יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה

Summary

ערכת הכלים הגנומית הפונקציונלית עבור הנמטודות הטפיליות סטרונגילואידים סטרקורליס וסטריונגילודים ראטי כוללת טרנסגנזה, מוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 ו-RNAi. פרוטוקול זה ידגים כיצד להשתמש במיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית כדי להכניס טרנסג'נים ורכיבי קריספר לתוך S. stercoralis ו - S. ratti.

Abstract

הסוג סטרונגילואידים מורכב ממספר מינים של נמטודות חודרות עור עם טווחי פונדקאים שונים, כולל סטרונגילואידים סטרקורליס ו-סטרונגילואידים ראטי. S. stercoralis הוא נמטודה אנושית-טפילית וחודרת עור המדביקה כ-610 מיליון בני אדם, בעוד שטפיל החולדה S. ratti קשור קשר הדוק ל-S. stercoralis ומשמש לעתים קרובות כמודל מעבדה עבור S. stercoralis. גם S. stercoralis וגם S. ratti ניתנים להתאמה בקלות ליצירת טרנסגניות ונוקאאוטים באמצעות טכניקת העברת חומצות גרעין אקסוגניות של מיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית, וככאלה, הופיעו כמערכות מודל להלמינתנים טפיליים אחרים שעדיין אינם מקובלים על טכניקה זו.

בוגרים טפיליים של סטרונגילואידים מאכלסים את המעי הדק של הפונדקאי שלהם ומשחררים צאצאים לסביבה דרך הצואה. ברגע שהם נמצאים בסביבה, הזחלים מתפתחים לבוגרים חופשיים, שחיים בצואה ומייצרים צאצאים שחייבים למצוא פונדקאי חדש ולטלוש אליו. דור סביבתי זה הוא ייחודי למין סטרונגילואידים ודומה מספיק במורפולוגיה למודל של נמטודה חופשית Caenorhabditis elegans שניתן להתאים טכניקות שפותחו עבור C. elegans לשימוש עם נמטודות טפיליות אלה, כולל מיקרו-אינטגונדציה תוך-גונדלית. באמצעות מיקרו-איניג'ינג תוך-גונדלי, ניתן להכניס מגוון רחב של טרנסג'נדרים ל-Strongyloides. רכיבי CRISPR/Cas9 יכולים גם להיות מיקרו-איניג'קטים כדי ליצור זחלי סטרונגילואידים מוטנטיים. כאן מתוארת הטכניקה של מיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית לתוך סטרונגילואידים, כולל הכנת מבוגרים החיים בחופשיות, הליך ההזרקה ובחירת הצאצאים המהונדסים. תמונות של זחלי סטרונגילואידים מהונדסים שנוצרו באמצעות מוטגנזה של CRISPR/Cas9 כלולות. מטרת מאמר זה היא לאפשר לחוקרים אחרים להשתמש במיקרו-איניג'קציה כדי ליצור סטרונגילואידים מהונדסים ומוטנטיים.

Introduction

סטרקוראליס סטרקורליס סטרונגילואידס כבר מזמן התעלמו ממנו כפתוגן אנושי חשוב בהשוואה לתולעי הקרס המוכרות יותר ולתולעת העגולה Ascaris lumbricoides¹. מחקרים קודמים על נטל התולעים לעתים קרובות העריכו באופן חמור את השכיחות של S. stercoralis בשל הרגישות הנמוכה של שיטות אבחון נפוצות עבור S. stercoralis². בשנים האחרונות, מחקרים אפידמיולוגיים המבוססים על כלי אבחון משופרים העריכו כי השכיחות האמיתית של זיהומי S. stercoralis גבוהה בהרבה ממה שדווח בעבר, כ -610 מיליון אנשים ברחבי העולם².

גם ל-S. stercoralis וגם למינים אחרים של סטרונגילואידים, כולל טפיל החולדה הקשור באופן הדוק ולמודל המעבדה הנפוץ S. ratti, יש מחזור חיים יוצא דופן שיש לו יתרון למחקרים גנומיים ניסיוניים מכיוון שהוא מורכב מדורות טפיליים וחופשיים (סביבתיים)³ (איור 1). באופן ספציפי, גם S. stercoralis וגם S. ratti יכולים לעבור דרך דור אחד של חיים חופשיים. הדור החי החופשי מורכב מזחלים פוסט-טפיליים המתפתחים לזכרים ונקבות בוגרים בעלי חיים חופשיים; כל צאצאיהם של הבוגרים החיים בחופשיות מתפתחים לזחלים מדביקים, אשר חייבים להדביק פונדקאי כדי להמשיך את מחזור החיים. יתר על כן, ניתן לתמרן באופן ניסיוני את הדור הסביבתי או החופשי הזה במעבדה. מאחר שמבוגרים בעלי חיים חופשיים של סטרונגילואידים ובוגרים של C. elegans חולקים מורפולוגיה דומה, ניתן להתאים טכניקות כגון מיקרו-אינטגונדציה תוך-גונדלית שפותחו במקור עבור C. elegans לשימוש עם סטרונגילואידים בוגרים חיים חופשיים ^4,5. בעוד שדנ"א מוחדר בדרך כלל לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים, גם זכרים וגם נקבות של סטרונגילואידים יכולים להיות מיקרו-איניג'קט⁶. לפיכך, כלים גנומיים פונקציונליים זמינים כדי לחקור היבטים רבים של הביולוגיה של סטרונגילואידים. נמטודות טפיליות אחרות חסרות דור חופשי, וכתוצאה מכך, הן אינן מקובלות באותה מידה על טכניקות גנומיות פונקציונליות³.

איור 1: מחזור החיים של סטרקורליס סטרונגילואידים. הנקבות הטפיליות של S. stercoralis מאכלסות את המעי הדק של מארחי היונקים שלהן (בני אדם, פרימטים שאינם בני אדם, כלבים). הנקבות הטפיליות מתרבות על ידי פרתנוגנזה ומטילות ביצים בתוך המעי הדק. הביצים בוקעות בעודן בתוך הפונדקאי לתוך זחלים פוסט-טפיליים, אשר מועברים לסביבה עם צואה. אם הזחלים הפוסט-טפיליים הם זכרים, הם מתפתחים לזכרים בוגרים שחיים בחופשיות. אם הזחלים הפוסט-טפיליים הם נקבות, הם יכולים להתפתח לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים (התפתחות עקיפה) או לזחלים זיהומיים בשלב השלישי (iL3s; התפתחות ישירה). הזכרים והנקבות החיים בחופשיות מתרבים מינית כדי ליצור צאצאים המוגבלים להפוך ל-iL3s. בתנאים מסוימים, S. stercoralis יכול גם לעבור הדבקה אוטומטית, שבה חלק מהזחלים הפוסט-טפיליים נשארים בתוך המעי המארח במקום לעבור לסביבה בצואה. זחלים אלה יכולים להתפתח לזחלים אוטו-אינפקטיביים (L3a) בתוך הפונדקאי, לחדור דרך דופן המעי, לנדוד דרך הגוף, ובסופו של דבר לחזור למעי כדי להפוך למבוגרים רבייתיים. מחזור החיים של S. ratti דומה, למעט העובדה ש- S. ratti מדביק חולדות ואין לו מחזור אוטו-אינפקטיבי. הדור הסביבתי הוא המפתח לשימוש במיני סטרונגילואידים למחקרים גנטיים. הנקבות הבוגרות החיות באופן חופשי (P₀) יכולות להיות מיקרו-איניג'קט; צאצאיהם, שכולם יהפכו ל-iL3s, הם המהונדסים הפוטנציאליים של F₁. נתון זה שונה מקסטלטו ואחרים. ³. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

S. stercoralis חולק היבטים רבים של הביולוגיה שלו עם נמטודות אנושיות-טפיליות אחרות במערכת העיכול, כולל פלישת המארחים ומודולציה של מערכת החיסון המארח. לדוגמה, תולעי קרס אנושיות-טפיליות בסוג Necator ו - Ancylostoma גם נדבקות על ידי חדירת העור, מנווטות באופן דומה בגוף, ובסופו של דבר שוכנות כבוגרים טפיליים במעי הדק⁷. לפיכך, נמטודות רבות במערכת העיכול ככל הנראה משתמשות בהתנהגויות חושיות נפוצות ובטכניקות התחמקות חיסוניות. כתוצאה מכך, הידע שנאסף מ-Strongyloides ישלים את הממצאים בנמטודות אחרות, שפחות ניתנות לטיפול גנטי, ויוביל להבנה מלאה יותר של הטפילים המורכבים והחשובים האלה.

פרוטוקול מיקרו-איניג'קציה זה מתווה את השיטה להחדרת דנ"א לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים של סטרונגילואידים כדי ליצור צאצאים מהונדסים ומוטנטיים. מתוארות דרישות תחזוקת המתח, כולל התזמון ההתפתחותי של תולעים בוגרות למיקרו-אינטגרציות ואיסוף צאצאים מהונדסים. פרוטוקולים והדגמה של טכניקת המיקרו-איניג'קציה המלאה, יחד עם פרוטוקולים לגידול וסינון צאצאים מהונדסים, כלולים, יחד עם רשימה של כל הציוד הדרוש וחומרים מתכלים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: גרבילים שימשו למעבר S. stercoralis, וחולדות שימשו למעבר S. ratti. כל ההליכים אושרו על ידי המשרד לפיקוח על מחקר בעלי חיים של UCLA (פרוטוקול מס '2011-060-21A), העומד בתקני AAALAC ובמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. את המשימות הבאות יש להשלים לפחות יום אחד לפני המיקרו-איניג'קטינג'ינג: גידול תולעים, הכנת רפידות מיקרו-איניג'קציה, יצירת מבנים לתערובת המיקרו-איניג'קציה והתפשטות חיידקים (E. coli HB101) על לוחות 6 ס"מ של נמטודה גדילה (NGM)⁸. הנקבות החיות בחופשיות דורשות מינימום של 24 שעות איסוף לאחר הצואה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להתפתח למבוגרים צעירים לפני שניתן יהיה לבצע בהן מיקרו-נקבה. רפידות מיקרו-איניג'קציה חייבות להיות יבשות לחלוטין. צלחות חיידקים חייבות להתייבש ולהקים מדשאה קטנה.

1. הכנת שקופיות מיקרו-אינטגיה: לפחות יום אחד לפני ההזרקה

הערה: תולעים מותקנות על כיסויי מיקרו-איניג'קציה עם רפידות אגר יבשות להזרקה.

1. הגדר גוש חום ל- 90 °C (85 °F).
2. הוסף 5 מ"ל של ddH₂O, ולאחר מכן 100 מ"ג של אגרוז לצינור זכוכית borosilicate.
3. מחממים את תערובת האגרוז בצינור מעל להבה עד שהאגרוז מומס.
4. מקם את הצינור בבלוק חום שנקבע על 90 מעלות צלזיוס כדי לשמור על האגרוז במצב הנוזלי.
5. זרוק ~ 180 μL של תמיסת האגרוז על כיסוי באמצעות פיפטת פסטר זכוכית או פיפטה עם קצה פלסטיק. מיד הורידו כיסוי שני למעלה כדי לשטח את האגרוז לתוך כרית דקה.
6. לאחר 5-10 שניות, הסר את הכיסוי העליון על ידי החלקת השניים זה מזה. קבעו באיזו שקופית נמצאת כרית האגר והניחו אותה עם הפנים כלפי מעלה.
7. בחרו חתיכת זכוכית זעירה מתוך פיסת כיסוי שבורה ולחצו אותה בעדינות לתוך האגר ליד הקצה העליון של המשטח באמצעות מלקחיים (איור משלים S1).
8. המשך לייצר רפידות מיקרו-איניג'קציה עם תמיסת האגרוז.
9. מייבשים את רפידות האגרוס למשך הלילה על הספסל או בתנור. יש לאחסן בקופסת הכיסויים.
   הערה: ניתן להשתמש ברפידות האגרוס עד חודשיים, אך הן משמשות רק להפעלת הזרקה אחת.

2. Culturing Strongyloides כדי להשיג תולעים עבור microinjection: 1 - 2 ימים לפני ההזרקה

הערה: פרוטוקול תחזוקת זן ניתן למצוא בחומר המשלים, הכולל תיאור מפורט של אופן ההדבקה של גרבילים וחולדות בנמטודות וקצירת נמטודות מצואה של בעלי חיים נגועים.

1. יומיים לפני יום ההזרקה, הניחו את בעלי החיים הנגועים ^9,10 בכלובי איסוף למשך הלילה.
2. למחרת בבוקר, אספו צואה שורצת והכינו צלחות פחם צואה ^9,10.
3. הניחו צלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לאפשר לתולעים החופשיות להתפתח למבוגרים צעירים.
4. בלילה שלפני יום ההזרקה, הניחו בעלי חיים מארחים לא נגועים בכלובי איסוף.
5. ביום ההזרקה, אספו צואה לא שורצת לצורך גידול לאחר ההזרקה.

3. ביצוע תערובת המיקרו-איניג'קציה: לפני או ביום ההזרקה או ביום ההזרקה

הערה: תערובת המיקרו-איניג'קציה מורכבת מהפלסמידים בעלי העניין המדוללים לריכוז הרצוי בתמלחת התולעת (BU) (50 mM Na₂HPO₄, 22 mM KH₂PO₄, 70 mM NaCl)¹¹.

1. לקבוע את הריכוז של מניות הפלסמיד ואת הריכוז הרצוי בתערובת המיקרו-איניג'קציה (טבלה 1).

תמהיל מיקרו-איניג'קציה: מבנה כתבים
רכיב	ריכוז מלאי	כמות	ריכוז סופי
pMLC30 gpa-3::gfp	300 ננוגרם/מיקרול	1.7 μL	50 ננוגרם/מיקרול
ב.א.	נה	8.3 מיקרול	נה
סך		10 μL	50 ננוגרם/מיקרול
תערובת מיקרו-איניג'קציה: מוטגנזה של CRISPR/Cas9
רכיב	ריכוז מלאי	כמות	ריכוז סופי
pMLC47 מס-4 sgRNA	300 ננוגרם/מיקרול	2.7 מיקרול'	80 ננוגרם/μL
pEY11 Ss-tax-4 HDR פלסמיד	400 ננוגרם/מיקרול	2.0 μL	80 ננוגרם/μL
pPV540 strCas9 פלסמיד	350 ננוגרם/מיקרול	1.1 מיקרול	40 ננוגרם/μL
ב.א.	נה	4.2 מיקרול	נה
סך		10 μL	200 ננוגרם/μL
תערובת מיקרו-אינטגרציה: אינטגרציה piggyBac
רכיב	ריכוז מלאי	כמות	ריכוז סופי
pMLC30 gpa3::gfp	300 ננוגרם/מיקרול	2.0 μL	60 ננוגרם/μL
pPV402 טרנספוסאז פלסמיד	450 ננוגרם/μL	0.9 μL	40 ננוגרם/μL
ב.א.	נה	7.1 מיקרול	נה
סך		10 μL	100 ננוגרם/μL

טבלה 1: דוגמאות לתערובות מיקרו-איניג'קציה. הפלסמידים והריכוזים עבור שלושה תערובות מיקרו-איניג'קציה לדוגמה: אחד עבור כתב gpa-3::GFP מבנה¹⁰, אחד עבור שיבוש בתיווך CRISPR/Cas9 של לוקוס Ss-tax-4 ^14,15, ואחד עבור אינטגרציה בתיווך piggyBac של מבנה Ss-gpa-3::GFP 13,17,18. strCas9 מציין את הגן Cas9 המותאם לקודון סטרונגילואידס. הריכוזים הסופיים המפורטים משמשים בדרך כלל בתערובות מיקרו-איניג'קציה של סטרונגילואידים.

2. דיללו את הפלסמידים ב-BU לנפח כולל של 10-20 מיקרול'.
3. סובבו את התערובת דרך עמודת סינון ב-5,000 × גרם למשך 1-2 דקות.
4. השתמש בתערובת המיקרו-איניג'קציה באופן מיידי או אחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

4. לאסוף צעירים סטרונגילואידים למיקרו-איניג'קציה: בוקר יום ההזרקה

1. הגדירו את מנגנון בארמן עם צלחת פחם-צואה אחת של סטרונגילואידים בוגרים צעירים (איור 2).
   הערה: צלחת הצואה-פחם עשויה להכיל זחלים מזהמים מסוימים. ציוד מגן אישי מורכב ממעיל מעבדה, כפפות והגנה על העיניים. אין לחשוף עור בין הכפפה לשרוול מעיל המעבדה.

איור 2: מנגנון בארמן שימש לאיסוף תולעים טפיליות מתרבויות¹⁰. התוכן של צלחת צואה-פחם ממוקמים בראש עמוד של מים חמים. התולעים נודדות למים ונלקטות בתחתית המשפך. (A) כדי להקים את מנגנון בארמן, המעמד של משפך בארמן מהודק לספסל עם מהדק C. צינור גומי המחובר לקצה המשפך סגור במהדקי צביטה, ודלי תפיסה מונח מתחת לצינור לטפטוף. מים חמים מתווספים למשפך הזכוכית. (B) מחזיק טבעת הפלסטיק לתערובת הצואה-פחם מרופד לאחר מכן ב-3 פיסות של רקמות מעבדה (משמאל). מקל עץ או מדכא לשון (באמצע) משמש להעברת התוכן של צלחת פחם צואה (מימין) למחזיק טבעת הפלסטיק. (C) תקריב של החלק התחתון של מחזיק טבעת הפלסטיק לתערובת הצואה-פחם, המציג את השכבה הכפולה של טול הניילון המציפה את החלק התחתון של המחזיק. (D) מחזיק הצואה-פחם ממוקם לאחר מכן על החלק העליון של משפך הזכוכית. (E) רקמת המעבדה נרטבת במים ונסגרת מעל תערובת הצואה-פחם. מים חמים יותר מתווספים בעיקר כדי להטביע את פחם הצואה. (F) מערך בארמן השלם, עם תרבות הצואה-פחם שקועה מתחת למים חמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. התקינו משפך זכוכית עם צינורות איסוף גומי על מעמד טבעת באמצעות טבעת O והצמידו אותו למהדק. סגור את צינורות הקולקציה עם 2 מלחצי צביטה (איור 2A).
3. הניחו דלי תפיסה מתחת למשפך כדי לתפוס טפטופים.
4. מוסיפים מים חמים (כ-40 מעלות צלזיוס) למשפך עד 5 ס"מ מתחת לשפה. ודא שהמערכת אינה דולפת.
5. מרפדים את מחזיק ה-Baermann, מסננת העשויה מ-2 טבעות פלסטיק עם 2 שכבות של רשת ניילון טול מאובטחת ביניהן, עם 3 פיסות חופפות של רקמת מעבדה. הוסיפו את תערובת הצואה-פחם למחזיק ה-Baermann (איור 2B,C).
6. מניחים את מחזיק ה-Baermann עם תערובת הצואה-פחם במשפך. קפלו את הרקמות סביב תערובת הצואה-פחם והוסיפו מספיק מים כדי להטביע את רוב הצואה-פחם. אין למלא מעל 2 ס"מ משפת המשפך (איור 2D,E).
7. מעל המשפך מכסה צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 15 ס"מ כדי להכיל את הריח. תייג את המשפך לפי הצורך (איור 2F).
8. המתן 30 דקות עד שעה אחת כדי לאסוף את התולעים ממנגנון בארמן.
9. החזק צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל מתחת לצינורות הגומי בתחתית המשפך. פתח בזהירות את המהדקים בתחתית כדי לחלק 30-40 מ"ל של מים המכילים תולעים לתוך צינור 50 מ"ל.
10. העבר 15 מ"ל של מי בארמן המכילים את התולעים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. סובבו את צינור הצנטריפוגה 15 מ"ל למשך דקה אחת במהירות של כ-750 × גרם (איטי). לחלופין, אפשרו לתולעים להסתפק ב-10-15 דקות.
11. מוציאים את ה-supernatant ל-~2 מ"ל ומשליכים את ה-supernatant לתוך מיכל נוזל פסולת עם יוד כדי להרוג תולעים.
12. מוסיפים עוד מי בארמן לצינור האיסוף של 15 מ"ל וחוזרים על הסיבוב. הסר את ה-supernatant ל-~2 מ"ל והשליך כמו בשלב 4.11.
13. חזור על שלבים 4.11 ו- 4.12 עד שכל התולעים נאספות בצינור הצנטריפוגה 15 מ"ל. לאחר הסיבוב הסופי, הסר כמה שיותר מים.
14. בדוק את גלולת התולעים (40-100 μL) בתחתית הצינור. אם לא ניתן לראות תולעים, חכו עוד 1-2 שעות ונסו לאסוף תולעים נוספות ממנגנון בארמן.
15. מעבירים את התולעים בכמה שפחות מים לצלחת NGM של 6 ס"מ 2% עם מדשאה של E. coli HB101. השתמש בצלחת זו כצלחת המקור למיקרו-איניג'קציה.
16. יש להשליך את תערובת הצואה-פחם על ידי טיפול בה ביוד מדולל (דילול של 50% של היוד של לוגול במים), לעטוף אותו בסרט פלסטיק כדי לתפוס טפטופים, ולהניח אותו במיכל פסולת ביו-האזרד.
17. מוסיפים 10 מ"ל של יוד מדולל לדלי התפיסה ומנקזים לתוכו את עודפי המים מהברמן.
18. שטפו את הרכיבים הרב-פעמיים (המשפך, דלי התפיסה, מחזיק הפלסטיק בטול, מכסה הפלסטיק והמהדקים) ב-10% אקונומיקה ושטפו היטב.

5. משיכה וטעינה של מחטי מיקרו-ייצור: רגע לפני ההזרקה

1. הכן מחטים microinjection על ידי משיכת צינורות נימי זכוכית באמצעות מושך מחט.
   הערה: הגדרות לדוגמה עבור מושך מחט מסחרי המצויד בחוט פלטינה/אירידיום 3 מ"מ הן חום = 810-820, משיכה = 800-820, מיקרומטר = 2.5.
2. צפו בטיפים מתחת למיקרוסקופ ניתוח. אם למחטים יש את הצורה הרצויה (איור 3A-F), משכו 4-6 מחטים (2-3 צינורות נימיים). כדי להשיג את צורת המחט הנכונה, שנה את ההגדרות לפי הצורך: התאם את הגדרות החום או המשיכה ב- 10 ומשך מחטים חדשות עד שצורת המחדד והפיר מתאימים יותר.

איור 3: מחטי מיקרו-איניג'קציה ונקבה בוגרת סטרקורליס סטרקורליס סטרונגילואידית עם אתרים אופטימליים למיקרו-איניג'קציה שזוהו. (א-ב) מחדד הפיר (A) וקצה (B) של מחט שצורתה נכונה למיקרו-זירה. הקצה חד מספיק כדי לחדור את הציפורן וצר מספיק כדי לא לגרום נזק מוגזם. (ג-ד) הפיר מתחדד (C) וקצה (D) של מחט מיקרו-איניג'קציה המעוצבת באופן שגוי למיקרו-איניג'קט. הקצה בוטה ורחב מדי, ויגרום נזק מוגזם לתולעת. (ה-ו-ו) מחדד הפיר (E) וקצה (F) של מחט שככל הנראה ארוכה ודקה מכדי לעבוד עבור מיקרו-אינגיה. הקצה ב-F דומה מאוד לקצה ב-D. עם זאת, הפיר צר וגמיש מכדי לחדור ביעילות את הציפורן. בנוסף, מחטים דקות מאוד נסתמות בקלות. (G) תמונה של התולעת כולה הממוקמת כהלכה לצורך מיקרו-אינץ', בהנחה שהמחט נכנסת מימין. קדמי הוא למטה ומשמאל; הפות מסומן על ידי ראש החץ. הגונד נראה לאורך הצד הימני של הנקבה. לנקבה זו יש רק ביצית אחת ברחם שלה (מסומנת על ידי הכוכבית). (ח, א) תצוגות מוגדלות של אתרי המיקרו-איניג'קציה. זווית החץ מעריכה את זווית מחט ההזרקה. הפות יכול לשמש כנקודת ציון; הוא נמצא בצד הנגדי של התולעת מזרועות הגונד. זרועות הגונד מתעקלות סביב המעי, והקצוות עם הגרעינים המפרידים נמצאים מול הפות. (ח) הזרוע האחורית של הגונד; (I) הזרוע הקדמית. ניתן להזריק את אחת הזרועות או את שתיהן. עבור H, I, מוסכמות הן כמו ב-G. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר (B, D, F, H, I); 100 מיקרומטר (A, C, E, G). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. אחסנו את המחטים המשוכות בצלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 15 ס"מ עם חתיכת סרט מגולגל כדי לאבטח את המחטים ולמנוע הצטברות אבק על הקצוות.
4. מניחים טיפה של 0.7 μL של תערובת המיקרו-איניג'קציה על הקצה הפתוח של הפיר. תלו את המחט בניצב למדף באמצעות פיסת נייר דבק מגולגלת כדי למלא את הפיר המחודד בתערובת תוך 10 דקות. להכין 2 מחטים בכל פעם במקרה הראשון לא עובד.

6. הכנת המיקרוסקופ ושבירת המחט

הערה: Microinjection משתמש במיקרוסקופ הפוך עם מטרות פי 5 ו-40x המצוידות במערך מיקרו-איניג'קטור כדי לשלוט בתנועת המחט. יש להניח את המיקרוסקופ ההפוך על שולחן כבד או על שולחן אוויר נגד רעידות כדי להפחית את רעשי הרטט. מחזיק המחט של המיקרו-איניג'קטור מחובר לגז חנקן שמפעיל את הלחץ הדרוש כדי לספק את תערובת המיקרו-איניג'קטור. מיקרוסקופ ניתוח קטן יותר בקרבת מקום משמש להעברת התולעים.

1. הגדר את לחץ מיכל הדלק ל~ 40-60 psi לשבירת המחט ול~ 30-50 psi למיקרו-איניג'קט, בהתאם לזרימת הנוזל.
2. במיקרוסקופ הניתוח, כסו את שברי הזכוכית על כרית המיקרו-איניג'קציה המכסה בשמן הלוקרבון באמצעות פיק תולעי פלטינה סטנדרטי.
3. מניחים את כרית המיקרו-איניג'קציה על היקף המיקרו-איניג'קציה ומאתרים את שברי הזכוכית המכוסים בשמן. יישמו את רסיס הזכוכית כך שקצה יהיה מאונך לכיוון המחט כדי לשמש כמשטח המשמש לשבירת המחט.
4. ודא שלמחט אין בועות או פסולת בפיר המחודד באמצעות מיקרוסקופ הניתוח. לאחר מכן, אבטח את המחט 1-1.5 ס"מ לתוך מחזיק הלחץ.
5. מקם את קצה המחט במרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ בעין. לאחר מכן, תחת הגדלה נמוכה, מקם את קצה המחט בשדה הראייה, בניצב לצד רסיס הזכוכית.
6. עברו לעוצמה גבוהה ויישרו את קצה המחט עם קצה הזכוכית, בסמוך אליה אך לא נוגעים בה.
   הערה: כאשר מושכים, המחטים מתמזגות סגורות.
7. כדי לשבור את קצה המחט כדי לאפשר זרימת נוזלים, הקישו עליה בעדינות על דופן פיסת הזכוכית תוך הפעלת לחץ רציף מהגז (איור משלים S1). ברגע שהנוזל מתחיל לזרום, בדקו את צורת הקצה וודאו שהוא חד עם נוזל זורם בקלות.
   הערה: אם הנוזל זורם מהר מדי או שהקצה קהה מדי, התולעים יינזקו במהלך מיקרו-איניג'ינג (וידאו 1 ואיור 3A-F).
8. כאשר הנוזל זורם היטב מהמחט, הזיזו את שקופית המיקרו-איניג'קציה להיקף הניתוח והניחו טיפות של שמן הלוקרבון 1-2 μL על כרית האגר למיקום התולעים.
9. העבירו 20-30 סטרונגילואידים צעירים לצלחת 2% NGM ללא חיידקים למשך 5 דקות לפחות כדי להסיר עודפי חיידקים על פני השטח ולבחור תולעים בודדות למיקרו-זירה. הוסיפו עוד תולעים לצלחת ה-NGM לפי הצורך בזמן ההזרקה.

7. מיקרו-איניג'קטינג סטרונגילואידים

1. השתמשו בכמות קטנה של שמן הלוקרבון על פיק תולעת כדי לבחור נקבה בוגרת צעירה של סטרונגילואידס עם 1-4 ביצים בגונד שלה מתוך צלחת 2% NGM ללא חיידקים.
2. מעבירים את התולעת לתוך טיפת שמן זעירה על כרית האגר. באמצעות בחירת התולעת, מקם בעדינות את התולעת כך שהיא לא תהיה מפותלת והגונדה תהיה גלויה וקלה לגישה. שימו לב לכיוון הגונד (איור 3G).
3. מקם את התולעת בשדה הראייה של מיקרוסקופ המיקרו-איניג'קציה. ודאו שהגונאד נמצא באותו צד של המחט וממוקם כך שהמחט תיצור קשר עם הגונד בזווית קלה (איור 3H,I).
4. הביאו את קצה המחט לצד התולעת באותו מישור מוקד. כוון לזרוע הגונד ליד מרכז התולעת. השתמש במיקרו-איניג'קטור כדי להכניס את המחט בעדינות לתוך הגונד (וידאו 2).
5. מיד להפעיל לחץ על המחט כדי למלא בעדינות את כל זרוע gonad עם תמיסת DNA. קבעו בעין מתי הוזרק מספיק נוזל (וידאו 2).
   הערה: ייתכן שיחלפו עד 2 שניות כדי למלא את הגונד.
6. הסר את המחט ובדוק כדי לקבוע שהפצע נסגר.
   הערה: התולעת פגומה מכדי לייצר צאצאים אם הגונד בולט דרך דופן הגוף (סרטון משלים S1).
7. חזור על הפעולה עם הזרוע השנייה של הגונד אם היא נראית לעין.
8. בסיום ההזרקה, ודא במהירות שהמחט אינה סתומה על ידי הפעלת לחץ עם קצה המחט על כרית האגר. העבר את המגלשה עם התולעת המוזרקת למיקרוסקופ הניתוח.
9. כדי לשחזר את התולעת המוזרקת, תחילה הניחו כמה טיפות BU על התולעת כדי להציף אותה מעל כרית האגר.
10. אספו כמות קטנה של חיידקי HB101 על קטיף תולעים. געו בתולעת עם החיידקים הדבקים על פיק התולעת כדי להסיר אותה מהנוזל.
11. מעבירים בעדינות את התולעת לצלחת ההתאוששות, לוחית NGM של 2% המכילה מדשאת HB101.
    הערה: התולעת אמורה להתחיל לזחול תוך דקות ספורות.
12. לאחר שהוזרקו כמה נקבות, הוסיפו כמה זכרים לא מזוהים מלוחית המקור.
    הערה: מינימום של זכר אחד לחמש נקבות הוא בסיס טוב; עדיף עודף של זכרים.
13. חזרו על כל השלבים עד שיוזרקו מספיק נקבות לניסוי.
14. השאירו את המבוגרים על צלחת ההחלמה לפחות שעה אחת לאחר ההזרקה כדי לאפשר לתולעים להתאושש ולהזדווג.

8. התאוששות והתרבות של סטרונגילואידים מוזרקים

1. אספו צואה במהלך הלילה מבעלי חיים פונדקאים לא נגועים, תוך שימוש באותו פרוטוקול כמו עבור בעלי חיים נגועים.
2. מערבבים את הצואה הלא שורצת עם כמות קטנה של פחם (יחס צואה לפחם של כ-2 ל-1 עבור צלחות אלה).
3. יוצקים כמות קטנה של תערובת פחם-צואה לתוך צלחת פטרי 6 ס"מ מרופדת בנייר מסנן לח. יש לוודא שהתערובת אינה נוגעת במכסה של המנה.
4. הצפת את צלחת ההתאוששות ב- BU. באמצעות פיפטה שנקבעה על 3 μL, העבר את התולעים לצואה בצלחת הפחם-צואה. מניחים את התולעים ישירות על הצואה, לא על הפחם.
5. ודא שהבוגרים נמצאים על צלחת הצואה-פחם באמצעות היקף ניתוח.
6. כדי לתרבת את התולעים, הניחו את הצלחת בחדר לח, כלומר קופסת פלסטיק עם מכסה צמוד מרופד במגבות נייר לחות.
   הערה: לאחר יומיים, יהיה שילוב של שלבי זחל. לאחר 5 ימים, רוב הזחלים יתפתחו ל-iL3s; כמה זחלים צעירים יותר יישארו. לאחר 7 ימים, כל הזחלים צריכים להיות iL3s.

9. איסוף וסינון של זחלי F ₁ לשחזור זחלים מהונדסים/נוקאאוטים

1. באמצעות מערך בארמן, אספו את הזחלים מלוחות גידול הצואה-פחם בקנה מידה קטן לאחר ההזרקה. כדי להשיג כמה שיותר זחלים, יש להמתין לפחות שעתיים לפני שתחלימו את התולעים ממנגנון בארמן.
2. ריכז את הזחלים בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל כמו בשלבים 4.10-4.14 והעביר את הזחלים לכוס שעון קטנה עם BU.
3. אם הזחלים ישמשו לניסויים התנהגותיים, השתמשו ב-2% לוחות NGM עם מדשאה עבה של HB101 להקרנה.
   1. העברת 20-30 זחלים למדשאת HB101.
      הערה: החיידקים יאטו את תנועת הזחלים.
   2. תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, זהה את הזחלים המבטאים את הטרנסג'ין המעניין. השתמשו בבחירת תולעים כדי לבחור את הזחלים המהונדסים ולהעביר אותם לכוס שעון קטנה עם BU.
   3. השתמש בלוח HB101 חדש כדי לסנן קבוצה קטנה נוספת של זחלים. כאשר נאספו מספיק זחלים לשימוש ניסיוני, טפלו בצלחות HB101 ובתולעים העודפות עם יוד מדולל (50% היוד של לוגול מדולל במים) והשליכו אותם כפסולת ביו-האזרד. לחלופין, הרגו את התולעים העודפות באמצעות מנקה מלונה מרוכז המכיל אלקיל בנזיל אמוניום כלוריד.
   4. השתמשו בתולעים באופן מיידי או השאירו אותן בכוס שעון רדודה בכמות קטנה של BU למשך הלילה.
      הערה: תולעים עלולות להפוך היפוקסיות אם הנוזל עמוק מדי. ייתכן כי השארת זחלים ב- BU למשך הלילה עשויה להשפיע על התנהגויות מסוימות; לכן, השתמש בזחלים לניסויים התנהגותיים תוך 6 שעות.
4. אם הזחלים ישמשו למיקרוסקופיה ולא לבדיקות התנהגותיות, אז ישתקו את התולעים על ידי שיתוק ניקוטין באופן הפיך להקרנה.
   1. באמצעות סכין גילוח, הצמידו רשת לתחתית הפלסטיק של צלחת chemotaxis^{בקוטר 10} ס"מ 12 כדי להקל על המעקב אחר מיקום התולעים בצלחת.
   2. זרוק ~ 3 μL של זחלים ב- BU לתוך ריבוע ברשת. מלאו כמה ריבועים לפי הצורך. אין להשתמש באלה הסמוכים לשולי הצלחת, שכן הזחלים עשויים לזחול לצידי הצלחת.
   3. מוסיפים טיפות של 15-20 μL של 1% ניקוטין במים לטיפות התולעת.
      הערה: לאחר 4 דקות, התולעים יהיו משותקות.
   4. המסך את התולעים באמצעות מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי.
   5. השתמש בחריק תולעים כדי להעביר את הזחלים המהונדסים לכוס שעון קטנה עם 1-2 מ"ל של BU.
      הערה: הזחלים יהיו משותקים במשך מספר שעות וניתן יהיה להרכיבם בקלות על שקופיות מיקרוסקופ לצורך מיקרוסקופיה. אם יישארו במשך הלילה ב-BU, ה-iL3s יתאוששו וניתן יהיה להשתמש בהם לבדיקות מסוימות או לזיהום מארח של יונקים. עם זאת, שיתוק ניקוטין ודגירה לילית ב- BU עשויים להשפיע על התנהגויות מסוימות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אם הניסוי היה מוצלח, הזחלים F₁ יבטאו את הפנוטיפ הטרנסגני ו/או המוטנטי המעניין (איור 4). עם זאת, שיעורי הטרנספורמציה משתנים מאוד ותלויים במבנים, בבריאות התולעים, בתנאי התרבות שלאחר ההזרקה ובמיומנות של הנסיין. באופן כללי, ניסוי מוצלח יניב זחלים >_{15 F 1} לכל נקבה מוזרקת ו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול מיקרו-איניג'קציה זה מפרט את השיטות להחדרת מבנים לטרנסגנזה ומוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 לתוך S. stercoralis ו-S. ratti. הן עבור S. stercoralis והן עבור S. ratti, ההישרדות לאחר ההזרקה ושיעור הטרנסגנזה או המוטגנזה כפופים למספר משתנים הניתנים לכוונון עדין.

השיקול הקריטי הראש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth)	VWR	470121-790	C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE	Phenix	RBA-500	agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh	Ebonex	n/a	charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh	Reade	bonechar10x28	charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator	Narishige	MMN-1	coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Fisher	07-200-385	microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness	Brain Research Lab	4860-1	coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter	VWR	82050-918	10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod	Fisher	12-000-101	stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips	VWR	89009-310	for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads	Fisher	14-206-62	bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings	Fisher	14-050CQ	Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe	McMaster-Carr	7541A51	glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD	McMaster-Carr	3038K24	tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase	VWR	89001-414	Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors	Fisher	15-235-101	bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence	Leica	M165 FC	GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder	Tritech	MINJ-4	microinjection needle holder
microINJECTOR system	Tritech	MINJ-1	microinjection system
Mongolian Gerbils	Charles River Laboratories	213-Mongolian Gerbil	gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz	VWR	11216-776	Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh)	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch	Thomas Scientific	1233S72	platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W)	VWR	62505-007	wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu:LE Long Evans	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd:Sprague Dawley SD	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	Office Depot	452369	plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches	Newco	999589	techboard
Stainless steel raised wire floor	Ancare	R20SSRWF	wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000	Office Depot	9587303	spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm	Carolina (Science)	741012	watch glasses (small, round)
Stereomicroscope	Motic	K-400 LED	dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite	Grainger	53GN16	plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller	Sutter	P-30/P	needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses	Fisher	S34826	watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps	Fisher	05-769-2Q	funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator	Narishige	MM0-4	fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps	Fisher	S99422	Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter)	Tritech Research	T3308P	6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers	VWR	82003-820	lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in	Carolina (Science)	742300	watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter	Fisher	09-805B	filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter	Fisher	09-805D	filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in	Fisher	50-821-813	glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade	Office Depot	238816	X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1	Zeiss	n/a	inverted microscope