהופרים ותריפס. לחרקים אלה תכונות ייחודיות המאפשרות להם להעביר ביעילות וירוסים צמחיים¹. יש להם חלקי פה מוצצי פירסינג והם ניזונים מהלשד מפלואם ומקסילם, ומפרישים את הרוק שלהם 1,2,3,4. עם הפיתוח והשיפור של טכניקות, הזיהוי והניתוחים הפונקציונליים של מרכיבי הרוק הופכים למוקד חדש של מחקר אינטנסיבי. חלבוני הרוק הידועים ברוק כוללים אנזימים רבים, כגון פקטינאסטראז, צלולאז, פרוקסידאז, פוספטאז אלקליין, פוליפנול אוקסידאז וסוכראז, בין היתר 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . החלבונים ברוק כוללים גם אליקטורים המפעילים את תגובת ההגנה של הפונדקאי, ובכך משנים את ביצועי החרקים, ומשפיעים המדכאים את הגנת הפונדקאי, המשפרים את כושר החרקים ורכיבים הגורמים לתגובות פתולוגיות של המארח^14,15,16,17. לכן, חלבוני רוק הם חומרים חיוניים לתקשורת בין חרקים לפונדקאים. במהלך העברת הנגיפים, הרוק המופרש על ידי בלוטות הרוק של חרקים אלימים מוצצי פירסינג מכיל גם חלבונים נגיפיים. רכיבים נגיפיים מנצלים את זרימת הרוק כדי לשחרר אותם מהחרק לפונדקאי הצמח. לכן, רוק החרק מגשר על האינטראקציה הטריטרופית וירוס-וקטור-מארח. חקירת התפקוד הביולוגי של חלבוני רוק המופרשים על ידי חרקים אלימים מסייעת להבין את הקשר בין וירוס-וקטור-מארח.

עבור וירוסים של בעלי חיים, מדווח כי רוק של יתושים מתווך את ההעברה והפתוגניות של נגיף הנילוס המערבי (WNV) ונגיף דנגי (DENV). חלבון הרוק AaSG34 מקדם שכפול והעברה של נגיף דנגי-2, ואילו חלבון הרוק AaVA-1 מקדם העברת נגיף DENV וזיקה (ZIKV) על ידי הפעלת אוטופגיה^18,19. חלבון הרוק D7 של יתושים יכול לעכב זיהום DENV במבחנה ו-in vivo באמצעות אינטראקציה ישירה עם נגיפים של DENV וחלבון מעטפת DENV^{רקומביננטי 20}. בנגיפים צמחיים, וירוס תלתלי העלים הצהובים של עגבנייה (TYLCV) גורם לחלבון הרוק של הזבוב הלבן Bsp9, המדכא את החסינות בתיווך WRKY33 של מארח הצמח, להגביר את ההעדפה והביצועים של הזבובים הלבנים, ובסופו של דבר מגביר את העברת הנגיפים²¹. מאחר שמחקרים על התפקיד שממלאים חלבוני רוק של חרקים בפונדקאים של צמחים פיגרו אחרי אלה של פונדקאים של בעלי חיים, נדרשת בדחיפות מערכת יציבה ואמינה לזיהוי חלבוני הרוק בפונדקאים של צמחים.

נגיף הצמח המכונה וירוס ננס אורז (RDV) מועבר על ידי הופר Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) ביעילות גבוהה ובאופן מתפשט מתמשך^22,23. RDV דווח לראשונה כמועבר על ידי וקטור חרקים וגורם למחלה קשה של אורז באסיה^24,25. הנגיף הוא איקוסהדרלי ודו-שכבתי כדורי, והשכבה החיצונית מכילה את חלבון הקפסיד החיצוני P8²². תקופת השידור במחזור הדם של RDV ב N. cincticeps היא 14 ימים 26,27,28,29,30. כאשר RDV מגיע לבלוטות הרוק, נגיפים משתחררים לחללים המאוחסנים ברוק בבלוטות הרוק באמצעות מנגנון דמוי אקסוציטוזה²³. ויטלוגנין (Vg) הוא קודמן חלבון החלמון החיוני להתפתחות ביציות בנקבות חרקים^31,32,33. לרוב מיני החרקים יש לפחות תעתיק Vg אחד של 6-7 קילובייט, המקודד חלבון מקדים של כ-220 kDa. מבשרי החלבון של Vg יכולים בדרך כלל להיבקע למקטעים גדולים (140 עד 190 kDa) וקטנים (<50 kDa) לפני הכניסה לשחלה^18,19. ניתוח פרוטאומי קודם גילה את נוכחותם של הפפטידים שמקורם ב-Vg ברוק המופרש של העלה Recilia dorsalis, אם כי תפקידם אינו ידוע (נתונים שלא פורסמו). לאחרונה דווח כי Vg, המופרש דרך הפה מצמחים, מתפקד כגורם משפיע לפגיעה בהגנות של צמחים³⁴. לא ידוע אם Vg של N. cincticeps יכול גם להשתחרר לצמח המארח עם זרימת רוק, ואז יכול לשחק תפקיד בצמח להפריע להגנה על הצמח. כדי לענות על השאלה האם N. cincticeps מנצל חלבוני רוק, כגון Vg, כדי לעכב או להפעיל את הגנות הצמח, הצעד הראשון הוא זיהוי חלבונים המשתחררים לצמח במהלך ההאכלה. הבנת השיטה לזיהוי חלבוני הרוק הנמצאים בצמח עשויה להיות חיונית כדי להסביר את תפקודם של חלבוני הרוק ואת יחסי הגומלין בין המיפטרה לצמחים.

בפרוטוקול המוצג כאן, N. cincticeps משמש כדוגמה כדי לספק שיטה לבחון את נוכחותם של חלבוני רוק בצמח המארח שהוכנסו באמצעות הזנת חרקים. הפרוטוקול מפרט בעיקר את האיסוף והזיהוי של חלבוני רוק והוא מועיל לחקירה נוספת על רוב ההמיפטרנים.

Protocol

העלעלים הבוגרים הלא-אלימים הופצו במרכז לחקר וירוסים הנישאים על ידי וקטורים באוניברסיטת פוג'יאן לחקלאות וייעור, סין.

1. גידול חרקים לא אלימים

1. מגדלים את הבוגרים על שתילי אורז בכלוב קוביות בגודל 40X35X20 ס"מ (אורך X רוחב X גובה). יש לכסות צד אחד של הכלוב ברשת חסינת חרקים לצורך אוורור.
   1. שמור את הכלובים עם עלעלים באינקובטור המכיל בקר לחות מובנה ב 26 ° C עם לחות יחסית של 60-75% תחת תקופת צילום של 16 שעות אור ו 8 שעות כהה.
2. השתמשו בשאיפה כדי להעביר בעדינות את כל הבוגרים מהכלוב שלהם לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים מדי שבוע.
   1. תנו ליותר מ-200 מבוגרים להזדווג ולהטיל ביצים באורז.
   2. שמרו את שתילי האורז הישנים כדי שהנימפות יצאו. החזירו את הנימפות הלא-וירוסיות החדשות האלה לשלב ה-2 בכוכב.

2. רכישת וירוסים ואיסוף חרקים אלימים

1. מעבירים בזהירות את הנימפות הלא וירוסיות 2 אינץ' לצינור תרבית זכוכית (קוטר 2.5 ס"מ על גובה 15 ס"מ) למשך 1-2 שעות לרעב באמצעות השואב.
   1. שחררו את הנימפות לכלוב המכיל צמח אורז נגוע ב-RDV שגדל בעציץ.
   2. אפשר נימפות להאכיל על צמח האורז נגוע במשך 2 ימים.
      הערה: השקו בזהירות את צמח האורז והימנעו משטיפת הנימפות. אורכן של הנימפות הדו-כוכביות הוא כ-1.6-2 מ"מ.
2. העבירו בזהירות את הנימפות הללו לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים ללא וירוסים עם לחות יחסית של 60-75% תחת תקופת צילום של 16 שעות אור ו -8 שעות כהות. אפשר לנימפות להאכיל על צמח האורז נגוע במשך 12 ימים כדי להשלים את תקופת העברת הדם של RDV.

3. איסוף חלבוני רוק באמצעות כלוב האכלה

1. הכינו חמישה כלובי האכלה קטנים דמויי צינור (2.5 ס"מ קוטר על 4 ס"מ גובה) שבהם קצה אחד מכוסה ברשת חסינת חרקים.
2. כלאו 15-20 עלעלים בכל כלוב האכלה, ולאחר מכן כסו את הקצה השני של הכלוב במחצלת קצף דקה.
   1. מקבעים שתיל אורז אחד (בגובה 5-6 ס"מ) בין קצה הכלוב למחצלת קצף בעזרת סרטי הדבקה. ודאו שהעלעלים בכלוב ההאכלה יוכלו להיזון משתילי האורז החשופים לחלק הפנימי של הכלוב.
3. לטבול את שורשי השתיל במים, כך צמח האורז יישאר בחיים. אפשר את leafhoppers להאכיל אותם במשך 2 ימים.
4. הוציאו את העלעלים מכלובי ההאכלה שלהם ואספו את שתילי האורז שמהם ניזונו. חותכים את חלקי השתילים מחוץ לכלוב ומשחזרים את אזורי ההאכלה של שתילים.
   הערה: ניתן לאחסן דגימה זו ב -80 °C למשך 3 חודשים לכל היותר, אם היא אינה משמשת באופן מיידי לזיהוי.

4. הכנת מגיב

1. יש להמיס 15.1 גרם בסיס טריס, 94 גרם גליצין ו-5 גרם SDS בליטר אחד של מים סטריליים להכנת חיץ 5xTris-גליצין. לדלל 200 מ"ל של חיץ 5xTris-גליצין עם 800 מ"ל של מים סטריליים כדי להכין חיץ 1xTris-גליצין (ראה טבלה 1 להרכב החיץ).
2. יש להמיס 80 גרם NaCl, 30 גרם בסיס טריס ו-2 גרם KCl ב-1 ליטר מים סטריליים להכנת מאגר מלח חוצץ 10xTris (TBS). Autoclave את התמיסה ב 121 ° C במשך 15 דקות.
3. יש להמיס 8 גרם SDS, 4 מ"ל של ß-מרקפטואתנול, 0.02 גרם ברומופנול כחול ו-40 מ"ל גליצרול ב-40 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) להכנת מאגר דגימת חלבון 4x.
4. ערבבו 800 מ"ל חיץ טריס-גליצין עם מתנול 200 מ"ל להכנת מאגר ההעברה.
5. הוסף תמיסת 100 מ"ל 10xTBS ו- 3 מ"ל טווין 20 עד 900 מ"ל מים סטריליים כדי להכין את מאגר TBS עם תמיסת Tween 20 (TBST).

5. כתם מערבי לאיתור חלבוני הרוק והויראלי

1. טוחנים 0.1 גרם של דגימות האורז עם חנקן נוזלי עד הרקמה הופכת אבקה. הוסיפו 200 μL של מאגר דגימת חלבון 4x לדגימה והרתיחו אותו במשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   1. מוציאים את הסופרנאטנט ומניחים אותו בבקבוקון חדש. טען 10 μL של הדגימה לתוך ג'ל SDS-PAGE, והפעל אותו במאגר Tris-glycine ב 150 V במשך 45-60 דקות.
      הערה: ניתן להשליך את השאריות לאחר הצנטריפוגה.
2. שים קרום ניטרוצלולוז 0.45 מיקרומטר וציוד סנדוויץ' אחר במאגר ההעברה למשך 30 דקות.
   הערה: ניתן לבצע שלב זה לפני שהג'ל סיים את ריצתו.
3. סנדוויץ' את הג'ל ולהעביר אותו במשך 90-120 דקות ב 100 V במאגר ההעברות.
4. קחו את הממברנה והכניסו אותה לתמיסת חסימת חלב יבש 7% ללא שומן בתמיסת TBST למשך 20 דקות. הוסף את הנוגדן הספציפי נגד RDV P8 או Vg לתמיסה של 7% חלב יבש ללא שומן ב- TBST. לדגור עם הנוגדן להכתמת הממברנה במשך 2 שעות או לילה.
5. שטפו את הממברנה בתמיסת TBST שלוש פעמים, עם 5 דקות כביסה בכל פעם.
6. הוסף את IgG נגד ארנב עיזים כנוגדן משני לחלב יבש 7% ללא שומן עם TBST. יש לדגור עם הנוגדן במשך 60-90 דקות בטמפרטורת החדר.
7. שטפו את הממברנה בתמיסת TBST שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.
8. השתמש בערכת ECL Western לשיטה הכימילומינסנטית. ערבבו ריאגנטים לזיהוי 1 ו-2 בערכה ביחס של 1:1 בצינור. שים את מגיב מעורב על הממברנה לדגור את הכתם במשך 5 דקות.
9. מסננים את המגיב העודף ומצלמים תמונה קולורימטרית של התמונה הכימילומינסנטית. שלבו אותם כדי לראות את הסולם עם להקות חלבון.

תוצאות

איור 1 מדגים את כל השלבים בפרוטוקול הזה: גידול חרקים, רכישת וירוסים, איסוף חלבוני רוק באמצעות הזנת אורז והכתם המערבי. תוצאות הכתמים המערביים הראו כי רצועות ספציפיות וצפויות של כ -220 kDa נצפו בדגימות של בלוטות אורז ורוק של חרקים על הממברנה מודגרות עם נוגדנים נגד Vg. לעומת זא...

Discussion

הרוק המופרש ישירות על ידי בלוטות הרוק של החרקים המוצצים ממלא תפקיד מרכזי מכיוון שהוא מעכל מראש ומנקה רעלים מהרקמות המארחות ומהגורמים הביולוגיים חוצי הממלכות של הווקטורים לפונדקאים ^1,3,4. הגורמים הביולוגיים חוצי הממלכות, כולל אליציטורים, ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tris base	Roche	D609K69032	For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5×Tris-glycine buffer preparation
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5×Tris-glycine buffer preparation
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10×TBS buffer preparation
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10×TBS buffer preparation
ß-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4× protein sample buffer preparation
bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4× protein sample buffer preparation
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4× protein sample buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
Buffers and Solutions
Buffer	Composition		Comments/Description
5×Tris-glycine buffer	15.1 g Tris base 94 g glycine  5 g SDS in 1 L sterile water		Stock solution
1×Tris-glycine buffer	200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water		Work solution, for SDS-PAGE
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer	80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water		Stock solution
TBS with Tween 20 (TBST) solution	100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water		Work solution
4× protein sample buffer	8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		For protein extraction
Transfer buffer	800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol		For protein transfer
Instruments
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4x protein sample buffer preparation
Constant temperature incubator	Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.	PRX-1200B	For rearing leafhoppers
Electrophoresis	Tanon Science & Technology Co.,Ltd.	Tanon EP300	For SDS-PAGE
Electrophoretic transfer core module	BIO-RAD	1703935	For SDS-PAGE
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4x protein sample buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5x Tris-glycine buffer preparation
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
High-pass tissue grinding instrument	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	JXFSIPRP-24	For grinding plant tissues
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10x TBS buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Mini wet heat transfer trough	BIO-RAD	1703930	For SDS-PAGE
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10x TBS buffer preparation
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
Pierce ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
Protein color instrument	GE Healthcare bio-sciences AB	Amersham lmager 600	For detecting proteins
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5x Tris-glycine buffer preparation
Tris base	Roche	D609K69032	For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
Vertical plate electrophoresis tank	BIO-RAD	1658001	For SDS-PAGE
Water bath	Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.	XMTD-8222	For boil the protein samples
β-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4x protein sample buffer preparation