שבר רוחבי של עצם הירך של העכבר עם פין מייצב

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לביצוע שברים בעכברים בוגרים ולמעקב אחר תהליך הריפוי.

Abstract

תיקון שבר הוא פונקציה חיונית של השלד שלא ניתן לדגום באופן מהימן במבחנה. מודל פציעה של עכבר הוא גישה יעילה לבחון אם גן, מוצר גן או תרופה משפיעים על תיקון העצם מכיוון שעצמות מורין משחזרות את השלבים שנצפו במהלך ריפוי שברים אנושיים. כאשר עכבר או אדם שוברים עצם, מתחילה תגובה דלקתית, והפריוסטאום, גומחת תאי גזע המקיפה את העצם עצמה, מופעל ומתרחב. תאים השוכנים בפריוסטאום מתמיינים לאחר מכן ויוצרים יבלת רכה וסקולרית. המעבר מהקלוס הרך לקאלוס קשה מתרחש כאשר תאי האב המגויסים מתמיינים לתאי מינרליזציה, והגישור בין הקצוות השבורים גורם לאיחוד העצמות. לאחר מכן, ה-callus המינרלי עובר שיפוץ כדי לשחזר את הצורה והמבנה המקוריים של העצם שנרפאה. ריפוי שברים נחקר בעכברים באמצעות מודלים שונים של פציעה. ובכל זאת, הדרך הטובה ביותר לשחזר את כל התהליך הביולוגי הזה היא לפרוץ את החתך של עצם ארוכה המקיפה את שני הקורטיזים. פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לבצע בבטחה שבר עצם הירך רוחבי מיוצב כדי להעריך ריפוי בעכברים בוגרים. פרוטוקול כירורגי הכולל טכניקות קציר והדמיה מפורטות לאפיון השלבים השונים של ריפוי השברים מסופק גם כן.

Introduction

שברים, שברים בהמשכיות פני העצם, מתרחשים בכל חלקי האוכלוסייה. הם הופכים חמורים אצל אנשים שיש להם עצמות שבריריות עקב הזדקנות או מחלה, ועלויות הטיפול הרפואי של שבריריות שבריריות צפויות לעלות על 25 מיליארד דולר תוך 5 שנים 1,2,3,4,5. הבנת המנגנונים הביולוגיים המעורבים בתיקון שברים תהיה נקודת מוצא בפיתוח טיפולים חדשים שמטרתם לשפר את תהליך הריפוי. מחקרים קודמים הראו כי עם השבר מתרחשים ארבעה שלבים משמעותיים המאפשרים לעצם להחלים: (1) היווצרות ההמטומה; (2) היווצרות של יבלת פיברוקרטילגינית; (3) מינרליזציה של היבלת הרכה ליצירת עצם; ו-(4) שיפוץ העצם שנרפאה ^6,7. תהליכים ביולוגיים רבים מופעלים כדי לרפא את השבר בהצלחה. ראשית, תגובה פרו-דלקתית חריפה מופעלת מיד לאחר שבר ^6,7. לאחר מכן, הפריוסטאום הופך להיות מופעל ומתרחב, ותאים פריוסטאליים מתמיינים לכונדרוציטים ויוצרים יבלת סחוס שגדלה כדי למלא את הפער שהותירו מקטעי העצם המופרעים 6,7,8,9. תאים עצביים וסקולריים פולשים ל-callus החדש שנוצר כדי לספק תאים נוספים ומולקולות איתות הדרושות כדי להקל על תיקון 6,7,8,9,10. בנוסף לתרומה להיווצרות קאלוס, תאים פריוסטאליים מתמיינים גם לאוסטיאובלסטים שמניחים עצם ארוגה ביבלת המגשרת. לבסוף, אוסטאוקלסטים משפצים את העצם החדשה שנוצרה כדי לחזור לצורתה המקורית ולמבנה הלמלר 7,8,9,10,11. קבוצות רבות פיתחו מודלים של עכברים לתיקון שברים. אחד ממודלי השבר המוקדמים והנפוצים ביותר בעכברים הוא גישת איינהורן, שבה משקל נשמט על הרגל מגובה מסוים¹². חוסר השליטה על הזווית והכוח המופעל כדי לגרום לשבר יוצר שונות רבה במיקום ובגודל של אי-הרציפות של העצם. לאחר מכן, הוא גורם לשינויים בתגובת ריפוי השברים הספציפית שנצפתה. גישות פופולריות אחרות הן התערבות כירורגית ליצירת פגם מונוקורטי או שברי מאמץ טיביאליים, הליכים הגורמים לתגובות ריפוי מתונות יחסית ^10,13. השונות במודלים אלה נובעת בעיקר מהאדם המבצע את ההליך¹⁴.

כאן, מודל פגיעה מפורט בעצם הירך של העכבר מאפשר שליטה על השבר כדי לספק פגיעה הניתנת לשחזור ולאפשר הערכה כמותית ואיכותית של תיקון שבר עצם הירך. באופן ספציפי, פריצת דרך מלאה בעצם הירך של עכברים בוגרים מוצגת ומייצבת את קצוות השבר כדי להסביר את התפקיד שהעומס הפיזי ממלא בריפוי העצם. השיטות לקצירת רקמות והדמיה של השלבים השונים של תהליך הריפוי באמצעות היסטולוגיה וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (microCT) מסופקות גם בפירוט.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באזור הרפואי של הרווארד. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J בני 12 שבועות (זכרים ונקבות). עכברים זכרים ונקבות C57BL/6J משיגים מסת עצם שיא בסביבות גיל 12 שבועות עם עצם הירך רחבה מספיק כדי להתאים לסיכת מייצבת, מה שהופך אותם לזן מתאים לשימוש בפרוטוקול זה¹⁵.

1. הכנה לניתוח

1. יש לערוך אוטוקלאציה של הציוד הכירורגי, כולל מספריים כירורגיים, מלקחיים ישרים, מלקחיים מעוקלים, מהדקים כירורגיים וגלגל חיתוך יהלומים (ראו טבלת חומרים) כדי למזער את הסיכון לזיהום.
2. הניחו כלוב עכבר נקי על משטח חימום כדי להקל על ההחלמה לאחר הניתוח. הגדר את משטח החום כך שיגיע לטמפרטורה בין 37-45 °C (76 °F).
3. מניחים את העכבר תחת הרדמה באמצעות תא איזופלורן. הגדר את זרימת חמצן האינדוקציה על 2 ליטר לדקה, את אינדוקציית האיזופלורן על 2-4%, את חמצן חרוט האף בתחזוקה על 2 ליטר לדקה, ואת איזופלורן התחזוקה הוא 1.4%.
4. אשרו כי נשימתו של העכבר יציבה והם אינם מגיבים לצביטת בוהן. יש למרוח שכבה דקה של משחה אופטלמית על כל עין כדי למנוע גירוד בקרנית. מעבירים את העכבר למשטח סטרילי ושומרים על הרדמה באמצעות חרוט אף כדי להעביר איזופלורן באופן רציף באותו קצב כמו בשלב 1.3.
   הערה: מומלץ להשתמש בעכברים בני 12 שבועות ומעלה מכיוון שעצם הירך מעכברים צעירים יותר עשויה להיות דקה מדי מכדי להכיל סיכה מייצבת.
5. הזריקו לעכבר באופן תת-עורי משקל גוף של 0.05 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין בשחרור איטי (ראו טבלת חומרים).
6. באמצעות גוזם חשמלי, גילחו ריבוע בגודל 2X2 ס"מ על שתי הירכיים המתאים למיקום עצם הירך.
7. יש לחטא את האזור המגולח באמצעות גזה סטרילית או מטושים כדי להפיץ שכבה של יוד ולאחר מכן שטיפה עם 70% אתנול (איור 1A).

2. ניתוח

1. באמצעות אזמל סטרילי, יש לבצע חתך של 5 מ"מ באזור המגולח והמחוטא ולקלף את העור כדי לחשוף את החיתולית שמתחת.
2. השתמש במלקחיים ישרים ומספריים עדינים כדי לתפוס ולחתוך בעדינות את החיתולית המכסה ישירות את עצם הירך כדי לחשוף את השריר. חתך של 5 מ"מ של החיתולית מספיק כדי לגשת לשריר הבסיסי.
3. באמצעות זוג אחד של מלקחיים ישרים, מפרידים בעדינות את השריר מעצם הירך עם נזק מינימלי לרקמות.
4. ברגע שעצם הירך נראית לעין, החליקו את המלקחיים המעוקלים מתחת לעצם הירך בין השריר המופרד לעצם. תנו למלקחיים להיפתח לאט כדי לשמור על הפרדת שרירים ולאבטח את עצם הירך כדי להקל על חתך נקי.
   הערה: עצם הירך חייבת להישאר חשופה ומופרדת מהשריר והעור כאשר המלקחיים אינם מוחזקים, כפי שמוצג באיור 1B.
5. בצע חתך רוחבי באמצע פיר עצם הירך באמצעות מסור כף יד בהגדרת ההספק הנמוך (ראה טבלת חומרים עבור הלהב וערכת הכלים הסיבובית המשמשת).
   הערה: לאחר כריתת עצם הירך לחלוטין, נוצרים שני קצוות שבר: החלק הפרוקסימלי (המחובר לעצם הירך) והחלק הדיסטלי (המחובר לברך, הידוע גם בשם מפרק המחניק). הימנעו מחיתוך עצם הירך בתנועה אחת ויחידה. במקום זאת, בצע 3-5 מעברים עד שעצם הירך נחתכת לחלוטין. זה קריטי כדי למנוע התחממות יתר של הרקמה הסובבת ויצירת פסולת עצם משמעותית, המשפיעה לרעה על הריפוי.
6. הכנס מחט מנחה (23 G x 1 TW IM, 0.6 מ"מ x 25 מ"מ) (ראה טבלת חומרים) בחלל המוח של החלק הדיסטלי. השתמשו באצבעות כדי לסובב בעדינות את המחט בזמן שאתם דוחפים להשחיל דרך מפרק הברך (איור 1C).
   1. הסר את מחט ההנחיה מהקצה הדיסטלי וחזור על הקצה הפרוקסימלי, תוך שימוש באותה תנועת פיתול עדינה כדי לדחוף את מחט ההנחיה דרך מפרק הירך. השאירו את המחט המנחה בקצה הפרוקסימלי, כשקצהו מגיח מתוך העור (איור 1D).
      הערה: כדי לייצב את קצוות השבר, מחט מכוונת שימשה תחילה ליצירת מסלול דרך קצות השבר, ולאחר מכן הושחלה סיכת ייצוב דרך מסלול זה כדי לאבטח את קצות השבר¹⁴.
7. הכנס את הפין המייצב (מחט, 27 גרם x 1 1/4, 0.4 מ"מ x 30 מ"מ) (ראו טבלת חומרים) לקצה מחט ההנחיה (איור 1E). דוחפים בעדינות כך שהסיכה המייצבת נכנסת כאשר המחט המנחה יוצאת מחלל המוח של הקצה הפרוקסימלי.
   1. השליכו את מחט המדריך. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק וליישר את הקצה הדיסטלי עם הקצה הפרוקסימלי ולהמשיך להשחיל את הסיכה המייצבת דרך חלל המוח הדיסטלי עד שהיא יוצאת ממפרק הברך באמצעות המסלול שנעשה ב-2.6 (איור 1F).
      הערה: סיכת הייצוב צריכה להיות בולטת כעת ממפרקי הירך והברך.
8. באמצעות המהדק הכירורגי, משכו את קצה הסיכה כדי לקרב את החלקים הפרוקסימליים והדיסטליים זה לזה, כך שהם בקושי נוגעים זה בזה. יישרו מחדש את קצוות השבר עם מלקחיים במידת הצורך, וקפלו את קצות הפין המייצב לכיוון אתר השבר באמצעות המהדק הכירורגי (ראו טבלת חומרים).
   1. הסר את הפלסטיק מבסיס המחט באמצעות חותכי חוטים. באמצעות המהדק, סובבו את שני קצוות הסיכה עד שהם קהים כדי למנוע נזק פנימי לרקמות.
      הערה: קצות השבר נעולים כעת במקומם, כך שהעכבר יכול לשים משקל על הרגל הפצועה. הסיכה מאובטחת אם קצות השבר אינם מסוגלים להיפרד. חותך חוט יכול לשמש גם כדי להקהות את הקצוות. הסיכה המייצבת חייבת להישאר במקומה במשך כל תקופת המחקר עד להמתת העכבר. ניסיונות לעקור את הסיכה עלולים לערער את תגובת השבר ולגרום נזק לבעל החיים. ניתן להסיר את הסיכה בעת הנתיחה.
9. השתמש במלקחיים ישרים כדי למקם מחדש את השריר על עצם הירך. באמצעות מלקחיים מעוקלים, צובטים את קצות העור זה לזה וסוגרים את הפתח באמצעות קליפסים לפצע.
   הערה: אין לסגור את העור בצורה הדוקה מדי עם הקליפסים או שהעכבר ימנע מהטלת משקל על רגל זו. הגבלת ההעמסה הפיזית במהלך ההחלמה עלולה לעכב את תהליך הריפוי.
10. חזרו על שלבים 2.2 עד 2.4 ברגל השנייה וסגרו את הפצע מבלי לבצע את שבר עצם הירך.
    הערה: עצם הירך המופעלת על ידי בושה זו משמשת כבקרה קונטרלטרלית.
11. משכו את החשיפה לאיזופלורן, הניחו את העכבר בכלוב המחומם וודאו שהוא חוזר להכרה תוך 10-15 דקות.
12. עקוב אחר פעילות העכבר ואתר החתך מדי יום במשך 5 ימים לאחר הניתוח לסימני מצוקה או זיהום.
    הערה: אם בעל החיים מפגין סימני כאב, אינו אוכל ו/או מהסס ללכת על אחוריו, יש להתייעץ עם הצוותים הווטרינריים ולתת משכך כאבים נוסף.
13. הסר את קליפס הפצע 10 ימים לאחר הניתוח.
    הערה: אם נראה שהפצע לא נסגר לאחר 10 ימים, יש להתייעץ עם הווטרינר ו-IACUC לפני הסרת הקליפסים.

3. קצירת רקמות

1. המתת חסד את העכברים באמצעות שאיפת CO₂ ולאחר מכן פריקה של צוואר הרחם.
   הערה: הליך זה עולה בקנה אחד עם הפאנל על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית.
2. באמצעות מספריים ומלקחיים, הסר את העור משתי רגלי העכבר, נקע את ראש הירך מעצם הירך וחתך את השריר הסמוך כדי לשחרר את הרגל.
   הערה: הימנע מהסרת שריר רב מדי סביב עצם הירך מכיוון שהקלוס עלול להיות מנותק או פגום.
3. הימנעות מהסיכה המייצבת, חותכים דרך מפרק הברך כדי להפריד את עצם הירך מהטיביה.
4. נתחו את החלקים הדיסטליים והפרוקסימליים של עצם הירך כדי לחשוף את קצות הסיכה המייצבת.
5. בעזרת חותך חוט קשיח, חתכו את הקצוות הקהים המקופלים של הסיכה כך שיישאר רק החלק הישר של הסיכה. השתמש במלקחיים כדי להחליק לאט ובעדינות את הסיכה המייצבת מתוך עצם הירך.
   הערה: אם הסיכה אינה מחליקה בקלות החוצה, אל תפעיל כוח מכיוון שהדבר עלול לנתק את ה- callus ולפגוע במדגם. במקום זאת, נסו לסובב את הסיכה ולהסיר אותה בעדינות. הסרת הסיכה עשויה להיות קלה יותר גם לאחר הקיבוע.

4. היסטולוגיה - כחול אלקיאני / Eosin / כתום G צביעה

הערה: צביעת G/Eosin כחולה/כתומה אלקיאנית משמשת באופן שגרתי להדמיית סחוס (כחול) והעצם (ורודה). ניתן לכמת את שטח הסחוס כשיעור משטח ה-callus הכולל (איור 2A,B).

1. תקן את עצם הירך בפורמלין נייטרלי ב-10% נייטרלי ב-4 מעלות צלזיוס.
2. לשטוף את הדגימות הקבועות במלח בעל מאגר פוספט (PBS).
3. מניחים דגימות ב-0.5M EDTA, pH 8.0 על שייקר שמסתובב באיטיות במשך שבועיים. שנה את פתרון EDTA כל יומיים כדי להבטיח דקאלציפיקציה יעילה.
   הערה: אין צורך בסל"ד ספציפי עבור השייקר; ודא שהנוזל זורם במיכל כדי לכסות את כל הדגימות. ניתן לבדוק את ההפחתה המלאה על ידי צילום רנטגן של עצם הירך.
4. כדי לעבד את הדגימות עבור הטמעת פרפין הדגירה אותם בתמיסות הבאות (1 שעה כל אחת): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, קסילן, קסילן, פרפין, פרפין.
5. הטבע את הדוגמאות בפרפין לצורך חתך.
6. חותכים מקטעי אורך בעובי 5-7 מיקרומטר של עצם הירך השבורה באמצעות מיקרוטום.
7. Deparaffinize את החלקים על ידי דגירה אותם ב 2 אמבטיות של קסילן (5 דקות כל אחד).
8. לייבש את החלקים על ידי דגירה בשיפוע האתנול הבא (2 דקות כל אחד): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
9. מניחים מגלשות במי ברז למשך דקה אחת.
10. הפוך את הפתרונות של כחול אלקיאני, אלכוהול חומצי, מי אמוניום ו- Eosin / Orange G להיסטולוגיה כפי שצוין בקובץ משלים 1.
    הערה: הנפחים המוצעים של כל פתרון צריכים להספיק כדי להטביע לחלוטין את השקופיות לצורך הכתם.
11. מניחים שקופיות באלכוהול אסיד במשך 30 שניות ודגירה בכחול אלקי למשך 40 דקות.
12. יש לשטוף בעדינות מתחת לברז הרץ עד שהמים צלולים למשך כ-2 דקות.
13. טבלו את המגלשות במהירות באלכוהול חומצי במשך 1 שניות.
14. יש לשטוף כמתואר בשלב 4.9.
15. דגירה במי אמוניום במשך 15 שניות.
16. יש לשטוף כמתואר בשלב 4.9.
17. ממקמים ב-95% EtOH למשך דקה אחת ודגירה ב-Eosin/Orange G למשך 90 שניות.
18. מייבשים את השקופיות במהירות עם ירידה אחת ב-70% EtOH, 80% EtOH ו-100% EtOH.
19. מקם את השקופיות בקסילן למשך דקה אחת כדי לנקות את השקופיות.
20. החל מדיית הרכבה וכיסוי להדמיה.
    הערה: לצורך אנליזה מולקולרית, ניתן לבודד RNA וחלבון מהקלוס. נתחו בזהירות את השריר תחת היקף ניתוח והפרידו את היבלת מהעצם הבסיסית באמצעות אזמל.

5. מיקרו-CT

הערה: בשלבים מאוחרים יותר של הריפוי, ניתן לבצע microCT כדי לדמות ולכמת את המינרליזציה ביבלת הקשה ואת פער השבר. בעכברי C57BL/6J, ה-callus בדרך כלל עובר מינרליזציה וניתן לזיהוי על-ידי microCT לאחר 10 ימים לאחר השבר (dpf) (איור 2C).

1. תקן את עצם הירך בפורמלין נייטרלי ב-10% נייטרלי ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה : ניתן לבצע MicroCT על אותם עצם הירך המשמשים להיסטולוגיה כל עוד זה נעשה לפני דקלקיפיקציה של EDTA (שלב 4.3). בעת שימוש באותן עצם הירך עבור שתי הטכניקות, בצע microCT, לאחזר את הדגימות ולעבור לשלב 4.3.
2. שטפו את הדגימות הקבועות במי מלח עם מאגר פוספט (PBS) ואחסנו ב-70% EtOH.
3. בצע microCT עם גודל ווקסל איזוטרופי של 7 מיקרומטר ברמת אנרגיה של 55 kVP ועוצמה של 145 μA (ראה טבלת חומרים).
4. מתארים את פרוסות ה-microCT כך שיכללו את ה-callus ולא יכללו את עצם קליפת המוח.
   הערה: ככל שה-callus נעשה יותר מינרליזציה עם הזמן, ניתן להתאים את הסף כדי להמחיש ולמדוד את נפח ה-callus בשלבים שונים.
5. קבל את נפח העצם הכלול בקווי המתאר של ה- callus כמדידה של נפח ה- callus.
   הערה: ניתן למדוד את פער השבר ישירות על פרוסות ה- microCT כמרחק שתופסת ההפסקה.

תוצאות

בעכברי C57BL/6J, ניתוח מוצלח משלים את שלבי הריפוי שהוזכרו קודם לכן, ללא כמעט תגובה דלקתית מקומית או מעורבות פריוסטאלית בעצם הירך הקונטרה-צדדית המופעלת על ידי בושה. המטומה נוצרת כמה שעות לאחר הניתוח, והפריוסטאום מופעל כדי לגייס אבות שלד לכונדרוגנזה. ניתן לעקוב אחר אוכלוסיות תאים שונות, כגון Prx1<...

Discussion

מודל הפציעה המפורט בפרוטוקול זה מקיף את כל ארבעת השלבים המשמעותיים שנצפו במהלך ריפוי שברים ספונטניים, כולל (1) תגובה פרו-דלקתית עם היווצרות ההמטומה, (2) גיוס אבות השלד מהפריוסטאום ליצירת הקלוס הרך, (3) מינרליזציה של הקלוס על ידי אוסטאובלסטים ו-(4) שיפוץ העצם על ידי אוסטאוקלסטים.

...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle	BD precision	305193	Use as guide needle
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm)	BD precision	305136	Use as stabilizing pin
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit	Braintree Scientific, INC	ACS-KIT
Alcian Blue 8 GX	Electron Microscopy Sciences	10350
Ammonium hydroxide	Millipore Sigma	AX1303
Circular blade X926.7 THIN-FLEX	Abrasive technologies	CELBTFSG633
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit	Dremel	7700 1/15
Eosin Y	ThermoScientific	7111
Fine curved dissecting forceps	VWR	82027-406
Hematoxulin Gill 2	Sigma-Aldrich	GHS216
Hydrochloric acid	Millipore Sigma	HX0603-4
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Microsurgical kit	VWR	95042-540
Orange G	Sigma-Aldrich	1625
Phloxine B	Sigma-Aldrich	P4030
Povidone-Iodine Swabs	PDI	S23125
SCANCO Medical µCT35	Scanco
Slow-release buprenorphine	Zoopharm