JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע הבדלים במצב redox בזאלי ו redox תגובות perturbations חריפה בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופיה חיה קונפוצלית. ניתן להחיל את הפרוטוקול על סוגי תאים ומיקרוסקופים אחרים עם שינויים מינימליים.

Abstract

הומיאוסטזיס מיטוכונדריאלי redox חשוב עבור הכדאיות העצבית ותפקוד. למרות המיטוכונדריה מכילים מספר מערכות redox, תיול-דיסולפיד חוצץ גלוטתיון נחשב לשחקן מרכזי בהגנות נוגדות חמצון. לכן, מדידת פוטנציאל גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי מספק מידע שימושי על מצב תיקון מיטוכונדריאלי ומתח חמצוני. גלוטרדוקסין1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) הוא אינדיקטור יחסמטרי מבוסס חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המקודד גנטית (GFP) של פוטנציאל הגלוטתיון מחדש בעל שתי פסגות עירור רגישות למצב אדום ב-400 ננומטר ו-490 ננומטר עם שיא פליטה יחיד של 510 ננומטר. מאמר זה מתאר כיצד לבצע מיקרוסקופיה חיה קונפוקלית של מיטוכונדריה ממוקד Grx1-roGFP2 בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח. הוא מתאר כיצד להעריך גלוטתיון מיטוכונדריאלי במצב יציב מחדש את הפוטנציאל (למשל, להשוות מצבי מחלה או טיפולים ארוכי טווח) וכיצד למדוד שינויים redox על טיפולים חריפים (באמצעות התרופה excitotoxic N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) כדוגמה). בנוסף, המאמר מציג הדמיה משותפת של Grx1-roGFP2 ואת אינדיקטור פוטנציאל המילוכונדריה, tetramethylrhodamine, אתיל אסתר (TMRE), כדי להדגים כיצד Grx1-roGPF2 יכול להיות multiplexed עם אינדיקטורים נוספים עבור ניתוחים multiparametric. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של כיצד (i) למטב את הגדרות מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוצלי, (ii) להחיל תרופות לגירוי ואחריו כיול חיישנים עם דימיד ודית'רייטול, ו- (iii) לנתח נתונים עם ImageJ / FIJI.

Introduction

מספר אנזימים מיטוכונדריאליים חשובים ומולקולות איתות כפופים לוויסות תיול redox1. יתר על כן, המיטוכונדריה הם מקור תאי מרכזי של מינים חמצן תגובתי והם פגיעים באופן סלקטיבי לנזק חמצוני2. בהתאם לכך, פוטנציאל ההשמטה המיטוכונדריאלי משפיע ישירות על הביו-אנרגטיקה, איתות התא, תפקוד המיטוכונדריה, ובסופו של דבר על כדאיות התא3,4. המטריצה המיטוכונדריאלית מכילה כמויות גבוהות (1-15 מ"מ) של הגלוטתיון של מאגר התיול-דיסולפיד (GSH) לשמירה על הומיאוסטזיס ולהגנות נוגדות חמצון להרה5,6. GSH יכול להיות מחובר covalenting חלבונים היעד (S-גלוטתיוניליציה) כדי לשלוט במצבם מחדש ופעילותם והוא משמש על ידי מגוון של אנזימים detoxifying להפחית חלבונים מחומצנים. לכן, פוטנציאל גלוטתיון גלוטתיון המיטוכונדריאלי הוא פרמטר אינפורמטיבי מאוד בעת לימוד תפקוד מיטוכונדריאלי ופתופיזיולוגיה.

roGFP2 היא גרסה של GFP שנעשתה רגישה ל-redox על ידי תוספת של שני צייסטנים חשופים פני השטח היוצרים זוג dithiol-disulfide מלאכותי7,8. יש לו שיא פליטה יחיד ב ~ 510 ננומטר ושתי פסגות עירור ב ~ 400 ננומטר ו 490 ננומטר. חשוב לציין, המשרעת היחסית של שתי פסגות העירור תלויות במצב ההוקסר מחדש של roGFP2 (איור 1), מה שהופך את החלבון הזה לחיישן רצימטרי. בחיישן Grx1-roGFP2, גלוטרוקסין-1 אנושי הותך לטרמינל N של roGFP29,10. התקשרות קוולנטית של האנזים Grx1 ל- roGFP2 מעניקה שני שיפורים עיקריים של החיישן: היא הופכת את תגובת החיישן לספציפית עבור זוג הגלוטתיון GSH/GSSG (איור 1), והוא מאיץ את השיוויון בין GSSG ל- roGFP2 בגורם של לפחות 100,0009. לכן, Grx1-roGFP2 מאפשר הדמיה ספציפית ודינמית של פוטנציאל הגלוטתיון התאי מחדש.

הדמיית Grx1-roGFP2 יכולה להתבצע במגוון רחב של מיקרוסקופים, כולל מיקרוסקופים פלואורסצנטיים רחבים, מיקרוסקופים קונפוקליים מסתובבים של דיסקים ומיקרוסקופים קונפוקליים לסריקת לייזר. ביטוי החיישן בתאי העצב העיקריים יכול להתבצע בשיטות שונות הכוללות ליפופקטיון11, COPRECIPitation DNA/סידן-פוספט12, העברת גנים בתיווך וירוסים או שימוש בבעלי חיים מהונדסים כמקור התא (איור 2). וירוסים רקומביננטיים מדומים (rAAV) המכילים יחס של 1:1 של חלבונים קבסידיים AAV1 ו- AAV2 13,14 שימשו לניסויים במאמר זה. עם וקטור זה, ביטוי חיישן מקסימלי הוא הגיע בדרך כלל 4-5 ימים לאחר ההדבקה ונשאר יציב לפחות שבועיים. השתמשנו בהצלחה Grx1-roGFP2 בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח מעכברים וחולדות.

במאמר זה, ביטוי בתיווך rAAV של מיטוכונדריה ממוקד Grx1-roGFP2 בהיפוקמפול חולדה ראשוני נוירונים קליפת המוח משמש להערכת מצב גלוטתיון מיטוכונדריאלי בזאלי ואת ההפרעה החריפה שלה. פרוטוקול מסופק עבור הדמיה חיה confocal עם הוראות מפורטות כיצד (i) למטב את הגדרות מיקרוסקופ קונפוקליות סריקת לייזר, (ii) להפעיל ניסוי הדמיה חיה, ו -(iii) לנתח נתונים עם FIJI.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים התאימו להנחיות הלאומיות והמוסדיות, כולל הוראת המועצה 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי, והיה להם אישור אתי מלא של משרד הפנים (המשרד לרווחת בעלי החיים של אוניברסיטת היידלברג ו- Regierungspraesidium Karlsruhe, רישיונות T14/21 ו- T13/21). נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הוכנו מעכבר או גורי חולדות שזה עתה נולדו על פי הנהלים הסטנדרטיים ונשמרו במשך 12-14 ימים כפי שתואר קודם לכן13.

1. הכנת פתרונות

  1. פתרונות מלאי עבור מאגר הדמיה
    1. הכן כל פתרון מלאי לפי טבלה 1 ולשמור אותם ב 4 °C (70 °F). לאחסון לטווח ארוך (>3 חודשים), שמור על עליקוטים ב-20 °C (70 °F).
רכיבMWריכוז (ז)סכום (ז)עוצמת קול (מ"ל)
NaCl58.44514.6150
KCl74.5531.125
MgCl2· 6H2O203.31.925
CaCl2·2H2O147.0111.4710
גליצין75.070.10.37550
סוכרוז342.31.525.6750
נתרן פירובט110.040.10.5550
HEPES238.3111.950
גלוקוז180.152.545100

טבלה 1: פתרונות מלאי עבור מאגר הדמיה.

  1. פתרונות מלאי של תרופות וצבעים
    1. להמיס דימיד (DA; משמש לכיול יחס מרבי של 405:488) במים כדי להשיג תמיסת מלאי של 0.5 M (למשל, 1 גרם ב-11.615 מ"ל של מים). Aliquot ולאחסן ב -20 °C (50 °F).
    2. להמיס dithiothreitol (DTT; משמש לכיול של יחס מינימלי 405:488) במים כדי לקבל פתרון מלאי 1 M (למשל, 5 גרם ב 32.425 מ"ל של מים). Aliquot ולאחסן ב -20 °C (50 °F) לכל היותר 3 חודשים.
    3. להמיס N-מתיל-D-אספרטט (NMDA; משמש כדי לגרום excitotoxicity חמצון מיטוכונדריאלי) במים כדי לקבל פתרון מלאי 10 mM (למשל, 25 מ"ג ב 16.991 מ"ל של מים). לאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F). לאחסון לטווח ארוך (>6 חודשים), שמור את ה- aliquots ב - -80 °C (70 °F).
    4. טטרמתילרודמין אתיל אסטר פרכלוארט (TMRE; אינדיקטור למולקולה קטנה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית)
      1. להמיס אבקת TMRE מתנול כדי להשיג מלאי 20 mM (למשל, 25 מ"ג ב 2.427 מ"ל של מתנול).
      2. לדלל את מניית 20 mM 1:1,000 במתנול כדי להשיג מניית 20 מיקרומטר.
      3. Aliquot פתרונות מלאי 20 mM ו 20 מיקרומטר, לאטום עם parafilm, ולאחסן מוגן מפני אור ב -20 °C (50 °F).
        הערה: שני פתרונות המניות יציבים במשך מספר שנים. השתמש בפתרון המלאי 1,000x (20 מיקרומטר) לניסויים.
  2. מאגר הדמיה
    1. הכן 100 מ"ל של מאגר הדמיה על ידי הוספת כל הרכיבים משולחן 2 עד 80 מ"ל של מים סטריליים בגליל מדידה. להביא את הנפח עד 100 מ"ל עם מים סטריליים. מערבבים על ידי ניעור זהיר של גליל המדידה עד שהתמיסה נראית הומוגנית.
      הערה: מומלץ להשתמש osmometer כדי לבדוק את osmolarity של המאגר. זה צריך להיות קרוב ככל האפשר למדיום הצמיחה של התאים. כאן, זה 315 mOsmol / L. להגדיל או להקטין את ריכוז סוכרוז לפי הצורך כדי להתאים את osmolarity של חיץ הדמיה ומדיום צמיחה.
    2. כוונן את ה-pH ל-7.4. הפוך aliquots ולשמור אותם ב 4 °C (70 °F) עד שבועיים. לאחסון לטווח ארוך, שמור על עליקוטים ב -20 °C (70 °F). אפשרו למאגר ההדמיה להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
רכיבפתרון מלאי (ז)ריכוז סופי (mM)עוצמת קול (מ"ל)
NaCl51142.3
KCl35.290.176
MgCl2 1.910.053
CaCl2 120.2
גליצין0.10.0050.005
סוכרוז1.5523.5
נתרן פירובט0.10.50.5
HEPES1101
גלוקוז2.550.2

טבלה 2: הרכב מאגר הדמיה. אמצעי האחסון שצוינו משמשים להכנת 100 מ"ל של מאגר הדמיה.

  1. פתרונות לגירוי וכיול
    הערה: תמיד להכין פתרונות גירוי טרי על ידי הוספת פתרונות מלאי של תרופות שצוינו למאגר ההדמיה ממש לפני הניסוי. פתרונות לגירוי וכיול יותוספו לתא ההדמיה ברצף במהלך ניסוי (ראו סעיפים 3-5). בהתאם לסוג הניסוי, פתרונות שונים נדרשים כדי להגיע לאותו ריכוז קצה בנפח הסופי המתאים בתא ההדמיה.
    1. הכן פתרון 3x NMDA (90 מיקרומטר; ריכוז סופי בתא: 30 מיקרומטר) על ידי הוספת 63 μL של מלאי NMDA 10 מ"מ ל 6.937 מ"ל של מאגר הדמיה. הוסף 500 μL של הפתרון המתקבל לתא (נפח סופי: 1.5 מ"ל).
    2. הכן פתרון DA 2x לשלבים 3 ו- 4 (1 מ"מ; ריכוז סופי בתא: 0.5 מ"מ) על-ידי הוספת 14 μL של מלאי DA של 0.5 M ל- 6.986 מ"ל של מאגר הדמיה. הוסף 1 מ"ל לתא (נפח סופי: 2 מ"ל).
    3. הכן פתרון DA 4x לשלב 5 (2 מ"מ; ריכוז סופי בתא: 0.5 מ"מ) על-ידי הוספת 28 μL של מלאי DA של 0.5 M ל- 6.972 מ"ל של מאגר הדמיה. הוסף 500 μL לתא (נפח סופי: 2 מ"ל).
    4. הכן פתרון DTT 1x (5 מ"מ; ריכוז סופי בתא: 5 מ"מ) על ידי הוספת 45 μL של 1 M DTT מלאי 8955 μL של מאגר הדמיה. הוסף 1 מ"ל של פתרון זה לתא לאחר שאיפת מאגר ההדמיה (נפח סופי: 1 מ"ל).

2. טעינת תאים עם TMRE

הערה: בפרוטוקול זה, TMRE משמש במצב שאינו מרווה15 בריכוז סופי של 20 ננומטר. באופן כללי, הריכוז הנמוך ביותר האפשרי של TMRE שעדיין מספק עוצמת אות מספקת על המיקרוסקופ של בחירה יש להשתמש. בשל אידוי לא אחיד, נפח המדיום בבארות שונות יכול להיות שונה בתרבויות ראשוניות ארוכות טווח. כדי להבטיח ריכוז TMRE עקבי בכל בארות, אין להוסיף TMRE ישירות לבארות. במקום זאת, החלף את המדיום בכל באר באותה כמות של מדיום המכיל TMRE. הפרוטוקול שלהלן מיועד נוירונים ראשוניים 24-well לוחות המכילים ~ 1 מ"ל של בינוני לבאר.

  1. עבודה במכסה המנוע זרימה למינאר תרבות רקמה, לאסוף 500 μL של בינוני מכל באר לתוך צינור חרוט אחד.
  2. לבאר, להוסיף 0.5 μL של 20 μM TMRE מלאי לתוך הצינור חרוט (למשל, 12 μL עבור 24 בארות).
  3. שאפו בזהירות את המדיום הנותר מהבאר הראשונה והחליפו אותו ב-500 מיקרו-אל של מדיום המכיל TMRE. המשך, היטב, עם בארות הנותרות.
    הערה: יש להקפיד לא לתת לתאים להתייבש ולא להפריע לתאים.
  4. להחזיר את התאים לאינקובטור ולחכות לפחות 60 דקות עבור שיווי משקל צבע.
    הערה: ניתן להאריך את זמן הטעינה למספר שעות ללא תופעות לוואי.
  5. כדי להבטיח ריכוזי TMRE עקביים ושיווי משקל לאורך ניסוי ההדמיה, הקפד לכלול ריכוז סופי של 20 nM TMRE במאגר ההדמיה וכל פתרונות הגירוי.

3. אופטימיזציה של הגדרות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה

הערה: שלב זה נועד למצוא את הפשרה הטובה ביותר בין איכות התמונה לבין הכדאיות של התא במהלך הדמיה חיה. סעיף זה מתאר את המיטוב של הגדרות עבור הדמיית roGFP. אם מתבצעת הדמיה רב-פרמטרית, יש לבצע אופטימיזציה דומה, כולל בדיקת קו בסיס יציב ללא סימנים להלבנה או פוטוטוקסיה, עבור האינדיקטורים הנוספים.

  1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ואת הגדרות תקן הטעינה עבור הדמיית GFP (עירור של 488 ננומטר, פליטה של 505 - 550 ננומטר).
  2. הגדר את הגלאי ל- 12 סיביות או 16 סיביות.
    הערה: בדרך כלל, 8 סיביות אינן מספיקות להדמיה כמותית.
  3. הפעל את מצב הסריקה הרציף והוסף רצף /רצועה שניים (עירור של 405 ננומטר, פליטה של 505 - 550 ננומטר).
  4. עבור שני הערוצים, בחר טבלת בדיקת מידע מדומה המציינת פיקסלים חשופים יתר על המידה ומתחת (לדוגמה, GLOW OU).
  5. בחר מטרה המתאימה למושא העניין.
    הערה: 10x-40x מתאימים לניתוח תא יחיד, 63x-100x מתאימים לניתוח מיטוכונדריון יחיד.
  6. הר כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה, להוסיף 1 מ"ל של מאגר הדמיה, ולהניח את התא על המיקרוסקופ.
  7. השתמש בעין ובאור המועבר כדי למקד את התאים.
    הערה: אין להשתמש באור אפיפלואורסצנטיות כדי לאתר ולמקד תאים. אפילו בהספק נמוך, זה ישפיע לרעה על התאים.
  8. הקלט תמונות בתבניות פיקסל שונות. בהתבסס על תמונות אלה, בחר את מספר הפיקסל הנמוך ביותר המעניק רזולוציה מקובלת של מבנה העניין.
    הערה: בדרך כלל, 512 x 512 פיקסלים פועלים היטב עבור הדמיה של תא בודד עם מטרות של פי 20 ו- 40x, ו- 1024 x 1024 או 2048 x2048 פיקסלים בדרך כלל פועלים היטב עבור הדמיית מיטוכונדריון יחיד עם מטרה של 63x.
  9. הקלט תמונות בגדלים שונים של חורי סיכה. בהתבסס על תמונות אלה, בחר את גודל חור הסיכה הגדול ביותר המעניק רזולוציה מקובלת של מבנה העניין.
    הערה: בדרך כלל, 3-7 יחידות אווריין לעבוד טוב.
  10. הקלט תמונות בעוצמות לייזר שונות.
    1. התאם את הרווח והסף של הגלאי בהתאם. בהתבסס על תמונות אלה, בחר את עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר המעניקה עוצמת אות מקובלת ויחס אות לרקע.
      1. כדי לקבוע את יחס האות לרקע, מדוד את עוצמת האות באזור עניין (ROI) המכיל תאים או מיטוכונדריה (ROI1) וב-ROI ללא תאים או מיטוכונדריה (ROI2). לאחר מכן, לחלק את עוצמת ROI1 על ידי עוצמת ROI2.
        הערה: כוון ליחס אות לרקע של >3 ועוצמות אותות של ROIs בודדים של 200-1,000 עבור עירור של 405 ננומטר עם כוח לייזר של 1-3% ועוצמות של ROIs בודדים של 300-1,500 עבור עירור של 488 ננומטר עם כוח לייזר של 1%.
  11. הקלט תמונות עם מהירויות סריקה שונות ומספר ממוצעי מסגרות. הקלט 4-5 תמונות עבור כל שילוב של הגדרות. בהתבסס על סדרות תמונות אלה, בחרו במהירות הגבוהה ביותר ובהגדרות הממוצעות הנמוכות ביותר המעניקות רעש תמונה מקובל ושונות תמונה לתמונה.
    הערה: מהירות סריקה של 600 מסגרות הרץ ו- 1-2 לממוצע פועלת היטב ברוב המקרים.
  12. באמצעות כיסוי חדש, הקלט סידרה של זמן לשגות עם ההגדרות הממוטבות.
    הערה: משך הזמן ומרווח התמונה של הסדרה צריכים להידמות לאלה של הניסויים המתוכננים.
  13. בסוף סדרת הזמן-לשגות, הוסף 1 מ"ל של פתרון DA 2x לתא ההקלטה. תמונה למשך 2 דקות נוספות.
  14. שאפו את מאגר ההדמיה באמצעות משאבה פרייסטלית או פיפטה כף יד. הוסף 1 מ"ל של פתרון DTT 1x. תמונה למשך 5 דקות נוספות.
  15. נתח את ניסוי זמן-לשגות (ראה סעיף 5).
    1. ודא שאף אחד משני הערוצים לא נחשף יתר על המידה או לא נחשף במהלך טיפול DA ו- DTT עם ההגדרות הממוטבות.
    2. ודא שאף אחד משני הערוצים לא מראה להלבנה ניכרת במהלך ההקלטה בזמן ההפסקה; שואפים לאובדן אינטנסיביות של <2% בין התמונות הראשונות והאחרונות.
    3. ודא שיחס 405:488 אינו משתנה במידה ניכרת במהלך ההדמיה.
  16. חזור על ההליך כולו באופן איטרטיבי, תוך שימוש במספר כיסויים, עד שהוגדרו הגדרות המספקות תוצאות מקובלות באופן עקבי.

4. הערכת מצב ההוקסם מחדש של הבזל

  1. הפעל את המיקרוסקופ וטען את ההגדרות הממוטבות מסעיף 3.
  2. הגדר את ממוצע המסגרת ל - 3-5.
  3. הר כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה, להוסיף 1 מ"ל של מאגר הדמיה, ולהניח את התא על המיקרוסקופ.
  4. השתמש בעין ובאור המועבר כדי למקד את התאים.
    הערה: אין להשתמש באור אפיפלואורסצנטיות כדי לאתר ולמקד תאים. אפילו בהספק נמוך, זה ישפיע לרעה על התאים.
  5. עבור למצב סריקה והשתמש בערוץ 488 ננומטר בתצוגה חיה כדי להתמקד ולאתר תאים להדמיה.
  6. השתמש בפונקציה multipoint כדי לבחור 3-5 שדות תצוגה בכיסוי.
  7. הקלט תמונת בסיס.
  8. הוסף 1 מ"ל של פתרון DA 2x לחדר.
  9. לאחר 1, 2 ו- 3 דקות, השתמש בתצוגה חיה כדי לאשר/להתאים את המוקד ולאחר מכן להקליט תמונה.
    הערה: התאים בדרך כלל מחומצנים לחלוטין לאחר 2 דקות.
  10. החלף את המאגר בתא ההדמיה בפתרון DTT 1 מ"ל אחד.
  11. לאחר 3 ו- 5 דקות, השתמש בתצוגה חיה כדי לאשר/להתאים את המוקד ולאחר מכן להקליט תמונה.
    הערה: התאים בדרך כלל מופחתים באופן מלא לאחר 4-5 דקות.

5. הדמיה חיה של טיפולים חריפים

הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר הדמיה של תגובת redox המיטוכונדריאלי לטיפול NMDA. ייתכן שיהיה צורך להתאים מרווחי תמונה ומשך הניסוי לטיפולים אחרים.

  1. הפעל את המיקרוסקופ וטען את ההגדרות הממוטבות מסעיף 3.
  2. הגדר את מרווח הזמן ל- 30 שניות ומשך הזמן ל- 25 דקות.
  3. הר כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה, להוסיף 1 מ"ל של מאגר הדמיה, ולהניח את התא על המיקרוסקופ.
    הערה: כדי למנוע סחיפה מיקוד תרמית, להשאיר את התאים על שלב המיקרוסקופ במשך 10-15 דקות לפני תחילת הדמיה זמן לשגות.
  4. השתמש בעין ובאור המועבר כדי למקד את התאים.
    הערה: אין להשתמש באור אפיפלואורסצנטיות כדי לאתר ולמקד תאים. אפילו בהספק נמוך, זה ישפיע לרעה על התאים.
  5. עבור למצב הסריקה והשתמש בערוץ 488 ננומטר בתצוגה חיה כדי להתמקד ולאתר תאים להדמיה.
  6. אופציונלי: כדי להגדיל את מספר התאים המוקלטים בכל ריצה, השתמש בפונקציה multipoint כדי לדמיין 2-3 שדות תצוגה לכל כיסוי.
  7. התחל את רכישת הזמן-לשגות והקלט 5 תמונות כהקלטה בסיסית של 2 דקות.
  8. הוסף 500 μL של פתרון 3x NMDA לתא (ריכוז סופי 30 מיקרומטר) ולרשום 20 תמונות נוספות כתגובת NMDA של 10 דקות.
    הערה: נוירונים רגישים מאוד לשינויים באוסמולריות. לכן, הקפד למזער את האידוי של מאגר ההדמיה. לטיפולים ארוכים יותר, תא ההדמיה צריך להיות מכוסה במכסה.
  9. הוסף 500 μL של פתרון DA 4x לתא והקלט 6 תמונות נוספות (כיול מרבי של 3 דקות).
  10. שאף את המאגר מתא ההדמיה והחלף אותו ב- 1 מ"ל של פתרון DTT 1x. הקלט 10 תמונות נוספות (כיול מינימלי של 5 דקות).
  11. סיים את ההקלטה ושמור את סידרת התמונות.

6. ניתוח נתונים

  1. ייבוא נתונים וקדם עיבוד תמונה ב- FIJI
    1. השתמש ביבואן Bio-Formats כדי לפתוח קבוצת תמונות מהשלב 4 או מקובץ תמונה מהשלב 5. לחץ על תוספים | ביו-פורמטים | יבואן ביו-פורמטים. בתיבת הדו-שיח , השתמש בערימה הצג עם: ערכת יתר, הגדר מצב צבע: ברירת מחדל, בחר שינוי קנה מידה אוטומטי ואל תתפצל לחלונות נפרדים.
      הערה: שינוי קנה מידה אוטומטי ממטב את תצוגת הנתונים על מסך המחשב. זה לא משנה את עוצמות הפיקסלים.
    2. אם נפתחו תמונות בודדות מהשלב 4, לחץ על תמונה | ערימות | כלים | יש למזג אותם לערימה של תמונה אחת.
    3. אם יש XY-להיסחף במהלך סדרת התמונות, לחץ על תוספים | StackReg כדי לרשום את התמונות. בתיבת הדו-שיח , בחר גוף קשיח או תרגום.
    4. שנה את תבנית התמונה ל- 32 סיביות על-ידי לחיצה על תמונה | הקלד | 32 סיביות.
    5. פצל את ערוצי הצבע לחלונות נפרדים על-ידי לחיצה על תמונה | | צבע ערוצים מפוצלים.
    6. בחר ערוץ 1 (405 ננומטר) והתאם את הסף לבחירת המיטוכונדריה לניתוח על-ידי לחיצה על תמונה | כוונון | סף. בתיבת הדו-שיח , בחרו 'ברירת מחדל', 'אדום', 'רקע כהה' ו'הערימה היסטוגרמה' והמתינו עד שהפיקסלים שנבחרו ייראו אדומים. לחץ על החל. בחרו 'הגדר פיקסלי רקע' ל-NaN ועבדו את כל התמונות.
      הערה: כדי להימנע מהטיית משקיפים פוטנציאלית, יש להשתמש בה קביעת סף אוטומטית. FIJI מציעה מספר שיטות אוטומטיות (כגון ברירת מחדל, הואנג, Intermodes, Otsu) שניתן לבחור מתפריט נפתח בתיבת הדו-שיח סף. בדרך כלל, שיטת ברירת המחדל מעניקה תוצאה טובה. מומלץ להשוות מספר שיטות במהלך הניתוח הראשון כדי למצוא את שיטת הסף הטובה ביותר עבור ערכת התמונות הנתונה. לאחר בחירת שיטה, יש להחיל אותה על כל התמונות.
    7. חזור על שלב 6.1.6 עבור ערוץ 2 (488 ננומטר).
    8. צור תמונת יחס כדי להציג באופן חזותי את יחס 405:488 ננומטר על-ידי לחיצה על תהליך | מחשבון תמונה. בתיבת הדו-שיח , בחר תמונה 1: ערוץ 1, פעולה: הפרדה, תמונה 2: ערוץ 2, צור חלון חדש, עבד את כל התמונות.
    9. שנה את טבלת בדיקת המידע של תמונת היחס ל - פסאודוקולור. לדוגמה, כדי לעבור לאש, לחץ על תמונה | | טבלאות בדיקת מידע אש.
  2. ניתוח תמונה
    1. בתמונת היחס, צייר ROIs סביב תאים בודדים או מיטוכונדריה. לאחר ציור כל ROI, הוסף אותו למנהל ההבחות. ניתוח | כלים | מנהל | של | הוסף. (קיצור מקשים: 'T') בחר הצג הכל.
      הערה: מכיוון שהפקסלים ברקע הוגדרו כ'לא מספר' (NaN) בשלבים 6.1.6 ו- 6.1.7, הם לא ישפיעו על תוצאת המדידה. לכן, מקובל לכלול כמה פיקסלי רקע ב- ROI.
    2. מדוד את היחסים של 405:488 של תאים בודדים על-ידי לחיצה על מנהל ההשערה | ctrl+A כדי לבחור את כל ההשערות | עוד | ריבוי מידה. בתיבת הדו-שיח , בחרו 'מדוד את כל הפרוסות' ואת 'שורה אחת' לפרוסה.
    3. יצא את המידות לתוכנת גיליון אלקטרוני.
    4. בחר את התמונה של 405 ננומטר. מדוד את האינטנסיביות של כל ההנסים עלה על המידה כמו בשלב 6.2.2. באמצעות ROIs המאוחסנים במנהל ההחזר על מכירות.
    5. יצא את המידות לתוכנת גיליון אלקטרוני.
    6. בחר את התמונה של 488 ננומטר. מדוד עוצמות של כל ההנסרות כמו בשלב 6.2.2. באמצעות ROIs המאוחסנים במנהל ההחזר על מכירות.
    7. יצא את המידות לתוכנת גיליון אלקטרוני.
    8. שמור ROIs לעיון עתידי על-ידי לחיצה על מנהל ההפרשה על | ctrl+A כדי לבחור את כל ההבהלה | עוד | שמור.
    9. מומלץ: צור עוצמה לעומת חלקות זמן של עקבות 405 ו- 488 ננומטר. ודא כי אין להלבנה מסומנת באף אחד מהערוצים (עוצמת האות בסוף סדרת ההדמיה צריכה להיות ≥98% מהתמונה הראשונה) וכי שני העקבות עוברים לכיוונים מנוגדים במהלך תגובות החיישנים (למשל, מעקב 405 ננומטר צריך לגדול במהלך חמצון בעוד מעקב 488 ננומטר צריך לרדת).
  3. נרמול נתונים
    1. עבור כל ההחזר על השקעה מתמונת היחס, קבע את הערך המרבי במהלך טיפול DA (Rmax) ואת הערך המינימלי במהלך טיפול DTT (Rmin).
    2. חשב את היחס המנורמל באופן הבא:
      figure-protocol-18314
      הערה: פעולה זו תגדיר את היחס המרבי ל- 1.0 ואת היחס המינימלי ל- 0.
  4. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית
    1. כדי להשיג מדידות של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במקביל לעוצמות roGFP בשלב 6.2.6, עבור אל ניתוח | קבע מדידות ובדוק את מתארי הצורה והתאים אליפסה.
      הערה: בנוסף לעוצמה ממוצעת, המדידות בחלון התוצאות יכללו את אורך הציר הראשי (מייג'ור), אורך הציר המשני (מינור), יחס הגובה-רוחב (AR; ציר ראשי חלקי ציר משני; למיטוכונדריה עגולה יש AR ~ 1, למיטוכונדריה מוארכת יש AR גדול יותר), כמו גם מדידות של מעגליות (Circ.) ועגולות (עגול).

תוצאות

כימות הבדלים במצב מיטוכונדריאלי יציב לאחר נסיגת גורם גדילה
כדי להדגים את הכימות של הבדלים במצב יציב במצב redox מיטוכונדריאלי, נוירונים ראשוניים גדלו במדיום סטנדרטי הושוו נוירונים בתרבית ללא גורמי גדילה עבור 48 שעות לפני הדמיה. נסיגה גורם גדילה תוצאות מוות תאי עצביים אפופטוטי לאח?...

Discussion

מדידות כמותיות ודינמיות של מצב ההוקסיד המיטוכונדריאלי מספקות מידע חשוב על פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית ופיזיולוגיה תאית. מספר בדיקות כימיות פלואורוגניות זמינות המזהות מינים של חמצן תגובתי, "לחץ אדום", או "עקה חמצונית". עם זאת, המונחים האחרונים אינם מוגדרים היטב ולעתים קרובות חסרים ספציפיות9...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה פורשונגסגמיינסכאפט (BA 3679/5-1; עבור 2289: BA 3679/4-2). A.K. נתמך על ידי מלגת ERASMUS + . אנו מודים לאיריס בנזלי-ארט, ריטה רוזנר ואנדראה שליקסופ על הכנת תאי העצב העיקריים. אנו מודים לד"ר טוביאס דיק על שסיפק pLPCX-מיטו-Grx1-roGFP2. ניסויים שהוצגו באיור 4 בוצעו במרכז הדמיה ניקון, אוניברסיטת היידלברג. איור 2 הוכן עם BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306
Diamide (DA)Sigma-AldrichD3648
Dithiothreitol (DTT)Carl Roth GmbH6908.1
Glucose (2.5 M stock solution)Sigma-AldrichG8769
GlucoseSigma-AldrichG7528
GlycineneoFroxx GmbHLC-4522.2
HEPES (1 M stock solution)Sigma-Aldrich15630-080
HEPESSigma-AldrichH4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O)Sigma-Aldrich442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA)Sigma-AldrichM3262
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Sodium chloride (NaCl)neoFroxx GmbHLC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)Sigma-AldrichS8636
Sodium pyruvateSigma-AldrichP8574
SucroseCarl Roth GmbH4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)Sigma-Aldrich87917
equipment
imaging chamberLife Imaging Services (Basel, Switzerland)10920Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscopeLeicaDMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unitLeicaSP8
peristaltic pumpVWRPP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, cameraHamamatsuC9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystemTokaiHitINU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscopeNikonTi microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unitYokagawaCSU-X1
software
FIJIhttps://fiji.sc
StackReg pluginhttps://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg pluginhttps://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

References

  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
  5. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
  6. Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
  7. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  8. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  9. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
  10. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
  11. Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
  12. Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
  13. Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
  14. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
  17. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  18. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  19. Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
  20. Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
  21. Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
  22. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
  23. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
  24. Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
  25. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
  26. Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176Grx1 roGFP2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved