רישום לחץ תוך מערה במודל חולדה עם פגיעה עצבית במערה

Summary

פרוטוקול זה מתאר פיתוח מודל חולדה יציב של פגיעה עצבית דו-צדדית של כריתה רדיקלית של הערמונית הקשורה לתפקוד לקוי של זיקפה ומדידת לחץ תוך מערות.

Abstract

מודל החולדה לפגיעה בעצב המערה הדו-צדדי (CN) שימש באופן נרחב כדי לדמות פגיעה עצבית מערה קלינית הקשורה לתפקוד לקוי של זיקפה (ED) להערכת ההשפעה של שיטות טיפוליות קליניות. עם זאת, השיטות לבניית מודל פציעות CN פגומות ומגוונות בתחום המחקר של ED. פציעת ריסוק CN היא השיטה הנפוצה ביותר בשנים האחרונות. מחקר זה נועד לספק תיאור מפורט של ההליך של בניית מודל חולדה לפגיעה ב-CN דו-צדדי ומדידה של רישום לחץ תוך מערה (ICP), ולספק מודל חולדה אמין וניתן לשחזור. עבודה זו פיתחה בהצלחה את שיטת פציעת CN לפציעת ריסוק המוסטט באמצעות מחט מזרק כתמיכה קשיחה והמוסטט עם שרוול גומי. כמו כן, שיטה זו מסיקה כי מתח של 1.0 וולט, תדר של 20 הרץ ורוחב דופק של 5 אלפיות השנייה הם פרמטרי הגירוי האופטימליים להקלטת ICP במודל חולדה דו-צדדי של פגיעת CN.

Introduction

הפרעות זקפה היא אחת המחלות השכיחות אצל גברים בוגרים. ההערכה היא שמספר חולי הפרעות הזקפה בעולם יגיע ל-322 מיליון עד 2025¹. סקר מדגם נרחב רב-מרכזי בסין מראה כי שיעור הפרעות הזקפה הנגרמות על ידי ניתוח אגן או טראומה הוא כ-8%². למרות השיפור המתמיד של טכניקות כירורגיות ומכשירים כירורגיים, שכיחות הפרעות זקפה עדיין גבוהה. נחשב כי התפתחות והתקדמות של הפרעות זקפה לאחר כריתה רדיקלית של הערמונית (RP) תורמת לפגיעה עצבית במערה וכתוצאה מכך לניוון של השריר החלק של הקורפוס קוורנוזום, אפופטוזיס של תאי אנדותל ושיפוץ פתולוגי ^3,4.

לחקר המנגנון של שינויים המודינמיים והיסטופתולוגיה של פגיעת CN הקשורה להפרעות זקפה, פותחו והוערכו מספר סוגים שונים של מודלים של בעלי חיים עם פגיעות CN, כולל מכרסמים, כלבים, חתולים וקוף ^5,6,7. בהסתמך על היתרונות בהוצאה וביכולת השחזור, מודל החולדה הדו-צדדי של פגיעת CN הפך למודל הנפוץ ביותר להערכת הפרעות זקפה לאחר ניתוח אגן רדיקלי⁸. עם זאת, צורות שונות של פגיעה עצבית דווחו בספרות רבות שההבדלים העיקריים ביניהם הם גישות של פגיעה עצבית (ריסוק, הקפאה, חתך וכריתה)^9,10,11. יתר על כן, מגוון הגישות לפגיעה עצבית עלול להוביל לחוסר עקביות בפרמטרים של רישום לחץ תוך מערה (ICP) במודל החולדה, הקובע את הדיוק וההערכה של ICP⁸. עם זאת, אין עדיין שיטה סטנדרטית לגרימת פגיעה עצבית ורישום ICP של המודל.

לכן, מחקר זה נועד לבנות מודל אמין יותר וניתן לשחזור של חולדות פציעות CN דו-צדדיות. שיטה זו מספקת תיאור מפורט של הליך בניית המודל ומדידת ICP, שעשויים להועיל לחקר המנגנונים של הפרעות זקפה ולפיתוח טיפולים יעילים בעתיד.

Protocol

במחקר זה נעשה שימוש בחמישה עשר חולדות ספראג-דולי זכרים בוגרים (בני 3 חודשים) במשקל של בין 300-350 גרם. כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ה-NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור בית החולים החמישי המסונף לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סון יאט-סן. בעלי החיים שוכנו במתקן נוח עם בקרת טמפרטורה ואור.

1. הכנה לחומרים להליך כירורגי

1. הכן את המכשירים הבאים: אזמל, מספריים לרקמות, מספריים חוטים, מלקחיים לכיפוף, מלקחיים לרקמות, מלקחיים מיקרו-כירורגיים, מלקחיים המוסטטיים של יתושי הרטמן, יריעות כירורגיות סטריליות, מחזיק מחט מיקרו, מחזירי בטן חולדות ומערכת איסוף ועיבוד אותות ביולוגיים (ראה טבלת חומרים).
   1. עקר את כל המכשירים הכירורגיים לפני הניתוח. השתמש במגבוני אלכוהול (70% אתנול) לניקוי אזור הניתוח.
      הערה: יש לעקר את המכשירים הכירורגיים על ידי טבילת אלכוהול למשך הלילה.
2. הכן את מערכת הקלטת הלחץ
   1. חבר מזרק של 10 מ"ל המכיל מלח הפרין ומחט היפודרמית של 25 גרם לתא עצירה תלת כיווני עם צינור (אורך 20 ס"מ). שטפו את הצינור המעוקר במי מלח הפרין סטריליים (200 U/mL).
      הערה: מילוי הצינור במי מלח הפרין מונע הכנסת בועות אוויר למערכת.
3. הרם את מחט ה-25 גרם 20 ס"מ (רק אורך הצינור) מעל משטח הניתוח של החיה. לאחר מכן בדוק את דיוק המדידה של מערכת הקלטת הלחץ על ידי שטיפה או הקשה.

2. הכנת החיה

1. הרדמת חולדות על ידי הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג) (ראה טבלת חומרים).
   הערה: כדי לאשר עומק מספיק של הרדמה, בוצעה הערכה של קצב הנשימה הספונטני והרפלקסים של חולדה באמצעות צביטה של כף הרגל האחורית.
2. יש למרוח משחה על העיניים הדו-צדדיות כדי למנוע יובש בקרנית.
3. לאחר אישור הרדמה מתאימה, יש לגלח את החצי התחתון של הבטן, הצוואר והפרינאום באמצעות מכונת גילוח חשמלית. הניחו את החולדה במצב שכיבה על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס). ללבוש כפפות רפואיות כדי לשמור על תנאים סטריליים במהלך הליכים כירורגיים.

3. הליך בידוד ופציעה של CN

1. השתמש באזמל כדי לבצע חתך של 4 ס"מ דרך העור בבטן התחתונה, קו האמצע. כדי לחשוף באופן מלא את שלפוחית השתן והערמונית, השתמש במספריים לרקמות ובמלקחיים לרקמות כדי לבצע חתך באורך תקין דרך הפאשיה התת עורית, רקמת השריר והצפק.
2. השתמש במחזיר בטן חולדה כדי להגדיל את מפת השדה האופרטיבית. השתמש בצמר גפן סופג כדי להפריד את הערמונית מהרקמות הסמוכות, כגון רצועות.
   הערה: ניתן למצוא גנגליון אגן עיקרי (MPG) ו-CN באחד משני האזורים האחוריים של הערמונית.
3. השתמש במספריים מיקרו זוויתיים כדי לחתוך את הפאשיה המכסה CN 1-6 מ"מ דיסטלי ל-MPG. לאחר מכן החלק תפר 9-0 מתחת ל-CN בעזרת מלקחיים מיקרו-כירורגיים.
4. הנח מחט מזרק (25 גרם) מתחת ל-CN, 5 מ"מ דיסטלי ל-MPG. לאחר מכן שים את המוסטט לאור מבנה הסנדוויץ' "קצה המוסטט-מזרק-מחט-עצב-קצה המוסטט" (איור 1 ואיור 2).
   הערה: מחט המזרק צריכה להיות שטוחה.
5. מרחו את ההמוסטט עם סגירת קצה מלא במרחק של 5 מ"מ מהגנגליון למשך דקה אחת, ואז משכו את המוסטט ואת מחט המזרק (איור 2).
6. הרימו מעט את העצב באמצעות תפר 9-0, והניחו את הווים של האלקטרודה הדו-קוטבית (ראו טבלת חומרים) סביב ה-CN 2-4 מ"מ דיסטלי ל-MPG (איור 3).
   הערה: שני זוגות של MPG ו-CN הופעלו באותו אופן.

4. צנתור של הקורפוס קוורנוזום וגירוי ה-CN למדידת ICP

1. שטפו את הצינור במי מלח הפרין סטריליים (200 U/mL) לפני הכנסתו לקורפוס קברנוזום.
2. החזק את מחט ה-25 G ושמור על כיוון ההכנסה במקביל למהלך הקורפוס קברנוזום (איור 3).
   הערה: יש למתוח את הטוניקה אלבוגינאה, כדי להקל על ההחדרה.
3. דחוף את מחט ה-25 G 6 מ"מ לתוך הקורפוס קוורנוזום (איור 3). שטפו את הצינור ולחצו קלות על הקורפוס קברנוזום כדי להעריך את רגישות המתמר (איור 4). כדי למנוע נפילה בשוגג, תקן את הצינור על שולחן העבודה בעזרת סרט דבק.
4. השתמש בפרמטרים הבאים לגירוי CN: מתח ב-1.0 וולט, תדר ב-20 הרץ, רוחב דופק ב-5 אלפיות השנייה. יש למרוח דקה אחת של גירוי עם 5 דקות מנוחה בין הגירוי הבא.
   הערה: סובב את תא העצירה התלת-כיווני לתעלת מתמר הלחץ בעת תחילת המדידה.

5. טיפול לאחר הניתוח

1. הניחו את החולדות על כרית מחוממת (37 מעלות צלזיוס) ועקבו אחריהן בקפידה להתאוששות מהרדמה.
2. לשליטה בכאב לאחר הניתוח, יש לספק תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (כגון קרפרופן, 0.5 מ"ג/ק"ג, הזרקה תת עורית) (ראה טבלת חומרים) כאשר החולדות מתאוששות לחלוטין.
3. העבירו חולדות לכלוב אספטי ועקבו אחריהן יומיים כדי להעריך את מצב ההזנה, המצב הנפשי והזיהום של הפצע החתך.

תוצאות

הליך הניתוח ייצר עקומת תגובה ICP טיפוסית באמצעות פרוטוקול זה עם הגדרות הגירוי המומלצות. עקומת תגובת ה-ICP עולה באופן מיידי כאשר מגרים את העצב ויורדת כאשר הגירוי נסוג (איור 5). חיוני לבחון את קו הלחץ התוך-מערה לפני מדידת ה-ICP, המשפיע על הערכת ערכי ICP מוגברים (

Discussion

הפרעות זקפה הן סיבוך חמור של ניתוח אגן או טראומה. למרות שהוא עובר ניתוח חוסך עצבים, שיעור ההיארעות של הפרעות זקפה הוא כ-14-90% בכריתת ערמונית רדיקלית (RP)¹². בשל ההתחדשות הבעייתית של CN הפציעה, ההשפעה המרפאת הקלינית אינה משביעת רצון. לפיכך, מודל חייתי יציב של פגיעת CN...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 G needle	BD Bioscience	367391
Abdominal retractor	RWD Life Science	R22009-01
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Bending forceps	RWD Life Science	F12011-10
Biological signal acquisition and processing system	Techman Software	BL-420S
Bipolar electrode	Techman Software	AC0047
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
HARTMAN mosquito hemostatic forceps	RWD Life Science	F22002-10
Heparin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	2608411
Micro needle holder	RWD Life Science	F31047-12
Microsurgery forceps	RWD Life Science	F11001-11
Scalpel	RWD Life Science	S32003-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
Thread scissors	RWD Life Science	S15001-11
Tissue forceps	RWD Life Science	F13019-12
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14