שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

Summary

בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת מודדת את קצב צריכת החמצן ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, המתאים לייצור אדנוזין טריפוספט מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, באמצעות חיישני pH וחמצן. כתב היד מסביר שיטה להבנת מצב האנרגיה של אוסטאובלסטים ואפיון ופרשנות של המצב הביו-אנרגטי התאי.

Abstract

היווצרות עצם על ידי אוסטאובלסטים היא תהליך חיוני לרכישת עצם נכונה ותחלופת עצם כדי לשמור על הומאוסטזיס שלד, ובסופו של דבר, למנוע שבר. מתוך אינטרס הן לייעל את מסת העצם והן להילחם במחלות שלד-שריר שונות (כלומר, אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר, אנורקסיה נרבוזה, סוכרת מסוג 1 ו-2), נעשו מאמצים מדהימים בתחום הביולוגיה של העצם לאפיין באופן מלא את האוסטאובלסטים לאורך תהליך ההתמיינות שלהם. בהתחשב בתפקידם העיקרי של אוסטאובלסטים בוגרים להפריש חלבוני מטריצה ושלפוחיות מינרליזציה, צוין כי תהליכים אלה לוקחים כמות מדהימה של אנרגיה תאית, או אדנוזין טריפוספט (ATP). מצב האנרגיה התאית הכולל מכונה לעתים קרובות ביו-אנרגיה תאית, והוא כולל סדרה של תגובות מטבוליות שחשות את זמינות המצע כדי להפיק ATP כדי לענות על הצרכים התאיים. לכן, השיטה הנוכחית מפרטת את התהליך של בידוד תאים סטרומליים ראשוניים, מח עצם מורין (BMSCs) וניטור מצבם הביו-אנרגטי באמצעות מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת בשלבים שונים בהתמיינות אוסטאובלסט. חשוב לציין, נתונים אלה הראו כי הפרופיל המטבולי משתנה באופן דרמטי במהלך התמיינות אוסטאובלסט. לפיכך, שימוש בסוג תא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית זה נדרש כדי להעריך באופן מלא כיצד המצב הביו-אנרגטי של התא יכול לווסת את התפקוד הכולל.

Introduction

היווצרות העצם על ידי האוסטאובלסט מלווה בהרס מתואם או ספיגה מחדש של עצמות על ידי אוסטאוקלסטים. האיזון בין היווצרות עצם אוסטאובלסטית לבין ספיגת אוסטאוקלסט הוא תהליך מצומד המתאר תחלופת עצם או שיפוץ, החיוני להומאוסטזיס של השלד. תפקוד לקוי של אוסטאובלסט מוביל לפגיעה ביצירת העצם וגורם למחלות שונות, כולל אוסטאופורוזיס ^1,2,3. התמיינות Ex vivo/in vitro של תאי גזע סטרומליים של מח עצם (BMSCs) למבשרי אוסטאובלסטים ואוסטאובלסטים בוגרים גורמת להיווצרות ותצהיר של מטריצת העצם המינרלית בכלי התרבית לאורך זמן ^4,5,6. היווצרות עצם זו על ידי האוסטאובלסט דורשת כמות משמעותית של אנרגיה תאית. באופן ספציפי, הוכח כי סינתזה והפרשת קולגן מסתמכות במידה רבה על ATP תאי: יחסי ADP, וככל הנראה, סחר בשלפוחית מינרלית והפרשתם דורשים תוספת ATP ^7,8,9,10,11. חוקרים רבים הראו כי התהליך של אוסטאובלסטוגנזה ותפקוד אוסטאובלסט דורש אספקה מספקת של אנרגיה כדי לענות על הדרישה המטבולית של היווצרות עצם 12,13,14,15,16. לכן, המטרה של שיטה זו היא לאפיין את המצב הביו-אנרגטי של תאים סטרומליים ראשוניים, מורין, לאורך התמיינות אוסטאובלסט באמצעות מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת. טכניקות אלה מסייעות בפיתוח הבנה טובה יותר של הומאוסטזיס שלד, אשר עשוי להוביל בסופו של דבר לפיתוח של אפשרויות טיפוליות חדשניות המסוגלות לשפר את הפרעות השלד.

ניתן להשתמש במנתח השטף המטבולי של התאים בזמן אמת כדי למדוד את קצב צריכת החמצן (OCR) ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) של אוסטאובלסטים חיים, המתאימים לייצור ATP מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, בהתאמה. היסוד למתודולוגיה זו הוא העובדה כי יון H⁺ אחד לכל לקטט משתחרר במהלך הגליקוליזה בהמרה של גלוקוז לקטט, מה שמשנה את ה- pH המדיה המשתקף בערכי ECAR. לעומת זאת, במהלך מחזור TCA (חומצה טריקרבוקסילית), זרחון חמצוני באמצעות המיטוכונדריה מייצר CO₂ על ידי שימוש או צריכת חמצן, ולכן ניטור OCR משקף את התהליך המטבולי הזה. המנתח מודד הן את ה-OCR והן את ה-ECAR במיקרו-סביבה החוץ-תאית בו-זמנית ובזמן אמת, מה שמאפשר פוטנציאל עצום בחקר ביו-אנרגיה תאית ^6,17. בנוסף, ביצוע בדיקות אלה הוא פשוט יחסית וניתן להתאמה אישית בקלות בהתאם למטרת הניסוי. טכניקות דומות הופעלו כדי להבין עוד יותר את הוויסות המטבולי של תאי T של מערכת החיסון^18,19, התחלת סרטן והתקדמות²⁰, יחד עם סוגי תאים רבים אחרים התורמים לתסמונות מטבוליות^21,22.

היתרונות של מנתח שטף מטבולי בזמן אמת על פני טכניקות חלופיות כוללים (1) את היכולת למדוד ביו-אנרגיה תאית של תאים חיים בזמן אמת, (2) יכולת לבצע בדיקה עם מספר קטן יחסית של תאים (דורשת עד 5,000 תאים), (3) יציאות הזרקה כדי לתמרן במקביל טיפולים מרובים במערכת בעלת תפוקה גבוהה של 96 קידוחים, (4) שימוש בדימוי תאים אוטומטיים נטולי תוויות רדיואקטיביות לנורמליזציה^{18, 23,24}. השיטות הבאות נועדו לספק תיאור כללי אך מפורט של ניטור ביו-אנרגיה תאית ב-Murine BMSCs לאורך התמיינות אוסטאובלסט באמצעות המנתח. הוא יכלול בדיקות המבוצעות באופן שגרתי; עם זאת, כמו בטכניקות ושיטות רבות, מומלץ מאוד שמעבדות בודדות יקבעו פרטים ספציפיים לניסויים שלהן.

מבחר של בדיקות וסוגים שונים של בדיקות זמינות: מגוון רחב של ערכות בדיקה וריאגנטים זמינים כדי לחקור את הביו-אנרגיה של התאים תוך הבטחת האמינות והעקביות של תוצאות הניסוי. בנוסף, תוכנת שולחן העבודה מציעה גם תבניות בדיקה שניתן להתאים אישית בקלות. ניתן להגדיר את הבדיקה על סמך צרכי המשתמש למדוד פרמטרים מטבוליים שונים. ניתן לשנות מבחנים אלה בדרכים שונות על סמך המטרה הניסויית ו/או השאלה המדעית. לדוגמה, עם ארבע יציאות הזרקה, ניתן להזריק מספר תרכובות למדיית הבדיקה כדי לנתח את התגובה התאית הספציפית לכל מסלול מטבולי.

בדיקת פנוטיפ של אנרגיית התא: בדיקה זו מודדת את הפנוטיפ המטבולי של התאים החיים ואת הפוטנציאל המטבולי שלהם. בדיקה זו מומלצת גם כצעד ראשון לקבלת מושג כללי על חילוף חומרים ספציפי למסלול. תערובת של אוליגומיצין A-מעכב של ATP סינתאז וקרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי) פניל-הידרזון (FCCP)-סוכן מיטוכונדריאלי ללא שיתוף פעולה מוזרק כדי להבין את פוטנציאל האנרגיה של התא. הזרקת אוליגומיצין A מעכבת את הסינתזה של ATP, וכתוצאה מכך עלייה בקצב הגליקוליזה (ECAR) כדי לאפשר לתאים לעמוד בדרישות האנרגיה שלהם; מצד שני, הזרקה של FCCP גורמת ל- OCR גבוה יותר עקב דה פולריזציה של הממברנה המיטוכונדרית. בעיקרו של דבר, מבחן זה מתאר נשימה מטבולית בסיסית, ובעקבות הזריקות הכפולות, דוחף או מדגיש, את התגובה המטבולית. בהתבסס על פרמטרים אלה, התוכנה מתווה OCR ו- ECAR של התאים על ידי סיווג התאים כמצב אירובי, שקט, גליקוליטי או אנרגטי לאורך זמן^25,26.

בדיקת קצב ייצור בזמן אמת של ATP: זה מודד את ייצור ה-ATP התאי בו-זמנית מגליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית. בדיקה זו מודדת באופן כמותי את השינויים המטבוליים משני מסלולי האנרגיה ומספקת נתונים על קצב הייצור של ATP המיטוכונדריה והגליקוליטי לאורך זמן. הבדיקה מקבלת נתוני OCR ו-ECAR בסיסיים ולאחר מכן חישוב קצב הייצור של ATP מיטוכונדריאלי באמצעות הזרקת אוליגומיצין A וקצב ייצור ATP גליקוליטי באמצעות הזרקת תערובת רוטנון + אנטימיצין A (עיכוב כולל של תפקוד המיטוכונדריה), וכתוצאה מכך החמצה מיטוכונדריאלית^17,27.

מבחן מאמץ למיטוכונדריה של תאים (או מבחן מאמץ מיטו תאי): זה מודד את תפקוד המיטוכונדריה באמצעות נשימה הקשורה ל-ATP, מכמת ביו-אנרגיה תאית, מזהה תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ומודד את תגובת התאים ללחץ. פרמטרים שונים, כולל יכולת נשימה בסיסית ורזרבית, נשימה הקשורה ל-ATP, נשימה מקסימלית וצריכת חמצן לא מיטוכונדריאלית, ניתן לקבל בבדיקה אחת. בדיקה זו כוללת זריקות עוקבות של אוליגומיצין A, FCCP (חומר מיטוכונדריאלי לא מיתוכונדריה), תערובת של מעכבי רוטנון/אנטימיצין A כדי לנתח ביעילות את ההשפעה של אלה על תפקוד המיטוכונדריה²⁸.

גמישות מיטו דלק flex מבחן: זה מודד את קצב הנשימה המיטוכונדרית על ידי חמצון של שלושת הדלקים המיטוכונדריים העיקריים על ידי נוכחות והיעדר המעכבים שלהם. העיכוב הרציף של גלוקוז, גלוטמין וחומצות שומן מסייע במדידת התלות, הקיבולת והגמישות של התאים והתלות של התאים במסלולים תאיים שונים כדי לענות על הביקוש לאנרגיה. כאשר המיטוכונדריה אינה יכולה לעמוד בדרישות של מסלול העניין החסום על ידי חמצון דלקים אחרים, התאים נכנסים למצב תלות. יכולתם של התאים מחושבת על ידי עיכוב של שני המסלולים החלופיים האחרים ולאחר מכן עיכוב מסלול העניין. הגמישות של התאים מסייעת בהבנת היכולת של המיטוכונדריה לפצות ולענות על צורכי הדלק של המסלול המעוכב. הוא מחושב על ידי הפחתת התלות של תאים מקיבולת התאים. שלושה מעכבים שונים משמשים באופן עצמאי או כתערובת של שניים כדי לחשב ביעילות את הפרמטרים הבדיקה. 2-ציאנו-3-(1-פניל-1H-אינדול-3-yl)-2-חומצה פרופנואית (UK5099) מעכב את חמצון הגלוקוז על ידי חסימת נשא הפירובט בגליקוליזה. Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) אתיל סולפיד מעכב את מסלול החמצון של גלוטמין, ואטומוסיר מעכב את החמצון של חומצות שומן ארוכות שרשרת²⁹.

איור 1: ייצוג סכמטי של המתודולוגיה לגידול והכנת אוסטאובלסטים לניתוח. ה-BMSCs של מורין מבודדים מעצמות ארוכות, מתרבית ונזרעים בצלחות של 96 בארות בצפיפות של 25,000 תאים/בארות. התרבות תאים אלה במדיה הספציפית של אוסטאובלסט מתחילה כאשר הם מגיעים למפגש של 80%-100% כדי להתחיל את התמיינותם. הבדיקות מבוצעות בשלבים שונים של בידול. צלחות המחסניות מיובשות יום אחד לפני הבדיקה. ביום הבדיקה מוזרקים מעכבים שונים ליציאות של מחסניות החיישנים על סמך דרישות הבדיקה, ונוסף מאגר כיול ללוחית הכיול של 96 הבארות. לאחר הכיול, מתבצעת בדיקת השטף המטבולי של התא בזמן אמת, ולאחר מכן הדמיה של המיקרו-פלטה של תרבית התא באמצעות הדמיית המיקרו-פלטה כדי לנרמל את נתוני מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת עם ספירת תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

כל הנהלים התבססו על ההנחיות והאישור של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט.

1. הכנת ריאגנטים והתקנת בדיקה

1. בידוד וגידול של תאים סטרומליים של מח עצם (ראו גם את המאמר הקודם³⁰).
   1. הכינו מדיה מלאה של תרבית תאים חיונית אלפא מינימלית (αMEM) על ידי השלמת מדיה חיונית מינימלית עם שינוי אלפא עם 10% FBS (סרום בקר עוברי), 100 U/mL של פניצילין, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין.
   2. הכן את צינור איסוף מח העצם על ידי קיצוץ הקצה של צינור microcentrifuge 0.6 מ"ל כך שהתאים יוכלו לעבור דרכו והכנסתו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 100 μL של αMEM שלם.
   3. המתת חסד את העכברים באמצעות טיפול CO₂ כדלקמן. מניחים את החיה בתא ה-CO₂ למשך 2-3 דקות או עד להפסקת הנשימה. המתן לפחות דקה אחת לאחר שהחיה הופכת מחוסרת הכרה כדי להוציא את העכברים מהחדר ולנתק את צוואר הרחם.
   4. באמצעות מלקחיים סטריליים וזוג מספריים, חותכים את הבטן התחתונה של העכברים המתים כדי ליצור חתך קטן. בודדו את העצמות הארוכות (עצם הירך, השוקה והסמל האיליאק) של העכברים.
   5. קצצו את העצמות הארוכות כדי להסיר את כל הרקמות הרכות. לאחר ניקוי העצם, חותכים כ-1-2 מ"מ מהקצוות הדיסטליים והפרוקסימליים כדי ליצור פתח למח השטף.
      הערה: פתח זה צריך להיות שמרני כדי למנוע אובדן מח עצם תוך מתן אפשרות לו לשטוף החוצה.
   6. הניחו את העצמות בצינור איסוף המכיל 100 μL של 1x PBS סטרילי (מלוחים עם חציצת פוספט) כדי לבודד את מח העצם הכולל.
   7. שטפו את המח על ידי צנטריפוגה ב-10,000 x גרם במשך 15-20 שניות בטמפרטורת החדר. כדוריות תאי מח עצם בתחתית הצינור.
   8. חזור על צנטריפוגה עד שחלל העצם נראה לבן ונטול רוב יסודות המוח. החייאת האוכלוסייה המעורבת של מח העצם על ידי צניחה עדינה למעלה ולמטה.
   9. תרבית את התאים מבעל חיים אחד (הן עצם הירך והן השוקה) בבקבוקון תרבית תאים בגודל 75 ס"מ² ב-10 מ"ל של מדיה של תרביות תאים ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים עם 5% CO₂. אם אתם אוגרים תאים מ-2-3 בעלי חיים, השתמשו בבקבוקון תרבית תאים בגודל 150 ס"מ² (מומלץ).
   10. לאחר 24-48 שעות של דגירה של האוכלוסייה המעורבת, שאפו לאוכלוסיית התאים ההמטופוייטיים שאינם דבקים הכלולה במדיית התרבית ושטפו את התאים הדבקים עם 1x PBS.
2. זריעת תאים מ-BMSCs והתמיינות אוסטאובלסט
   1. טריפסיניזציה של התאים הדבקים על ידי הוספת מספיק 0.25% טריפסין- EDTA (כ-3-4 מ"ל) כדי לכסות מעט את משטח הבקבוקון, ולאחר מכן דגירה של 3 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
   2. הוסיפו 6-7 מ"ל של αMEM שלם לבקבוקון/טריפסין כדי להחיות את ה-BMSCs הדביקים על ידי צנרת קפדנית למעלה ולמטה. העברת מתלי BMSC לצינור צנטריפוגה חרוטית.
   3. הסר 50 μL aliquot של מתלה BMSC והוסף 50 μL של טריפאן כחול (1:1 דילול) אליו. ספירת המספר הכולל של תאים בני קיימא שאינם כוללים את הצבע על ידי צנרת 10 μL של תערובת זו על גבי המוציטומטר ותצפית בו מתחת למיקרוסקופ. אל תספור תאים מתים או לא בריאים שנראים בצבע כחול (<10% תאים).
   4. בהתבסס על ספירת התאים, חשב את נפח ההשעיה של התא ב-αMEM שלם הדרוש לריכוז סופי של 2.4 x 10⁶ תאים/מ"ל עבור נפח כולל של לפחות 10 מ"ל לכל צלחת.

איור 2: המיקרו-לוחית של תרבית התאים, שתוכננה במיוחד עבור המנתח. בארות אלה מכילות רק מדיית בדיקה ללא תאים. (B) הברקוד בצד הצלחת לסריקת הצלחת באמצעות קורא ההדמיה והמנתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. צנטריפוגה של התאים בצינור החרוטי ב-1,000 x g למשך 5 דקות והחזירו את התאים לריכוז הסופי הרצוי של 2.4 x 10⁶ תאים/מ"ל.
6. העבירו את תרחיף התא למאגר, ובאמצעות פיפטה רב-ערוצית, החיזרו בזהירות את התאים כדי להבטיח תערובת הומוגנית של תאים.
7. זרע 2.5 x 10⁴ תאים לכל באר במיקרו-פלטה של תרבית תאים של 96 בארות עם 80 μL של αMEM מלא. אין לזרוע תאים בבארות תיקון הרקע (A1, A12, H1, H12); במקום זאת, פשוט הוסף את המדיום בארבע הבארות האלה.
   הערה: BMSCs עבור הבדיקות מצופים במיקרו-פלטת תרבית תאים של 96 בארות המיועדת עבור המנתח בשילוב עם מחסניות החיישנים. שטח הפנים של לוחות אלה שונה מצלחת רגילה של 96 בארות. שטח הפנים של כל באר בצלחת הוא 0.106 ס"מ², שהם כ -40% משטח הלוח הטיפוסי של 96 בארות. צפיפות זריעת תאים אופטימלית נבחרת על סמך סוג התא. בדרך כלל, המנתח יכול לזהות בין 0.5-4 x 10⁴ תאים לכל באר. אוסטאובלסטים צריכים להיות במגע כדי להבדיל ביעילות; לשם כך, נבחר ציפוי בין 2.0 x 10 4-3.0 x 10⁴ BMSCs/ באר ב- 80 μL של αMEM שלם.
8. עצבו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח התפלגות שווה של תאים בבארות ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. בדוק את הצמיחה של התאים ואת מפגש התאים תחת המיקרוסקופ לאחר 48 שעות. שנה את המדיה של תרבית התאים במידת הצורך.
9. בהתאם למטרת הבדיקה, כאשר BMSCs הם 60%-80% מפגש (בדרך כלל 48-72 שעות), ליזום התמיינות אוסטאובלסטית על ידי שינוי המדיה של תרביות התאים למדיית התמיינות אוסטאובלסט (αMEM שלם בתוספת 5 mM β-גליצרול פוספט ו-50 מיקרוגרם/מ"ל של חומצה L-אסקורבית).
10. אם יש לנתח תאים סטרומליים לא מובחנים (יום 0), שמרו על תאים תחת αMEM מלא.
11. שנה את אמצעי התמיינות האוסטאובלסט כל יומיים ודמיין את התאים שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהם בריאים עד יום הבדיקה. רצוי, 24 שעות לפני הבדיקה המתוכננת, לשנות את המדיה ולשמור על לוח זמנים עקבי לשינוי בינוני (מומלץ).
    הערה: שנה בזהירות את המדיה על ידי הטיה קלה של הלוחות בזווית; זה מונע מגע מקרי של קצות פיפטה ללוחות תרבית התאים ושיבוש של החד-שכבתי של התאים.

2. הכנת מחסנית חיישן לכיול שטף חוץ-תאי

1. הקפידו על מחסניות החיישן מתוך ערכת הבדיקה החוץ-תאית לפני יום הבדיקה. הסר את מחסניות החיישן (לוחית ירוקה) והנח את החיישנים במהופך.
2. באמצעות צינור רב-ערוצי, הוסף 200 μL של H₂O לכל באר של לוח השירות. הניחו בזהירות את מחסניות החיישן בחזרה על לוחית השירות ודגרו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
   הערה: היצרן ממליץ לדגום את מחסניות החיישן באינקובטור שאינו CO₂ 37 °C למשך הלילה. עם זאת, אידוי משמעותי של מחסניות החיישנים יכול להתרחש. אם זה קורה, ניתן לדוגר מחסניות חיישנים בטמפרטורת החדר. לוחות אלה צריכים להיות דגירה למשך מינימום של 4 שעות ומקסימום של 72 שעות.
3. ביום הבדיקה, יש להשליך את H₂O מלוח השירות ולהוסיף 200 μL של קליברנט. דגירה של צלחת השירות למשך שעה אחת לפחות לפני הבדיקה.

3. הכנת מדיה של מנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת

1. השתמש במדיית DMEM ללא אדום פנול עם pH מותאם מראש של 7.4 (מומלץ) כדי להפעיל את הבדיקה עם BMSCs.
2. הכן 80 מ"ל של מדיה לבדיקה על ידי תוספת למדיית DMEM עם 1 mM נתרן פירובט, 2 mM גלוטמין, 10 mM גלוקוז, 10 mM גלוקוז, 200 ננומטר אינסולין, 50-200 μM חומצה אולאית BSA.
3. דגירה של מדיית הבדיקה המלאה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבטיית מים.

4. הכנת תרכובות למחסניות החיישן

1. הפשרת אוליגומיצין A, רוטנון ואנטימיצין A על קרח. פיפטה למעלה ולמטה כדי לבודד את התרכובות לפני השימוש.
2. הוסף 3 מ"ל של מדיום בדיקה מוכן לכל צינור, ואחריו תוספת של צינור התרכובת המתאימה A: 26.4 μL של 2.5 mM oligomycin A; צינור B: 3.1 μL של 12.67 mM רוטנון + 4.1 μL של 9.4 mM אנטימיצין A + 30 μL כתם Hoechst.
3. טען ריכוז של פי 10 של מעכבים אלה ביציאה המתאימה. הריכוז הסופי של תמיסות ההזרקה הדרושות הוא 2 μM של אוליגומיצין A, 1 μM של רוטנון, ו-4.1 μM של אנטימיצין A.
   הערה: Hoechst נוסף ליציאת ההזרקה הסופית לצורך צביעה פלואורסצנטית של הגרעינים למטרות הדמיה ונורמליזציה. ניתן לייעל ריכוזים אלה על סמך סוג התא.
4. טען 20 μL של תרכובות אלה לתוך התאים ב 180 μL של מדיה בדיקה.

5. הכינו מיקרו-פלטה של תרבית תאים לבדיקה

1. הסר את המיקרו-פלטה של תרבית התאים מהחממה של 37 °C והתבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ.
2. מוציאים את מדיום הבדיקה מאמבט המים.
3. יש לשטוף בעדינות את התאים עם 200 μL של מדיום בדיקה פעמיים ולהוסיף 200 μL של מדיית בדיקה לכל באר.
   הערה: לאחר הוספת מדיית הבדיקה הסופית לתאים, הזמן עד שהלוחות נכנסים למנתח הוא קריטי. לכן, אל תתחיל להחליף את המדיה עד לביצוע השלבים הבאים תוך שעה אחת.
4. בדקו את התאים שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נשארים דבוקים לבארות.
5. ודאו שהתאים ב-D5 וב-E8 נדבקים לחד-שכבתי עקבי ולא נשטפים במהלך שלב הכביסה. תוכנת הדמיה של תאים משתמשת בשתי בארות אלה להגדרת המיקוד האוטומטי והחשיפה האוטומטית.
   הערה: היצרן ממליץ לדגום את הצלחת בחממה שאינה CO₂ 37 °C למשך שעה אחת; ניתן לדלג על שלב זה אם מעדיפים הדמיה אוטומטית. לדוגמה, מדמיית המיקרו-פלטה שומרת על אותם תנאים בתא סגור, וניתן לדמות תאים תחת שדה בהיר.

6. הגדרת הבדיקה וההדמיה

איור 3: תוכנת הבקר. התוכנה מוודאת שהציוד מחובר ומוגדר ל-37 מעלות צלזיוס. ניתן לבחור את קבצי התבנית עבור מבחנים שונים שניתן לבצע עם מנתח השטף החוץ-תאי כדי להתאים אישית את הבדיקה הלאה על סמך מטרות הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

1. פתח את תוכנת שולחן העבודה במחשב שליד הציוד.
2. בדוק את מצב החיבור בפינה הימנית התחתונה של תוכנת הבקר.
3. עבור אל תבניות ובחר את קובץ התבנית XF ATP Rate Assay או את תבנית הבדיקה המתאימה.
4. בחר הגדרות קבוצה בחלק העליון של המסך והגדר את הקבוצות.
5. בחר את פריסת מפת הלוח והקצה את הבארות בהתאם לקבוצות שהוגדרו.
6. אמת את פרוטוקול המכשיר, ודא שהתרכובות שנוספו מפורטות כראוי וכלול את פרטי הפרוייקט עבור הפניות עתידיות.
7. לחץ על הפעל Assay; פעולה זו תבקש את הבחירה של מיקום אחסון הקבצים של התוצאה.
8. בחר את המיקום כדי לשמור את קובץ התוצאה.
9. שמור את הקובץ עם תאריך הבדיקה ולחץ על התחל הפעלה.
10. הנח את מחסנית החיישן ואת לוחית השירות על המגש ולחץ על אני מוכן להתחיל את הכיול.
11. לפני תחילת הכיול , ודא שמכסה המחסנית מוסר, ומחסנית החיישן ממוקמת בכיוון הנכון בלוח השירות. שלב זה ייקח 10-20 דקות, ולאחר השלמתו, התוכנה תציג את תיבת הדו-שיח Load Cell Plate .

7. השג תמונות בשדה בהיר

הערה: שלב זה הוא אופציונלי. אם אין ציוד הדמיה זמין, דלג לשלב 8.

איור 4: תוכנת ההדמיה התאית מתקשרת לקורא ההדמיה דרך המחשב. ניתן לדמות את התאים במיקרו-פלטה לפני ואחרי הבדיקה, וספירת התאים/באר מתקבלת לאחר הבדיקה כדי לנרמל את הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

1. פתח את תוכנת ההדמיה של התאים במחשב.
2. ודא שמצלמת המיקרו-פלטה מופעלת והיציאות מחוברות למחשב.
3. בדוק את שורת המצב בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לוודא שהטמפרטורה מוגדרת ל- 37 °C (77 °F) ושמצב החיבור צריך להיות מודגש בירוק כמוכן.
4. סרוק את ברקוד הצלחת כדי להתחיל בתהליך ההדמיה.
5. ספק שם ללוחית התא ולחץ על שמור (זהו השם שבו יישמרו גם תמונות שדה בהיר וגם תמונות פלורסנטיות). לחץ על בצע סריקת ברייטפילד.
6. המסך, הצלחת ותפריט הסריקה הבאים, מציגים את האפשרויות להדמיה. לפני הבדיקה, בחר התחל סריקת ברייטפילד.
7. מניחים את המיקרו-פלטה של תרבית התאים יחד עם כיסוי/מכסה הצלחת על מחזיק המגש ומיישרים היטב את A1 עם סימן A1. לחץ על סגור מגש.
8. המסך הבא, רכישת תמונה ברייטפילד, עם מפת צלחת מופיע. לחץ על Scan All Wells, אשר יוזם את תהליך אתחול המערכת ואחריו 30 עד 35 דקות של סריקה.
9. לאחר סריקת ה-brightfield, הסר את המיקרו-פלטה של תרבית התא והנח אותה במנתח כדי לבצע את הבדיקה.

8. הרצת הבדיקה

1. לאחר השלמת הכיול, התוכנה מציגה את תיבת הדו-שיח Load Cell Plate .
2. לחץ על פתח את המגש כדי להחליף את מגש השירות במיקרו-לוחית של תרבית תאים. ודא שהמכסה מוסר וה- A1 של הצלחת מתאים בכיוון הנכון.
3. לאחר מכן, לחץ על טען צלחת תא כדי ליזום את הבדיקה. מחסנית החיישן תישאר בתוך המנתח עבור זריקות הבדיקה.
4. המתן עד שהבדיקה תתחיל ותציג את זמן ההשלמה המשוער.
5. עם השלמת הבדיקה, התוכנה מציגה את תיבת הדו-שיח של מחסנית חיישן הפריקה . לחץ על פלטה והסר את המיקרו-פלטה של תרבית התאים מהמנתח.
6. הסר בזהירות את מחסנית החיישן והחלף את מכסה לוחית התא. התאים מוכנים להדמיה פלואורסצנטית ולספירת תאים.
7. לאחר הסרת לוחית התא ומחסנית החיישן, מופיעה תיבת הדו-שיח Assay Complete .
8. לחץ על הצג תוצאות כדי לפתוח את קובץ תוצאת הבדיקה ולנרמל את הנתונים באופן מיידי או לחץ על בית.

9. השג תמונות פלואורסצנטיות ונרמל

הערה: שלב זה הוא שיטה אופציונלית אך מועדפת לנורמליזציה של BMSCs ואוסטאובלסטים. אם אין ציוד הדמיה זמין, יש לבצע שיטת נורמליזציה נוספת, כגון בידוד וכימות חלבונים או DNA.

איור 5: תמונות מייצגות מתוכנת ההדמיה המשמשת לנורמליזציה של נתונים מהבדיקה. (B) תמונה פלואורסצנטית תפורה המציגה גרעינים מוכתמים ב-Hoechst של אוסטאובלסטים המשמשים לספירת מספרי תאים כדי לנרמל את תוצאות הבדיקה. אלה הם אוסטאובלסטים לאחר 7 ימים של התמיינות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

1. לאחר השלמת הבדיקה, סרוק את ברקוד הצלחת עם קורא הברקוד הידני. אם הצלחת כבר צולמה, היא לא תדרוש שם חדש.
2. בחר פלואורסצנציה וספירת תאים, מקם את לוחית התא על מחזיק המגש ולחץ על סגור מגש.
3. בחלון רכישת התמונה, בחר סרוק את כל הבארות כדי להתחיל בהדמיה. הדמיה פלואורסצנטית אורכת כ-15-20 דקות כדי לסרוק את הצלחת כולה. שימו לב לסימן הסימון הירוק המציין כי הסריקה הושלמה.
4. סקור את התמונות הפלואורסצנטיות ואת ספירת התאים ביישום ההדמיה וההדמיה של התאים על ידי לחיצה אקראית על כמה מהבארות.
   הערה: קיימת אפשרות להציג תאים שנספרו בפינה השמאלית התחתונה של המסך. אפשרות זו מציגה תמונה עם מסיכה, המסמנת את האובייקטים שנספרו.
5. לאחר השלמת ההדמיה הפלואורסצנטית, ייצא את התמונות להפניות נוספות.
6. לאחר השלמת ההדמיה וספירת התאים, פתח את קובץ התוצאות ולחץ על נרמל. מסך הנורמליזציה ייתן את פריסת הלוחית ואפשרות לייבא את ספירת התאים.
7. לחץ על ייבוא ובחר הגש בקשה לתוכנת שולחן העבודה כדי לנרמל את הבדיקה באמצעות ספירת תאים באופן אוטומטי.

תוצאות

איור 6: גרפים מייצגים לבדיקות המבוצעות באופן שגרתי כדי להבין את הפרופיל הביו-אנרגטי התאי של קבוצת הביקורת לעומת קבוצת הטיפול עם שגיאות התקן המתאימות שלהם. העלילה מייצגת את הגליקול?...

Discussion

מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת יכול לשמש כדי לחקור את האנרגטיקה התאית בתנאים שונים. הפרוטוקול ממחיש את הבידוד היעיל של BMSCs, תאי התרבות בלוחות תרבית תאים מתאימים, ואת התמיינותם לאוסטאובלסטים בוגרים, אשר יכולים לשמש לבדיקות שונות באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי. יתר על כן, השלבים הקריטיים של בד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid	Sigma - Aldrich	PZ0160	UK5099
Antimycin A	Sigma - Aldrich	A8674
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G
Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide	Sigma - Aldrich	SML0601	BPTES
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma - Aldrich	C2920	FCCP
Cytation 5 imaging reader	BioTek	N/A	Microplate imager
Etomoxir sodium salt hydrate	Sigma - Aldrich	E1905
Hoechst 33342 Solution (20 mM)	Thermo Scientific	62249
Insulin	Sigma - Aldrich	I6634
Oleic Acid-Albumin from bovine serum	Sigma - Aldrich	O3008
Oligomycin A - 5 mg	Sigma - Aldrich	75351
Rotenone	Sigma - Aldrich	R8875-1G
Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200mM Glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF DMEM media	Agilent Technologies	103575-100	DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent Technologies	S7800B	Real- Time Metabolic flux analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent Technologies	102416-100	Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution
The Cell imaging 1.1.0.11 software	Agilent Technologies - BioTek
Wave software 2.6.1	Agilent Technologies
β-glycerol phosphate	Sigma-Aldrich	G9422-50G