יצירת קסנוגראפט אורתוטופי של תאים סרטניים בלבלב על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד

Summary

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל סרטן לבלב אורתוטופי זעיר פולשני על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד של תאי סרטן הלבלב האנושיים וניטור לאחר מכן של צמיחת הגידול in vivo על ידי הדמיית אולטרסאונד.

Abstract

סרטן הלבלב (PCa) מייצג את אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר בעולם. הסיבות לממאירות PCa מסתמכות בעיקר על התנהגותה הממאירה הפנימית ועמידותה הגבוהה לטיפולים טיפוליים. ואכן, למרות מאמצים רבים, הן כימותרפיה סטנדרטית והן טיפולי מטרה חדשניים נכשלו באופן משמעותי כאשר הועברו מהערכה פרה-קלינית למסגרת הקלינית. בתרחיש זה, פיתוח מודלים של עכברים פרה-קליניים המחקים טוב יותר את מאפייני ה- in vivo של PCa נחוץ בדחיפות כדי לבדוק תרופות שפותחו לאחרונה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ליצירת מודל עכברי של PCa, המיוצג על ידי קסנוגרפט אורתוטופי המתקבל על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד של תאי גידול בלבלב אנושי. באמצעות פרוטוקול כה אמין וזעיר פולשני, אנו מספקים גם עדויות לחריטה in vivo והתפתחות של מסות גידול, אשר ניתן לנטר על ידי הדמיית אולטרסאונד (US). היבט ראוי לציון של מודל PCa המתואר כאן הוא התפתחות איטית של המוני הגידול לאורך זמן, המאפשר זיהוי מדויק של נקודת המוצא לטיפולים תרופתיים וניטור טוב יותר של ההשפעות של התערבויות טיפוליות. יתר על כן, הטכניקה המתוארת כאן היא דוגמה ליישום עקרונות 3Rs שכן היא ממזערת כאב וסבל ומשפרת באופן ישיר את רווחתם של בעלי חיים במחקר.

Introduction

PCa, וצורתו הנפוצה ביותר, קרצינומה אדנו דוקטלית לבלב (PDAC), היא אחת הסיבות הנפוצות ביותר למוות הקשור לסרטן עם שיעור הישרדות של שנה אחת נמוך מ -20% ושיעור הישרדות של 5 שנים של 8%, ללא קשר לשלב ^1,2. המחלה כמעט תמיד קטלנית, ושכיחותה צפויה לגדול ברציפות בשנים הקרובות, בניגוד לסוגי סרטן אחרים, ששכיחותם יורדת³. גורמים כגון גילוי מאוחר של סרטן, הנטייה להתקדמות מהירה והיעדר טיפולים ספציפיים מובילים לפרוגנוזה גרועה של^{PCa 4}. התקדמות רבה בחקר הסרטן הושגה, הודות לפיתוח מודלים מדויקים יותר של עכברים פרה-קליניים. המודלים סיפקו תובנות מתאימות להבנת המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הסרטן ולפיתוח טיפולים חדשים⁵. התקדמות זו חלה בצורה גרועה על PCa, אשר, למרות מאמצים רבים לאחרונה, נשאר עמיד לטיפולים כימותרפיים הנוכחי¹. מסיבות אלה, פיתוח גישות חדשניות לשיפור סיכויי המטופלים הוא חובה.

במהלך השנים פותחו דגמים רבים של עכברי PCa, כולל xenografts, שהם הדגמים הנפוצים ביותר כיום⁵. מודלים של Xenograft מסווגים כהטרוטופיים תת עוריים ואורתוטופיים, בהתאם למיקום תאי הגידול המושתלים. קסנוגראפטים הטרוטופיים תת-עוריים קלים וזולים יותר להשגה, אך מפספסים תכונות אופייניות מסוימות של PCa (כלומר, המיקרו-סביבה המוזרה של הגידול, המאופיינת בהצטברות של רקמה פיברוטית, היפוקסיה, חומציות ואנגיוגנזה)^6,7. זה מסביר מדוע קסנוגרפטים תת-עוריים לעתים קרובות אינם מצליחים לספק נתונים חזקים לטיפולים טיפוליים המובילים לכישלונות כאשר הם מתורגמים לסביבה הקלינית⁸. מאידך גיסא, קסנוגרפטים אורתוטופיים דומים יותר למיקרו-סביבה של הגידול, מה שמוביל לחיקוי טוב יותר של ההתפתחות הטבעית של המחלה. בנוסף, קסנוגרפטים אורתוטופיים מתאימים יותר לחקר התהליך הגרורתי והתכונות הפולשניות של PCa, שכמעט אינן מתרחשות במודלים תת עוריים⁹. באופן כללי, מודלים של עכברי xenograft אורתוטופיים עדיפים כיום לבצע בדיקות פרה-קליניות של תרופות ^9,10. קסנוגרפטים אורתוטופיים מסתמכים בדרך כלל על הליכים כירורגיים כדי להשתיל תאים או חתיכות רקמת גידול קטנות מאוד בלבלב. ואכן, כמה מאמרים המבוססים על מודלים כירורגיים של PCa פורסמו בעשורים האחרונים¹¹. עם זאת, האיכות והתוצאה של ההליך הכירורגי להקמת מודל גידול אורתוטופי תלויים מאוד במיומנות הטכנית של המפעיל. נקודת מפתח נוספת עבור אורתוטופית מוצלחת PCa xenograft עבור גישה קלינית תרגומית היא האפשרות להקים מחלה מקומית עם קינטיקה צמיחה צפויה.

כדי להתמודד עם בעיות אלה, כאן אנו מתארים הליך חדשני לייצור PCa xenograft אורתוטופי, תוך ניצול הזרקה מונחית אולטרסאונד (US) של תאי PCa אנושיים לזנב הלבלב בעכברים מדוכאי חיסון. הליך זה יוצר מודל עכבר PCa אמין. הגידול מלווה ב-in vivo על ידי הדמיית US.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי קיבל אישור ממשרד הבריאות האיטלקי עם אישור מספר 843/2020-PR. על מנת להבטיח תנאים אספטיים, בעלי החיים הוחזקו בתוך חדר המחסום של חיות המחקר vivarium (Ce.S.A.L.) של אוניברסיטת פירנצה. כל ההליכים בוצעו באותו חלל שבו שוכנו העכברים במתקן LIGeMA של אוניברסיטת פירנצה (איטליה).

1. הכנת תאים

1. תרבית תאי PCa מקו תאי ה-PCa בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה את מדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו, בתוספת 2% L-גלוטמין ו-10% סרום בקר עוברי (FBS).
2. דגירה של התאים בנורמוקסיה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
3. לנתק את התאים עם טריפסין. לספור, ולהשהות 1 x 10^{6 תאים} ב 20 μL של PBS, 1 שעה לפני החיסון.

2. הכנת עכבר להזרקה מונחית אולטרסאונד (US-GI)

הערה: השלבים הבאים בוצעו בתנאים סטריליים. כל ההליך של הזרקה מונחית ארה"ב, מתחילת ההרדמה ועד להסרת העכבר מפלטפורמת החיה, לוקח בערך 10-12 דקות ועוד 5 דקות להתאוששות מלאה של העכבר.

1. רגע לפני ההתערבות, יש לתת קרפרופן (NSAID) באופן תת עורי (s.c.) במינון סופי של 5 מ"ג/ק"ג או טרמדול במינון סופי של 5 מ"ג/ק"ג באמצעות מזרק שחפת עם מחט של 27 גרם.
   הערה: עבור הפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש ב-20 נקבות Athymic Nude-Foxn^1nu . העכברים היו בני 8 שבועות ושקלו 20-22 גרם.
2. הפעל את התמונה ובחר עכבר (קטן) בטן בתפריט היישום מלוח המתמרים. ודא שחלון ההדמיה B-Mode (מצב בהירות) מופיע, ושהמערכת מוכנה לרכוש נתוני B-Mode.
   הערה: B-Mode הוא מצב ההדמיה המוגדר כברירת מחדל של המערכת. המערכת מציגה הדים בתצוגה דו-ממדית (2D) על-ידי הקצאת רמת בהירות המבוססת על משרעת אות ההד. B-Mode הוא המצב היעיל ביותר לאיתור מבנים אנטומיים.
   1. עבור אל דפדפן הלימוד.
   2. בחר מחקר חדש והקלד את שם המחקר והמידע, כלומר, תאריך המחקר וכו '.
   3. מלא את כל המידע הדרוש בשם הסדרה, כלומר, זן בעלי חיים, תעודת זהות, תאריך לידה וכו '.
   4. הקישו על ' סיום'; התוכנית מוכנה להדמיה במצב B.
3. הרדמת העכבר בתא אינדוקציה של הרדמה באמצעות 4% איזופלורן עם זרימת גז של 2 ליטר/דקה של O₂.
   הערה: כ-4 דקות מספיקות להרדמה תקינה (נשימה סביב 50-60 נשימות לדקה).
4. לאחר הרדמת העכבר, שנה את החיבור של מכונת ההרדמה כדי לכוון את האיזופלורן לכיוון שולחן הטיפול בעכבר.
5. הניחו את העכבר המרדים על האגף הימני שלו על שולחן הטיפול (מחומם ב-37 מעלות צלזיוס) עם חוטמו בתוך חרוט באף, כדי להבטיח שהעכבר מורדם באמצעות 2% איזופלוראן עם זרימת גז של 0.8 ליטר/דקה של O₂ (איור 1A).
6. יש למרוח טיפת דמעות מלאכותיות על עיני העכבר כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
7. הדביקו בחוזקה את יד ימין, רגל ימין וזנב על כריות האלקטרודות על משטח החיה באמצעות גזה דביקה.
   הערה: קצב הנשימה והאלקטרוקרדיוגרמה (ECG) של העכבר נרשמים דרך רפידות האלקטרודות.

3. הזרקת תאי PANC1 ללבלב בשיטת US-GI

1. לטהר את עור העכבר עם 70% אתנול ולשמור על העור של האגף השמאלי מתוח באמצעות גזה דבק.
   הערה: שמירה על עור מתוח חשובה להפחתת ההתנגדות להחדרת המחט ולמניעת עיוותי מחט.
2. החל ג'ל אולטרסאונד על הבטן והאגף השמאלי של העכבר באמצעות מזרק 20 מ"ל (ללא המחט).
3. באמצעות ידית בקרת הגובה של מתמר ארה"ב, הנמיכו את המתמר כדי לגעת באגף השמאלי של העכבר והניחו אותו באופן רוחבי לגוף החיה.
4. הזיזו את המתמר כדי לדמיין את הלבלב על צג המתמר באמצעות הדמיה במצב B (איור 1B).
5. הכינו מזרק המילטון 50 μL, המכיל 1 x 10 6^תאי PANC1 המרחפים ב-20 μL של PBS, עם מחט 30 מ"מ 28 G והניחו את המזרק על המחזיק המתאים (איור 1C).
   הערה: לפני השימוש, יש לחטא את מחט המזרק ב-70% אתנול לתקופה של 5-10 דקות.
6. באמצעות המיקרומניפולטור המחזיק, הורידו את המזרק לעור העכבר, כאשר שיקוע המחט פונה כלפי מעלה ובאותו מישור של מתמר האולטרסאונד, ויצרו זווית של 45° עם המתמר (איור 1D).
   הערה: משלב זה ואילך, המשך על ידי ניטור התמונה האמריקאית בתצוגה.
7. באמצעות המיקרומניפולטור, נקב את העור והכנס את מחט המזרק ללבלב והתבונן בתמונת ארה"ב בתצוגה, כדי לעקוב אחר מסלולה (איור 1E).
   הערה: לפני ההזרקה, קח את הזנב של הלבלב כהפניה אשר ממוקם מאחורי הטחול קרוב לכליה השמאלית.
8. לאחר החדרת המחט ללבלב, הזריקו בולוס של 20 μL המכיל את התאים ישירות ללבלב על ידי הפעלת לחץ קבוע על בוכנת המזרק (איור 1F).
   הערה: הליך ההזרקה הנכון נבדק על ידי נוכחות של בועה קטנה בלבלב וזרימת נוזל היפואקוגני, אשר בקושי נראה מקצה המחט.
9. השאירו את המחט במקומה למשך 5-10 שניות לאחר הזרקת כל הבולוס, ואז נסוגו ממנה באיטיות.
10. הסר את מתמר ארה"ב, נקה את הג'ל מהאגף והנח את העכבר לבדו בכלוב חדש. התבונן בבעל החיים עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה סטרנלית.

4.3D הדמיית US לניטור גידולי לבלב בעכברים

הערה: הערכת התפתחות הגידול בוצעה החל מ-8 ימים לאחר הזרקת התא, תוך שימוש באותו מכשיר המשמש להזרקה מונחית ארה"ב (מופיע בטבלת החומרים). לפיכך, חלק מההליכים, כגון הצתת המערכת (שלב 2.2.), הרדמה (שלבים 2.3. - 2.6.), ומיקום העכבר על פלטפורמת בעלי החיים (שלב 2.7.), תואמים באופן מלא את מה שתואר לעיל בפרוטוקול.

1. לפני תחילת ההדמיה בארה"ב, הגדר את תחנת העבודה כפי שמוצג באיור 2A.
2. תקן את המתמר במערכת המנוע התלת-ממדית (איור 2A).
3. הפעל את התמונה ובחר מחקר חדש בדפדפן המחקר.
4. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה של הרדמה (4% איזופלוראן).
5. הניחו את העכבר המרדים על האגף הימני שלו על שולחן הטיפול המחומם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חוטמו בצינור ההרדמה והפחיתו את האיזופלוראן ל-2% (איור 2B).
   הערה: חשוב שהעכבר ימוקם באותה תנוחה כמו ההזרקה בהנחיית ארה"ב, כדי לשמור על אותן הפניות אנטומיות.
6. יש למרוח טיפה משחה וטרינרית על עיני העכבר.
7. החל שכבה של ג'ל אולטרסאונד על הבטן של העכבר ואת האגף השמאלי.
8. מקם את מתמר ה-55 מגה-הרץ בכיוון הרוחבי כדי לגעת בעור האגף השמאלי כך שהלבלב יהיה ממורכז בקירוב (איור 2C).
9. השתמש במנוע התלת-ממדי כדי לרכוש תמונות של הלבלב כולו בכיוון הרוחבי, באופן אידיאלי לאסוף 90-100 פריימים לרכישה (מספר המסגרות עשוי להשתנות בהתאם לבחירה האישית).
   1. בחר את מיקום המנוע התלת-ממדי בלוח המגע של התמונה .
   2. ציין את מרחק הסריקה על ידי הזזת הסמן כדי לקבל תמונות של הלבלב כולו משני הגפיים.
   3. בחר סרוק מסגרות והתחל ברכישה תלת-ממדית.
10. לאחר סיום ההדמיה התלת-ממדית, הסר את המתמר, נקה את הג'ל מהעור והנח את העכבר לבדו בכלוב חדש להתאוששות. התבונן בבעל החיים עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה סטרנלית.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, עכברים הורדמו תחילה בתא איזופלורן, והונחו על משטח החיה (איור 1A). הלבלב הודגם באמצעות דימות אולטרסאונד (איור 1B). מזרק המילטון 50 μL הועמס ב-1 x 10⁶ תאי PANC1 שהיו תלויים ב-20 μL של PBS והונחו על מחזיק המחט (איור 1C). הזווית ...

Discussion

למרות שהשימוש בהדמיית US נפוץ במרפאה, התפתחות גידולים במודלים פרה-קליניים רבים של עכברים מתוארת בדרך כלל באמצעות הדמיה ביולומינסנטית¹¹. זו האחרונה היא דרך עקיפה להעריך את השתלת הגידול והרחבתו והיא גם אינה מספקת קינטיקה אמינה לגידול גידול. במחקר הנוכחי יישמנו הדמיית US לביצוע ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157