מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

Summary

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

Abstract

מניפולציה של ביטוי גנים במוח העכבר המתפתח ברחם טומנת בחובה פוטנציאל גדול למחקרים בגנטיקה תפקודית. עם זאת, בעבר הוא הוגבל במידה רבה למניפולציה של שלבים עובריים לאחר הנוירולציה. פותח פרוטוקול להזרקת חלל מי השפיר ביום העוברי (E)7.5 ולהעברת לנטי-וירוס, קידוד cDNA או shRNA, תוך התמקדות ב->95% מהצלחת העצבית ותאי הצמרת העצבית, מה שתורם למוח, לחוט השדרה ולמערכת העצבים ההיקפית בעתיד. פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים להשגת התמרה מוצלחת, כולל שחיקה של מחטי נימי הזכוכית, אימות הריון, היערכות התפתחותית באמצעות הדמיית אולטרסאונד, ונפחי הזרקה אופטימליים המותאמים לשלבים עובריים.

בעקבות פרוטוקול זה, ניתן להשיג התמרה של >95% מהמוח המתפתח עם lentivirus גבוה titer ובכך לבצע מניפולציה גנטית של מוח שלם. לעומת זאת, ניתן להשיג התמרת פסיפס באמצעות טיטרים נגיפיים נמוכים יותר, מה שמאפשר סריקה גנטית או מעקב אחר שושלת. ההזרקה ב-E7.5 מכוונת גם לאקטודרם ולפסגה העצבית התורמת לתאים שונים של העין, הלשון ומערכת העצבים ההיקפית. טכניקה זו מציעה אפוא את האפשרות לתמרן את ביטוי הגנים ברקמות שמקורן בלוחות עצביים ובאקטודרמים של עכברים משלבי קדם-נוירולציה, עם היתרון של הפחתת מספר העכברים המשמשים בניסויים.

Introduction

המוח וחוט השדרה הם בין האיברים הראשונים שהחלו להיווצר במהלך העובר ^1,2. למרות שהגנים הקשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות מזוהים, החקירה התפקודית של וריאנטים גנטיים פיגרה אחרי ^3,4. מכיוון שיצירת עכברי נוקאאוט מותנים יכולה להימשך חודשים או שנים, טכניקה חלופית לחקור במהירות את תפקוד הגנים במוח המתפתח מעניינת. בעוברי עכברים, נוירולציה - התהליך המורפוגנטי שבו הצלחת העצבית הופכת לצינור העצבי כדי להוליד את מערכת העצבים המרכזית (CNS) - מתרחשת בין הימים 8 ל -10 לאחר ההתעברות⁵. לפני תחילת הנוירולציה, הלוח העצבי, כחלק מהאקטודרם, מורכב משכבה אחת של תאי עמודה שיתפשטו ויתמינו לסוגי תאי הנוירונים והגלייה הרבים בתוך מערכת העצבים ^6,7. לכן, כדי לגרום באופן ניסיוני לשינויים ארוכי טווח בביטוי גנים במערכת העצבים המרכזית, מיקוד הלוח העצבי מציע יתרונות ברורים, כולל הנגישות של כל תאי האב.

במדעי המוח, באלקטרופורציה של ovo ^8,9 והתמרה ויראלית של עוברי עכברים שימשו למניפולציה של ביטוי גנים עובריים של CNS. עובר האפרוח המתפתח היה מודל בחירה לחקר תפקוד הגן במהלך התפתחות חוט השדרה בשל הנגישות של עובר האפרוח בביצית והקלות הנובעת מכך של מניפולציה של ביטוי גנים. בפרט, ב ovo פלזמה אלקטרופורציה מייצרת תנאי ניסוי ובקרה בכל חוט השדרה אפרוח. אלקטרופורציה גורמת לחדירת קרום התא ומכוונת את הדנ"א הטעון שלילית הרחק מהקתודה (השלילית) לעבר האנודה (החיובית) על ידי הפעלת פולס חשמלי באמצעות שתי אלקטרודות על העובר. בעכברים, אלקטרופורציה ברחם הוגבלה בדרך כלל לשלבים עובריים שבהם הנוירולציה הושלמה, והמוח או חוט השדרה כבר מורכבים מכמה שכבות תאים, וכתוצאה מכך יעילות אלקטרופורציה נמוכה¹⁰. אלקטרופורציה פלסמידית גורמת לביטוי גנים חולף ובדרך כלל מכוונת לתאים מעטים.

מונחה אולטרסאונד במיקרו-הזרקות ברחם שימש למניפולציה של מבנים עובריים שונים כגון העור והמוח^11,12,13,14. עם זאת, זריקות המכוונות ל-CNS המורין המתפתח הראו יעילות נמוכה או השפיעו לרעה על ההישרדות העוברית^12,13,14. לכן, פותח פרוטוקול משופר להעברת לנטיוירוס בעל טיטר גבוה לתוך חלל מי השפיר (AC) ב- E7.5, אשר כונה NEPTUNE עבור neural plate targeting עם in uteronano-injection¹⁵. זריקות הביאו ליעילות מיקוד ארוכת טווח של >95% מהמוח כולו ב-E13.5. יתר על כן, הוכנס שלב בימוי במהלך אימות אולטרסאונד של הריון כדי למיין נקבות והריונות לפי שלב התפתחותי כדי למזער הליכים מיותרים על חיות מחקר ולמקסם את הצלחת ההזרקה. יעילות ההזרקה והישרדותה קשורות קשר הדוק לעלייה בגודל זרם החילופין. לכן, מאמר זה מתאר כיצד למדוד את גודל ה-AC לפני ההזרקה כדי לספק נפח מתאים ל-AC שלא יגרום לספיגה מחדש של העובר. NEPTUNE הוא חלופה חזקה לגישות הנוכחיות ברחם וניתן להתאים אותו למספר שימושים, כולל, אך לא רק, רווח ואובדן של מחקרי תפקוד, מעקב אחר שושלת או סינון^15,16. 

Protocol

עכברי CD1 מסוג בר שוכנו על פי התקנות האירופיות, עם מחזור יום ולילה סטנדרטי עם מזון ומים ad libitum. נקבות CD1 הזדווגו עם זכרי CD1 למשך הלילה, ותקעים נרתיקיים נבדקו בבוקר (E0.3). רק נקבות הרות שימשו להזרקה. אישור אתי לכל הניסויים המתוארים כאן ניתן על ידי מועצת החקלאות השוודית (Jordbruksverket).

1. הכנת מחטי זכוכית: משיכת מחט וטחינה

הערה: למרות שניתן לקנות מחטים קדם-קרקעיות, משיכת מחטים בתוך הבית מאפשרת כוונון קל של אורך המחט, הבור וזווית השיקוע.

1. הרכיבו נימי זכוכית לתוך המיקרופיפטה/נימי. השתמש בהגדרות הבאות באמצעות הציוד שצוין (עיין בטבלת החומרים): חום 580 יחידות; מהירות 140 יחידות; זמן 200 יחידות; לחץ 500-800 יחידות.
   הערה: היחידות של פרמטרים שונים מוגדרות על ידי מושך נימי. היחידות עשויות להשתנות עבור ציוד שונה.
2. לחץ על משוך כדי לפרק את הנימים המייצרים שני נימי זכוכית עם קצוות מחודדים.
   הערה: לאחר המשיכה, קצות שני נימי הזכוכית מתמזגים בשל הטמפרטורה הגבוהה של מושך המיקרופיפטה.
3. חתכו את הקצה בעזרת מספריים כירורגיים כדי לקבל אורך מחט של ~7 מ"מ (נמדד מהמקום שבו המחט מתחילה להתחדד) (איור 1A).
   הערה: עבור זריקות E7.5, מחט ארוכה ועדינה היא קריטית מכיוון שאזור ההזרקה קטן מאוד ועדין. מחטים קצרות ורחבות יגרמו למוות עוברי.
4. טחנו את קצה המחט החתוך כדי יצירת שיקוע חד (איור 1C-F).
   1. טוחנים את המחט בזווית של 20° במהירות מקסימלית למשך 30-45 דקות לפחות.
      הערה: מים אולטרה-טהורים מתווספים לצלחת הטחינה כדי לשמש כחומר סיכה, להפחית את החיכוך/הטמפרטורה ולשטוף חלקיקי זכוכית (איור 1B). עם זאת, עודף נוזלים יכול להאט את המטחנה.
   2. ודאו שקצה המחט (איור 1C) נוגע במשטח לוח ההשחזה (איור 1D) אך אינו מתכופף (איור 1E).
      הערה: השחזה מכופפת גורמת לקצה מחט ארוך ושברירי בזווית שיקוע שגויה, אשר יכול להישבר בקלות במהלך ההזרקה. שבירת מחטים עלולה לפגוע בעובר ויש להחליפן במחט שלמה. קצה קרקע נכון מוצג באיור 1F,G. לאחר הטחינה, המחט המתקבלת צפויה להיות בעלת קוטר פנימי (ID) של ~15 מיקרומטר וקוטר חיצוני (OD) של ~35 מיקרומטר (איור 1G).
5. מלאו מזרק של 1 מ"ל בשמן מינרלי והצמידו מחט של 27 גרם.
6. הסר את מכסה המחט והכנס את מחט המזרק לתוך נימי הזכוכית שזה עתה נטחנו. מזריקים שמן מינרלי עד שהשמן מטפטף מקצה הנימי. המשיכו להזריק תוך כדי משיכת מחט 27 גרם עד שהמחט הנימית מתמלאת בשמן מינרלי, ולאחר מכן ניתן להסיר את מחט המזרק.
7. יש לאחסן מחטים טחונות ומלאות בשמן מינרלי בסביבה סגורה כדי למנוע נזק והצטברות אבק. לאחסון, הכניסו שני גלילים של חימר מידול לתוך צלחת פטרי רגילה כדי שישמשו כמחזיקים (איור 1H). הניחו בעדינות את המחטים על החימר והניחו אותן הרחק זו מזו לשליפה קלה של המחטים.
   הערה: מכיוון שהכנת מחטים גוזלת זמן רב, עדיף להכין מחטים לפחות יום אחד לפני ההזרקות. השליכו את המחטים לאחר שתי המלטות לכל היותר מכיוון שהן יהפכו קהות. הכינו תמיד מחטי גיבוי למקרה של נזק למחט במהלך ההכנה או ההזרקה.

איור 1: הכנת מחט להזרקות חלל מי שפיר E7.5. (A) דוגמאות מייצגות של מחט נימי זכוכית משוכה אך לא חתוכה (משמאל), מחט נימי שנחתכה באורך האופטימלי לזריקות E7.5 (באמצע), ונימי שנחתכו קצרים מדי (מימין). (B) המטחנה עם כיסוי אחיד של מים, המוכנה לטחינת מחט. (ג-ו) דוגמאות מייצגות של טיפים מחט שונים. (C) קצה מחט חתוך אך לא קרקעי המותקן במטחנה; (D) תנוחת השחזה אידיאלית כאשר קצה המחט נוגע רק במטחנה; (E) מחט שהונמכה רחוק מדי ומתכופפת במהלך תהליך הטחינה; (F) קצה מחט טחון אידיאלי להזרקות E7.5 AC. (G) קצה מחט טחון המציג את הבור בקוטר פנימי של ~ 15 מיקרומטר וקוטר חיצוני של ~ 35 מיקרומטר, המתאים להזרקת E7.5 AC. נשא המחט מוצג כקווים מקווקווים. קוטר חיצוני מסומן בראשי חץ אדומים; קוטר פנימי מסומן בראשי חץ כחולים. (H) אחסון מחטים: צלחת פטרי מלאה במחטים משוכות וטחונות. שתי שורות של חימר דוגמנות משמשות כמחזיקים. הערה: עבור מיקרומטר העיניים ב- C, F, G, 1 ס"מ מחולק ל -100 מגרשים; המטרה היא פי 3; לכן, 1 פסיעה = 10,000 מיקרומטר/(100 × 3) ≈ 33.4 מיקרומטר. קיצורים: AC = חלל מי שפיר; ID = קוטר פנימי; OD = קוטר חיצוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. יום לפני ההזרקה: להכין ספסל לאולטרסאונד-אימות הריון

הערה: כל העבודה צריכה להתבצע בספסל ביו-בטיחות מאוורר ברמה 2 (BSL 2) בעת עבודה עם lentivirus. אולטרסאונד אימות של הריון יכול להתבצע על ספסל מאוורר.

1. הפעל את מכונת האולטרסאונד, שולחן החימום ואספקת O₂ עבור משאבת האיזופלורן (יכול להשתנות בין ציוד).
   הערה: בדוק את מערכת האיזופלוראן כדי לוודא שאין דליפת איזופלוראן לאוויר.
2. הניחו שקית פסולת ריקה (מודבקת לקיר הפנימי לגישה נוחה), קרם להסרת שיער, צמר גפן סטרילי ארוז, מים, נייר טישו וסרט כירורגי בתוך ספסל BSL 2.
3. הכן ארבע חתיכות של סרט כירורגי (~ 7 ס"מ אורך) כדי לאבטח את איברי העכבר במהלך בדיקת אולטרסאונד של הריון.

3. בדיקת אולטראסאונד כדי לאשר הריון

הערה: ניתן לבצע שלב זה יום לפני זריקות E7.5, ב- E6.5. ראה את הדיון לפרטים על בדיקת גיל ההריון.

1. הניחו את העכבר הנקבה המזדווג בזמן בתא האינדוקציה.
2. הפעל את זרימת הגז עם זרימת חמצן של ~ 2.1 LPM ומינון ראשוני של 3-4% איזופלוראן כדי לגרום להרדמה.
3. ודא כי הנקבה מורדמת לחלוטין על ידי בדיקת רפלקס הכפה. אם רפלקס הכפות נעדר, להוריד איזופלורן ל 1.5-2%.
   הערה: זה לוקח בערך 3 דקות כדי לגרום להרדמה.
4. החלף את זרימת הגז מתא האינדוקציה לחרוט האף של שולחן החימום.
5. מניחים את הנקבה המורדמת בתנוחת שכיבה (בטן למעלה) על שולחן החימום ומניחים את החוטם בקונוס האף המחובר כדי להבטיח שמירה על ההרדמה במהלך בדיקת האולטרסאונד של ההריון.
6. הדקו את כל ארבע כפות הרגליים לשולחן עם חתיכות מוכנות של סרט כירורגי מבלי למתוח את גוף הנקבה או ללכוד את השפם.
7. יש למרוח כמות בגודל אפונה של קרם להסרת שיער על הבטן התחתונה. בעזרת צמר גפן, פזרו את הקרם על הבטן התחתונה (~ 3 x 3 ס"מ מרובע) ועסו אותו בעדינות על ידי גלגול צמר גפן קדימה ואחורה.
8. ברגע שהפרווה מתחילה להתנתק מהעור, להרטיב נייר טישו ולהסיר את הקרם ואת הפרווה. נקו את האזור נטול הפרווה עם נייר טישו לח עד שכל הקרם והשיער נעלמים. יבש את העור.
9. החל כמות בגודל שזיף של ג'ל אולטרסאונד על האזור המגולח ולהמשיך לזהות את הרחם באמצעות אולטרסאונד על ידי כל אחת משלוש הגישות הבאות.
   1. כדי לעשות זאת באופן ידני, החזק את בדיקת האולטרסאונד בג'ל האולטרסאונד והזז את הבדיקה כדי למצוא את הרחם.
   2. עבור גישה חצי-ידנית #1, מקם את בדיקת האולטרסאונד (המחוברת למערכת המעקה) מעל הבטן הנשית על ידי שחרור והזזת חלק מהמעקה לאורך מישור ה-x. הורידו את בדיקת האולטרסאונד לתוך הג'ל (מישור z) וסרקו דרך הבטן התחתונה (מישור y) (איור 2A).
   3. עבור גישה semimanual #2, להוריד את הבדיקה אולטרסאונד (מחובר למערכת המעקה) לתוך הג'ל כדי לדמיין את הבטן התחתונה. השאירו את בדיקת האולטרסאונד נייחת במהלך התהליך, והזיזו את שולחן החימום עם הגלגלים המחוברים לאורך מישורי x ו/או y (איור 2B).
      הערה: בשלבים עובריים מוקדמים אלה, איברים פנימיים, כגון המעי, יכולים להיראות דומים לרחם בהדמיית אולטרסאונד. עם זאת, בעוד עוברים ו decidua מופיעים כרצף של כדורים (דומה חרוזים לאורך שרשרת), המעי יש את המראה של צינור רציף. ניתן להעריך את הקישוריות של מרחבים לומינליים (כדורים נפרדים לעומת צינור רציף) על-ידי סריקה קדימה ואחורה דרך מבנה העניין כדי לקבוע אם המבנה הוא כדור בדיד (עובר/מחליט) (איור 2C) או צינור רציף (מעי) (איור 2D). בשלב זה, אין צורך לרשום את מספר העוברים; זה מספיק כדי לאשר את נוכחותם או היעדרם.
10. לאחר קביעת מצב ההריון, הרימו את בדיקת האולטרסאונד הרחק מהבטן ונגבו את הבטן התחתונה בנייר טישו לח כדי להסיר את ג'ל האולטרסאונד.
11. כבה את משאבת האיזופלוראן והסר את סרט הניתוח כדי לשחרר את הכפות.
12. הניחו את הנקבה במצב נוטה (בטן למטה) לכלוב נקי על פלטת חימום של 40 מעלות צלזיוס. שמור את הנקבה תחת השגחה צמודה עד שהיא חוזרת להכרה, אשר לוקח 2-6 דקות.
    הערה: יש לוודא שבדיקת האולטרסאונד עבור נקבה אחת היא <10 דקות כדי למזער את החשיפה לאיזופלוראן.
13. הסר את כל החומרים והפסולת ונקה את כל המשטחים עם 70% אתנול. נגב את שאריות ג'ל האולטרסאונד מבדיקת האולטרסאונד עם טישו נייר יבש, רך ונטול מוך. כבה את מכונת האולטרסאונד, ספסל מאוורר / ספסל BSL2, שולחן חימום ואספקת O₂ .

4. בדיקת אולטראסאונד לבימוי העובר

הערה: שלב זה מבוצע לפני הניתוח ומשמש לריבוד הנשים ההרות בהתאם לגודל המזגן שלהן. שלב זה הוא קריטי ב- E7.5 כאשר המטרה היא להתמקד במערכת העצבים המרכזית המתפתחת. בשלב מוקדם זה של ההתפתחות, הבדל של כמה שעות בהתפתחות משפיע באופן משמעותי על גודל ה- AC ועל התקדמות הנוירולציה.

1. הרדימו את העכבר הנשי ההרה הראשון בעקבות השלבים בשלבים 3.1-3.5.
2. הניחו וקיבעו את הנקבה על השולחן כמתואר בשלב 3.6.
3. יש למרוח כמות בגודל שזיף של ג'ל אולטרסאונד על הבטן המגולחת ולהנמיך את בדיקת האולטרסאונד כדי לדמות את הבטן התחתונה של הנקבה.
   הערה: שלב זה מניח שהנקבה נבדקה על ידי אולטרסאונד ביום הקודם להריון וכבר הוסרה פרווה על הבטן. אם זה לא המקרה, יש להסיר את הפרווה לפני הוספת ג'ל אולטרסאונד בשלבים 3.7-3.8. ב E7.5, הרחם ואת deciduas הם גדולים יותר וקל יותר להבחין בין איברים פנימיים. בנוסף, זרם החילופין גדול יותר וניתן להבחין בינו לבין החלל האקסוקלומי (ExC).
4. סרוק דרך קרני הרחם השמאלית והימנית באופן מלא ככל האפשר.
   הערה: חלק מהעוברים שוכבים עמוק יותר בתוך גוף הנקבה וניתן לפספס אותם.
5. רשום את המספר והשלבים של העוברים. רשום לעצמך את מספר חללי מי השפיר בגודל אידיאלי, חללים קבילים ופענוחים ללא חלל (איור 2E-G).
6. לביים את כל ההריונות ולדרג אותם בהתאם.
7. יש להזריק לנשים רוב של ACs בגודל אידיאלי מיד לאחר בדיקת האולטרסאונד (שלב 4.4) בהתאם להוראות בשלבים 4.5-4.7.
8. עבור נקבות עם רוב מקובל (שבו חללים exocelomic ו מי השפיר עדיין לא מחולקים בבירור לשני חללים) או חללים נעדרים, לדחות את ההזרקה שלב אותם שוב לאחר כמה שעות. אם רוב החללים עדיין קטנים מדי, לדחות את הזריקות ב 10-12 שעות.

איור 2: בדיקה והיערכות של חללי מי השפיר במהלך בדיקת אולטרסאונד. (A) סקירה כללית של מערכת המסילה עם בדיקת אולטרסאונד מחוברת, ננו-אינפוזיטור ושולחן חימום. ניתן להזיז את בדיקת האולטרסאונד במישורי x, y ו-z כדי להשיג יישור אופטימלי עם הבטן הנשית או עם ה-ACs. (B) ניתן להזיז את שולחן החימום באמצעות שני גלגלים במישורי x ו/או y כדי לאפשר סריקה והערכה מדויקות של ה-ACs, בעוד שבדיקת האולטרסאונד יכולה להישאר סטטית. (C) תמונות אולטרסאונד מייצגות של E6.5 deciduas בתוך הבטן הנשית במהלך בדיקת אולטרסאונד כדי לאשר הריון (קווי מתאר מנוקדים לבנים). בשלב זה לא נוצרו חללים; עם זאת, לפעמים, חרוט ectoplacental (כוכביות לבנות) גלוי. Deciduas ניתן לזהות על ידי הצורה הכדורית שלהם נבדל מן המעי, אשר מופיע כמו צינור רציף אחד. (D) רצף תמונה מייצג של המעי הדק (קווי מתאר מנוקדים לבנים), שהוא רציף בסריקה דרך הבטן התחתונה. (אי-ג) תמונות אולטרסאונד מייצגות במהלך סידור החלל לפני הזרקות E7.5. חללי מי השפיר והאקסוקלומיים נוצרו ומופרדים על ידי האמניון. חרוט ectoplacental משמש את אספקת הדם העיקרית ומופיע כנקודת אור באולטרסאונד. זרם החילופין הוא הדיסטלי ביותר מהחרוט האקטו-פלסנטלי. (E) ACs בגודל אידיאלי נראים גדולים יותר מהחלל האקסוקלומי, בעוד שחללים בגודל בינוני נראים קטנים יותר (F). אם אין חללים נראים לעין (G), משמעות הדבר היא שהעובר הוא resorbed או לא הגיע E7.5 עדיין. סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ. קיצורים: A = אמניון; AC = חלל מי השפיר; ExC = חלל אקסוקלומי; EC = חרוט אקטו-פלסנטלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. יום ההזרקה: הכינו את ספסל BSL2 לניתוח

1. הדביקו חתיכה אחת של קרום אלסטי לפתח העגול והמרכזי של צלחת פטרי מותאמת הזמינה מסחרית. ודא כי הממברנה מחוברת היטב לצלחת פטרי כדי למנוע דליפה.
   הערה: אם התבשיל דולף או אינו מודבק היטב, ניתן לאבטח עוד יותר את שולי הממברנה האלסטית באמצעות סרט דביק.
2. בצע חתך באורך 1-1.5 ס"מ במרכז הממברנה האלסטית.
3. הפעל את מכונת האולטרסאונד, ספסל BSL2, צלחת חימום, אספקת O₂ למשאבת האיזופלורן, ומחטא חרוזי זכוכית (מוגדר ל -300 מעלות צלזיוס).
4. בתוך ספסל BSL2, הנח שקית פסולת ריקה אחת (מודבקת לקיר הפנימי לגישה נוחה); צמר גפן ארוז סטרילי (השתמש באחד חדש לכל ניתוח / כל נקבה); כלי ניתוח (מספריים, פינצטה, קליפסים, תפר) וסרט כירורגי; בקבוק מלא אחד של מי מלח עם אגירת פוספט בטמפרטורת החדר (PBS), בקבוק ריק אחד לאיסוף פסולת ופיפטה אחת של 25 מ"ל; צלחת פטרי אחת עם קרום אלסטי לניתוח; המכסה של צלחת פטרי עם 2 x 2-3 x 3 ס"מ חתיכת parafilm מאובטח למכסה עם טיפת מים; חימר דוגמנות: 4 כדורים או קוביות גדולים יותר (~ 3 x 3 x 3 סמ"ק ) וחתיכה גלילית אחת (~ 4 x 1 ס"מ); מזרק עם משכך כאבים (למשל, buprenorfine, 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וג'ל עינייםהערה: הכדורים (או הקוביות) של חימר דוגמנות ישמשו כ"רגליים" או מעמדים/מחזיקים לצלחת הפטרי ברגע שהצלחת מונחת על גבי הבטן של הנקבה. פיסת החימר הגלילית מאבטחת את העוברים בתוך המנה. אם מזריקים יותר מתמיסה אחת, או שיש למלא את המחט מחדש במהלך ההזרקות, ניתן להשתמש באותה פיסת פרפילם אם ניתן להפריד בין התמיסות.

6. העמסת מחטים

1. נגבו כל שמן מינרלי עודף עם נייר טישו לאחיזה טובה יותר.
   הערה: יש לנקות תמיד הרחק מהקצה כדי למנוע נזק או פציעה.
2. ודא שכל הרכיבים (טבעת O אוטמת אחת, מרווח אחד ואטם קדמי אחד - כולם מאוחסנים מתחת לקולט, איור 3A) מותקנים בכיוון הנכון (איור 3B, קולט שהוסר לצורך הדמיה) כדי להחזיק את המחט הנימית במקומה וליצור חיבור אטום, תוך הימנעות מהיווצרות בועות בעת התקדמות או נסיגה של בוכנה המתכתית בתוך המחט.
3. ודא כי בוכנה מתכת של nanoinjector הוא נסוג לחלוטין. ודא על-ידי הקשה על מילוי והמתן לצפצוף כפול המציין שהבוכנה נסוגה במלואה.
4. כאשר הקולט מחובר אך משוחרר מעט (לא מוברג 45-90 מעלות), החלק את מחט הזכוכית על בוכנה המתכתית ודחף את המחט הנימית יחד עם בוכנה המתכת דרך האטם הקדמי עד שהיא מגיעה למרווח (איור 3C,D, קולט הוסר לצורך הדמיה).
   הערה: התנגדות מסוימת מופיעה כאשר הבוכנה עוברת דרך האטם ופוחתת כאשר היא מגיעה למרווח. ודא שהמחט הנימית מוחדרת היטב לתוך המרווח כדי ליצור חיבור אטום (איור 3D).
5. אבטחו את המחט על ידי הידוק קולט הננו-אינג'קטור (הברגה חזרה בצורה מאובטחת).
   הערה: אין להדק יתר על המידה מכיוון שהדבר עלול למחוץ את המחט.
6. לחצו על Empty כדי לדחוף את הבוכנה לתוך המחט ולהוציא את השמן מקצה המחט. אם מחט הזכוכית זזה, החזירו את הבוכנה, הסירו את המחט וטענו מחדש. אם זה גורם בועות אוויר להיווצר, להסיר את המחט ולמלא מחדש עם שמן מינרלי.
   הערה: מחט מאובטחת כראוי לא אמורה לזוז עם הבוכנה.
7. הניחו טיפה של הנגיף (~ 6 μL) או תמיסת הזרקה אחרת על פיסת פרפילם¹ (איור 3E; הצבע הכחול של אוונס משמש למטרות הדמיה).
   הערה: הנפח המרבי של הננו-אינג'קטור הוא ~5 μL.
8. לחצו על 'מילוי ' כדי ליצור בועת אוויר שתשמש כמחיצה בין השמן לתמיסה (איור 3F).
   הערה: זה משמש גם כסמן מיקום בעת מילוי או ריקון המחט.
9. הורידו את המחט, טבלו את הקצה לתוך התמיסה ולחצו על Fill (איור 3F,G).
10. צפו ברמת הנוזלים כאשר התמיסה נטענת לאחר בועת האוויר. דחף ריק כדי לגרש את הסתימה וטען מחדש על ידי לחיצה על מילוי אם בועת האוויר מתארכת מבלי שהנוזל ייכנס למחט. אם זה לא פותר את הבעיה, לשנות את המחט.
11. כאשר המחט טעונה במלואה (איור 3H), הרם את המחט במישור z, ושאף נפח קטן של אוויר בקצה כדי למנוע אידוי של התמיסה בקצה המחט וסתימת המחט.
12. סובב את הננו-אינג'קטור עם המחט המחוברת הרחק מהמפעיל, לכיוון החלק האחורי של הספסל, כדי למנוע נזק או פציעה מקריים.

איור 3: הצמדת המחט לננו-אינז'קטור והעמסת התמיסה. (A) תנוחת התחלה לפני הרכבת המחט על הננו-אינג'קטור: בוכנה מתכתית נסוגה לחלוטין וקולט מחובר. (B) מתחת לקולט, כל שלושת המרכיבים להחזקה ולאבטחה של המחט מוצגים בסדר הנכון (משמאל לימין): איטום O-ring (דק ושחור), ספייסר (לבן), O-ring (שחור) עם חור גדול (שהמחט חייבת לעבור דרכו). כדי להבטיח חיבור אטום, מחליקים את מחט הזכוכית על בוכנה המתכתית (C) ודוחפים אותה דרך פתח טבעת ה-O הקדמית עד שהיא מגיעה למרווח (D). (א-ח) העמסה של הפתרון לתוך המחט. (E) טיפה אחת של תמיסה מונחת על חתיכת פרפילם על מכסה צלחת. (F) צור בועת אוויר על ידי לחיצה על מילוי לפני טעינת התמיסה וטבול את קצה המחט בתמיסה. (G) התמיסה נטענת לתוך המחט. (H) התמיסה מועמסת לתוך המחט. הערה: הקולט הוסר ב- (B-D) לצורך הדמיה, אך אמור להישאר מחובר במהלך ניסויים. השלב האחרון באבטחת המחט הוא הידוק הקולט. הצבע הכחול של אוונס משמש להדמיה ב- E-H. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

7. זריקות

הערה: כל המכשירים המשמשים בהליך זה מעוקרים לפני הניתוח ובין כל עכבר.

1. הרדימו את הנקבה הראשונה עם חללים בגודל אידיאלי (ראו סעיף 4).
2. מניחים וממקבעים את הנקבה על השולחן, כמתואר בשלבים 3.1-3.6.
3. יש למרוח ג'ל עיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית ולהזריק משכך כאבים תת עורית.
   הערה: משככי כאבים מומלצים: בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) או פלוניקסין (2.5 מ"ג/ק"ג) או דומה בהתאם לתקנות רווחת בעלי החיים המקומיות. משכך כאבים פריאופרטיבי רב מודאלי נשמר עם משככי כאבים מוזרקים ואיזופלורן.
4. באופן אספטי להכין את הבטן התחתונה על ידי ניגוב עם מטלית ספוגה עם 0.5 מ"ג / מ"ל chlorhexidine פתרון (או דומה) ולייבש את העור. השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך עור אנכי בקו האמצע של 1.5-2.0 ס"מ בבטן התחתונה.
   הערה: הכן את אזור הניתוח לאחר שגרת חיטוי מאושרת מקומית.
5. הרימו את העור בעדינות ושחררו את העור משכבת השריר שמתחתיו, כ-1 ס"מ סביב נקודת החתך, כדי להקל על התפירה לאחר הניתוח.
6. בצעו חתך אנכי בקו האמצע של 1 ס"מ לתוך שכבת השריר.
7. בעזרת זוג מלקחיים, הרימו צד אחד של העור ושכבת השרירים ועם הזוג השני, חפשו את קרני הרחם.
   הערה: הפענוחים מסודרים כמו חרוזים על שרשרת, בעוד שהמעי הוא צינור אחד ארוך ורציף (איור 4A).
8. עם מלקחיים, בזהירות לשלוף את שתי קרני הרחם מן הבטן. להחזיק את הרקמה בין העוברים; אין לסחוט אותם ישירות (איור 4B).
   הערה: הרחם מחובר לגוף בצוואר הרחם, ושתי השחלות/oviducts מחוברות באמצעות רצועות. אין למשוך/לנתק את הרחם מנקודות עיגון אלו.
9. לספור ולרשום את מספר העוברים בצד שמאל וימין.
10. מספר העוברים מהשחלה לצוואר הרחם או מצוואר הרחם לשחלה.
    הערה: זה חשוב במיוחד אם עוברים מוזרקים ייאספו בשלבים עובריים.
11. בעזרת צמר גפן לח, דחפו בעדינות את כל העוברים בחזרה לחלל הבטן, למעט שלושת הראשונים להזרקה.
12. מניחים טיפה של PBS על האלסטיות בצלחת הפטרי ומחזיקים אותה מיד מעל העוברים.
13. מכניסים מלקחיים סגורים לחתך האלסטי ומשחררים את המלקחיים כדי לפתוח את החתך האלסטי כך שהנוזל ייפול על העוברים.
    הערה: זה מבטיח התייבשות של העוברים וכי הממברנה האלסטית נדבקת לעור הרטוב של הנקבה, ומונעת דליפה של PBS בשלבים הבאים.
14. משוך קטע של הרחם, המתאים לשלושה עוברים, דרך האלסטי עם מלקחיים, והניח בעדינות את צלחת פטרי על בטנה של הנקבה.
15. עם מלקחיים וצמר גפן לח, להתאים את מיקום הרחם ואת אלסטי כדי להבטיח כי אלסטי אטום לעור של הנקבה כדי למנוע דליפת PBS.
16. השתמש בארבע רגלי החימר כדי לאבטח ולהדק את צלחת הפטרי מיד מעל הבטן, מה שמפחית את הלחץ על הנקבה ואת רגישות ההדמיה לנשימה ולפעימות הלב של הנקבה.
17. לחצו על גליל החימר המידול כלפי מטה מימין לעוברים/רחם כדי לקבע את הרחם (איור 4C).
    הערה: הוראת אוריינטציה זו מניחה כי המחט נמצאת משמאל לנקבה וכי העוברים של קרן הרחם השמאלית של הנקבה חשופים. צד הרחם (קרן רחם שמאלית או ימנית) הוא קריטי מכיוון שהמזגן פונה אל המחט (קרן שמאל; איור 4D) או פונה אל גליל החימר המייצב (קרן ימין; איור 4E).
18. כדי להזריק עוברים מקרן הרחם הימנית, הניחו את גליל החימר בצד שמאל של העוברים (איור 4F) וסובבו את שולחן החימום בזווית של 180° (איור 4G) כדי להשיג את הכיוון הנכון. אם ניתן להזיז את המחט במקום זאת, התאימו אותה בהתאם להגדרה הרלוונטית.
19. הוסף PBS לצלחת פטרי עד שהעוברים והרחם מכוסים ב- PBS.
20. הורידו את בדיקת האולטרסאונד ל-PBS והתאימו את העכבר/שולחן הניתוחים כך שהעובר הראשון יתיישר עם בדיקת האולטרסאונד כדי להקל על הקלטת הזריקות.
    הערה: "ראשון" מתייחס למספור העוברים מהשחלה לצוואר הרחם.
21. סרוק את כל שלושת העוברים ובדוק את ה- ACs. קבע את נפח ההזרקה באופן הבא:
    1. מדוד את קוטר זרם החילופין באמצעות מכשיר האולטרסאונד. להזריק 69 nL אם קוטר AC הוא ≤0.2 מ"מ; להזריק 2 x 69 nL (= 138 nL) אם קוטר AC הוא >0.2 מ"מ ו ≤0.29 מ"מ; ולהזריק 3 x 69 nL (= 207 nL) אם קוטר AC > 0.29 מ"מ (איור 4H).
       הערה: ניסויים קודמים הראו כי עד 207 נפחי הזרקה nL נסבלים היטב ב- E7.5¹⁵. זריקות מוצלחות עם השפעה מינימלית על ההישרדות מושגות כאשר הגידול היחסי בנפח של AC אינו עולה על 90%¹⁵. שונות בגודל זרם החילופין בין זני פסולת או עכברים היא נפוצה ועשויה לדרוש אופטימיזציה נוספת.
22. הגדר את נפחי ההזרקה עם בקר ההזרקה.
23. הגדר את מהירות ההזרקה להאטה עם קצב הזרקה של 23 nL/s.
    הערה: דגמי ציוד שונים יכולים לגרום לכוחות הזרקה שונים.
24. הורידו את המחט לתוך ה-PBS באמצעות הגלגלים הראשיים של מערכת המסילה (מישורי x ו-z, איור 4I) ולחצו על Empty על בקר הננו-אינג'קטור עד שהנוזל יגיע לקצה המחט.
    הערה: אם המחט נסתמה, לחיצה על Empty עלולה להמיס את הסתימה ו/או לגרש את הסתימה.
25. הרם את המחט מתוך ה- PBS ולחץ על הזרקה. ודא כי טיפה של הנפח הרצוי המשוער משוחרר.
26. הורידו את המחט לתוך ה-PBS והתאימו אותה לבדיקת האולטרסאונד ולעובר על-ידי הזזת הננו-אינז'קטור עם גלגל ה-y-plane על המיקרומניפולטור (איור 4J).
    הערה: קצה המחט מיושר בצורה מושלמת כאשר הוא מופיע כנקודה בהירה בתמונת האולטרסאונד (איור 4K,L). ניתן להזיז את המחט בכל שלושת מישורי הכיוון עם המיקרומניפולטור.
27. התאם את זווית המחט עם גלגל זווית ההזרקה כדי להבטיח זווית הזרקה כמעט ניצבת ביחס לדופן הרחם. החדירו את המחט לזרם החילופין בתנועה אחת באמצעות גלגל ההזרקה במיקרומניפולטור (איור 4J-M). שימו לב לבהירות קצה המחט. אם קצה המחט נעלם מתמונת האולטרסאונד, הזז את בדיקת האולטרסאונד קדימה או אחורה כדי להחזיר את המחט לפוקוס.
    הערה: ברגע שהמחט נמצאת בתוך זרם החילופין, ניתן לבצע שינויים קלים במיקום המחט ובמיקוד מבלי לפגוע בעובר (התאמות בטווח של ~0.3 מ"מ). אין להתאים את מיקום המחט יותר מזה.
28. לחץ על הזרקת (עבור 207 nL, הגדר את עוצמת הקול ל- 69 nL והזרק שלוש פעמים). לאחר ההזרקה, יש להמתין 5-10 שניות נוספות לפני החזרת המחט בתנועה עדינה אחת.

איור 4: גודל וכיוון אופטימליים של חלל מי השפיר להזרקות מוצלחות . (A) קרן רחם עם מספר פענוח E7.5, בצורת מחרוזת של כדורים (למטה) בהשוואה למעי הגס (למעלה). (B) לתפוס רקמת רחם (קווים לבנים מנוקדים) בין המחליטים. הימנעו מסחיטה ישירה של ה-deciduas (ראשי חץ לבנים) עם מלקחיים, שכן העוברים המתפתחים שבריריים בשלב מוקדם זה ונוטים לספיגה מחדש על כוח חיצוני מופרז. (C) נקבה בתנוחת שכיבה עם פדידואות שנחשפו בצלחת פטרי מלאה ב-PBS והורכבה על ארבעה מטרים של חימר דוגמנות. הדקידואים מיוצבים על ידי פיסת חימר מידול נוספת, בצורת גליל. (ד, ה) האוריינטציה של זרם החילופין מושפעת מהצד של קרן הרחם החשופה. אם נעשה שימוש ב-deciduas מקרן הרחם השמאלית, ה-AC יפנה הרחק מייצב החימר ויהיה נגיש בקלות למחט משמאל (D). עם זאת, אם נעשה שימוש בקרן הרחם הימנית, החרוט האקטו-פלסנטלי יעמוד במקום זאת מול המחט, מה שמקשה על הגישה ל- AC (E). לכן, כאשר מזריקים לתוך קרן הרחם הימנית, מייצב החימר ממוקם לכיוון הצד הפונה למחט (F), ואת כל שולחן החימום הוא סובב 180 ° (G). (H) נפחי ההזרקה המומלצים בהתאם לגודלי AC. באופן כללי, חללים עם קוטר ≤ 0.2 מ"מ ניתן להזריק עם מקסימום של 69 nL. קטרים > 0.2 מ"מ ו ≤ 0.29 מ"מ לסבול נפחים עד 2 x 69 nL (138 nL) וחללים > 0.29 מ"מ ניתן להזריק עם 3 x 69 nL (207 nL). פסי קנה מידה = 1 מ"מ. (I, J) ננו-אינג'קטור מחובר למערכת המסילות וניתן להזזה במישורי x ו/או z. ניתן לכוונן את זווית המחט באמצעות גלגל זווית ההזרקה . (יא, ל) קצה המחט (ראש חץ לבן) מיושר עם זרם החילופין כאשר הוא נראה הבהיר ביותר באולטרסאונד (L). (M) תמונת אולטרסאונד המציגה את תהליך ההזרקה, שבו קצה המחט נמצא ב- AC ומיושר היטב (ראש חץ לבן). קיצורים: A = אמניון; AC = חלל מי השפיר; ExC = חלל אקסוקלומי; EC = חרוט אקטו-פלסנטלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

29. העבר את השלב לעובר הבא וחזור על שלבים 7.22-7.26 עבור שני העוברים האחרים אם יש להם גודל AC מתאים.
30. הרם את בדיקת האולטרסאונד והמחט מתוך ה- PBS באמצעות המיקרומניפולטור. יש להרחיק את המחט מהמפעיל כדי למנוע נזק ופציעה.
31. בעזרת מלקחיים, כוון את העוברים^{1 ו -}2^בחזרה לתוך הבטן של הנקבה על ידי דחיפה עדינה דרך האלסטי. תפסו בעדינות את הרקמה הסמוכה לעובר^השלישי ומשכו את הרחם לכיוון הקצה העליון של החתך האלסטי. משכו בעדינות את ^{העוברים} 4-6 עם מלקחיים ואפשרו לעובר^ה-3 להיכנס שוב לבטן.
    הערה: ניתן לבצע שלב זה מבלי לשנות את ה- PBS או להסיר את צלחת פטרי.
32. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך עד להזרקת כל העוברים עם ACs אופטימליים או עד להגעה למגבלת הזמן.
33. דחפו בעדינות את העוברים/הרחם בחזרה לבטן הנקבה.
34. שאפו את ה- PBS והסירו את צלחת הפטרי. אם נעשה שימוש בנגיף, טפל כפסולת זיהומית.
35. תופרים יחד את השכבה השרירית עם Vicryl (USP 6-0, אורך המחט 13 מ"מ, 3/8 מעגל) בתפרים פשוטים רציפים או מופרעים וסוגרים את העור עם 1-2 קליפסים (ראו טבלת חומרים).
36. כבה את משאבת האיזופלורן.
37. הסר את סרט הניתוח והניח את הנקבה במצב נוטה (בטן למטה) בכלוב נקי על צלחת חימום 40 מעלות צלזיוס.
    הערה: הנקבה צפויה לחזור להכרה ולהיות ניידת תוך 10 דקות. ודא שההליך הושלם תוך 30 דקות. הרקע הגנטי, הגיל והמשקל של הנקבה עשויים להשפיע על הרגישות להרדמה. עקוב אחר העכברים במהלך הניתוח לאיתור סימנים של נשימה איטית (נשימה איטית פירושה שהרדמה עמוקה מדי) או תנועה (הרדמה קלה מדי). בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) או פלוניקסין (2.5 מ"ג/ק"ג) או דומה בהתאם לתקנות רווחת בעלי החיים המקומיות, ניתן לספק 8 שעות לאחר הזריקה הראשונה במידת הצורך.
38. אם יש להזריק נקבה אחרת, הכינו את אזור הניתוח תוך מעקב אחר ההתעוררות של הראשונה.
    1. נגב את כלי הניתוח עם 70% אתנול כדי להסיר כל שאריות דם או רקמות ולעקר אותם במעקר חרוזי זכוכית שחומם מראש במשך 10 שניות. השליכו את מקלוני הכותנה ואת נייר הטישו המשומש. נגבו את צלחת הפטרי ואת חתיכות החימר לייבוש בנייר טישו.
39. חזור על שלבים 7.1-7.35 עד שכל הנקבות הוזרקו.
40. לרוקן ולהשליך את המחט.
    1. אם נותר וירוס או תמיסת הזרקה במחט, יש ללחוץ על Empty על הננו-אינג'קטור ולרוקן את תכולת המחט על נייר טישו.
    2. חזור על בוכנה המתכת לחלוטין על ידי לחיצה על מילוי עד שיהיה צפצוף כפול מהבקר, המציין כי הבוכנה נסוגה לחלוטין.
    3. שחררו את הקולט והחליקו את המחט מעל בוכנת המתכת. השליכו את המחט לתוך מיכל הפסולת של שארפ.
41. נקה את ספסל BSL-2.
    1. אם נעשה שימוש בנגיף, יש לרסס את כל שדה הניתוח בחומר חיטוי (ראו טבלת חומרים). לאחר 15 דקות, נגבו את חומר החיטוי ונקו את כל שדה הניתוח עם 70% אתנול. אם לא נעשה שימוש בנגיף, נקו את כל המשטחים עם 70% אתנול.
    2. נגבו את שאריות ה-PBS מבדיקת האולטרסאונד בעזרת נייר טישו יבש, רך ונטול מוך.
42. השליכו פסולת בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגית.
43. כבה את מכונת האולטרסאונד, שולחן החימום, ספסל BSL2 ואספקת O₂ .

תוצאות

עוברים שהוזרקו ב-E7.5 עם hPGK-H2B-GFP lentivirus^11,12 נאספו ב-E13.5 ונבדקו תחת מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי (איור 5A). התמרה מוצלחת של הלוח העצבי גורמת לעוברים עם ביטוי חזק של כתב פלואורסצנטי במוח בעיקר וברקמות אחרות שמקורן באקטודרם, למשל העור (איור 5A,B). הזרקה של נפח גבוה מדי (גדול מהנפחים המומלצים כאן, למשל ≥500 nL) מגבירה את הלחץ בזרם החילופין ויכולה לגרום לספיגה מלאה (נתונים שאינם מוצגים) או לפגמים בתעלה העצבית כגון אקסנצפליה (איור 5A). זריקות מוצלחות ב-E7.5 גורמות להתמרה אחידה מהמוח הקדמי למוח האחורי (איור 5C-J).

titers Lentiviral סביב 2 × 10¹⁰ יחידות זיהומיות (IFU) להשיג מעל 95% מיקוד, בעוד titers של ~1 × 10⁹ IFU להשיג 15% יעילות מיקוד¹⁵. בנוסף, מבנים שבעבר היה קשה לכוון אליהם באמצעות אלקטרופורציה, כגון מקלעת הכורואיד^17,18, הם גם ממוקדים (איור 5 E,F). ניתן לשנות את יעילות ההתמרה על-ידי התאמת הטיטר הנגיפי המועבר ל-AC. זריקות של טיטר נמוך גורמות להתמרה של שיבוטים חד-תאיים (איור 5C, איור 5E ואיור 5G,H) בעוד שהשימוש בנגיף בעל טיטר גבוה מתמר כמעט ב-100% מהמוח כולו (איור 5D, איור 5F, איור 5H ואיור 5J ). לכן, NEPTUNE יכול לשמש להתמרה קלונית, מעקב אחר שושלות וגישות סינון גנטיות או לחקר ההשפעות הגלובליות של ביטוי יתר של גנים או הפחתת ויסות במוח כולו.

התפתחות העין של יונקים היא תוצאה של תקשורת מאורגנת היטב בין שלוש נגזרות של האקטודרם העוברי: הרשתית העצבית (NR) ואפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) נגזרים מהנוירואפיתל של המוח הקדמי הגחוני, בעוד שאקטודרם פני השטח מוליד את העדשה העתידית ואת אפיתל הקרנית. עם זאת, הסטרומה המרכזית והאנדותל האחורי, שתי השכבות האחרות של הקרנית, נגזרות מתאי פסגה עצביים של המזנכימה הפריוקלית^19,20. מקטעים קורונליים דרך עוברי E13.5, שהוזרקו ב-E7.5 עם לנטי-וירוס בעל טיטר גבוה, הראו, בדומה למוח, התמרה גבוהה ואחידה של הרקמה העצבית של העין, כמו גם העדשה, הקרנית והמזנכימה (איור 5K). ככל שהנוירולציה מתקדמת, זריקות ב-E8.5 וב-E9.5 גורמות להמשך ההתמקדות בעדשה ובאפיתל הקרנית (איור 5L ואיור 5N), בעוד שטרנסדוקציה של רקמות העין שמקורן בנוירואקטודרם יעילה פחות ב-E8.5 (איור 5L,M) או לא מכוונת ל-E9.5 (איור 5N).

בעוד שרוב החלקיקים הנגיפיים מדביקים את הרקמות החשופות בעת ההזרקה, חלק מהחלקיקים מתמרים רקמות שמקורן שאינו אקטודרמלי שמתפתחות מאוחר יותר (איור 6A). בלוטות וצינורות הרוק מתפתחים סביב E11.5 מהאפיתל האוראלי²¹ וממוקדים ב-NEPTUNE (איור 6B). לאחר זריקות ב- E9.5, האפיתל הלשוני של הלשון מתמר היטב; עם זאת, המזנכימה הבסיסית היא שלילית (איור 6C; סוגריים מציינים תאים מתמרים; כוכביות מציינות אות אוטופלואורסצנטי ולא תאים מתמרים). בנוסף, ישנם אשכולות חיוביים בתוך האפיתל הלשוני, המופרדים על ידי מקטעים שליליים (איור 6C, ראשי חץ לבנים), מה שמרמז על התמרה של משטח הפפילה. תאי פסגה עצבית תוארו במזנכימה הלשון הבסיסית ובתוך האפיתל הלשוני, שם הם מעורבים בהתפתחות של פפילות טעם ובלוטות טעם²². ואכן, זריקות ב-E7.5 גורמות להתמרה נרחבת של המזנכימה של הלשון ב-E13.5 (איור 6D), מה שמרמז על כך שהזרקות מוקדמות מכוונות לתאי הצמרת העצבית, מה שתורם למזנכימה בלשון.

אצל בעלי חוליות, גרעיני השורש הגבי (DRGs) הם מרכיב מרכזי במערכת העצבים ההיקפית (PNS), שכן כל הקלט הסומטוסנסורי מהפריפריה של הגוף (טמפרטורה, כאב, לחץ) מועבר למוח באמצעות הפעלה של נוירוני DRG²³. גם תאי העצב וגם תאי הגליה של ה-DRG מופקים מתאי הצמרת העצבית²⁴. הזרקת Lentiviral, שבה מקדם ה-hPGK שנמצא בכל מקום שולט בביטוי של הכתב הפלואורסצנטי, מובילה למיקוד נרחב של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית (איור 7A), תוך התמרת תאי עצב ואבות בחוט השדרה (איור 7B), כמו גם של ה-DRG (איור 7C). שימוש ב-MiniPromoter עבור דאבלקורטין²⁵ מאפשר להגביל את ביטוי ה-GFP לתאי עצב בלבד (¹⁵ ואיור 7D,E).

איור 5: יעילות גבוהה או התמרה קלונית עם NEPTUNE. (A) עוברי E13.5 תחת מיקרוסקופ דיסקציה המוארים בתאורה סטנדרטית (פאנל שמאלי) ואותם עוברים מוארים עבור GFP (פאנל ימני). עובר לא מוזרק בקצה השמאלי, עובר מוזרק בהצלחה בקצה הימני, מניב אות חיובי במוח (העובר הימני ביותר). עובר אקסנצפלי עקב נפח עודף מוזרק (עובר אמצעי). (B) מיקוד העור והמוח באמצעות הזרקת E7.5. סרגל קנה מידה = 50 μm. (C, D) E13.5 תמונות קונפוקליות של המוח הקדמי עם התמרה קלונית נמוכה (C) או התמרה ביעילות גבוהה (D). (ג, ה, ז, א) התמרה קלונאלית של אזורים שונים במוח. (ד, ו, ח, י) התמרה ביעילות גבוהה של אזורים שונים במוח. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. יעילות התמרה שונה מייצגת תחומים אחרים של מערכת העצבים המרכזית. (ה, ו) מיקוד מקלעת כורואיד, באופן משובט (E) או ביעילות גבוהה (F). פסי קנה מידה = 200 μm. (G, H) מיקוד קלונאלי (G) ומיקוד ביעילות גבוהה (H) של המוח האחורי, מוגדל ב- (I, J). פסי קנה מידה = 200 μm. (K) ביטוי כתב GFP בעין ב- E13.5 לאחר הזרקת רחם ב- E7.5 (L, M) ביטוי כתב GFP בעין ב- E15.5 לאחר הזרקת רחם ב- E8.5 (L), אזור קופסה מוגדל ב- (M), או ב- E9.5 (N). כלי דם אוטופלואורסצנטיים מסומנים בכוכבים לבנים. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: NEPTUNE = neural plate targeting עם in uteronano-injection; C = קרנית; LE = אפיתל עדשה; LF = סיבי עדשה; M = Mesenchyme; NR = רשתית עצבית; ON = עצב הראייה; RPE = אפיתל פיגמנט רשתית; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; CNS = מערכת העצבים המרכזית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 

איור 6: בהתמרת רחם של רקמות לא עצביות. (A) תמונה קונפוקלית של חלל הפה E15.5. לעובר הוזרק נגיף כתב פלואורסצנטי ב-E9.5. סרגל קנה מידה = 200 μm. (B, C) (B) הגדלה של לוח הכניסה; אפיתל צינור הרוק מומר עם וירוס. (ג) הגדלה של לוח משובץ; אפיתל לשוני גבי מומר עם וירוס כתב GFP (סוגר לבן). המזנכימה הבסיסית שמקורה בתאי הצמרת העצבית היא שלילית. ראשי חץ לבנים מציינים פפילה עם תאי פסגה עצביים שליליים המוקפים בתאי אפיתל מותמרים של וירוסים (תאי דם/כלי דם אוטופלואורסצנטיים מסומנים בכוכבים לבנים). פסי קנה מידה = 50 μm. (D) תמונה סכמטית וקונפוקלית של מזנכימה של לשון E13.5 לאחר זריקות עם וירוס מדווח פלואורסצנטי ב- E7.5. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: D = דורסל; M = Mesenchyme; N = Nasopharynx; SLD = צינור תת-לשוני; SMD = צינור תת-מנדיבולרי; T = לשון; V = גחון; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: התמרה של תאי גנגליון שורש גביים שמקורם בצמרת עצבית. (A) מיקוד NEPTUNE ב-E7.5 מאפשר מיקוד הן של מערכת העצבים המרכזית והן של PNS. (B) תמונה קונפוקלית של חוט השדרה E13.5 ו-DRGs המוזרקים עם hPGK-H2B-GFP כתב lentivirus ב-E7.5 מראה התמרה של שני אבות עצביים SOX2+ ונוירונים NeuN⁺. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) אזור בקופסה של B המציג את ה-DRG עם ביטוי GFP באוכלוסיות התאים SOX2+ (חצים לבנים) ו-NeuN⁺ (ראשי חץ לבנים). סרגל קנה מידה = 20 μm. (D) תמונה קונפוקלית של חוט השדרה E13.5 ו- DRG מוזרק עם DCX-H2B-GFP lentivirus ב- E7.5, המכוון לתאי ^DCX+ בלבד. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) אזור בקופסה של D המציג DRG עם ביטוי GFP המוגבל לנוירוני DCX⁺ (ראשי חץ לבנים). DCX^- תאים שליליים עבור GFP (חצים לבנים). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: NEPTUNE = neural plate targeting עם in utero nano-injection; CNS = מערכת העצבים המרכזית; PNS = מערכת העצבים ההיקפית; DRGs = גרעיני שורש הגב; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

ישנם מספר שלבים בפרוטוקול זה המשפיעים על ההישרדות העוברית, על איכות הזריקות ועל הקריאה. גיל ההיריון של העוברים מוגדר כ- E0.5 בצהרי היום של תקע הנרתיק לאחר הזדווגות לילה. ביצוע בדיקת אולטרסאונד להריון ב- E6.5 בשעות אחר הצהריים המאוחרות / ערב מבטיח כי העוברים מפותחים מספיק כדי להיות מזוהים על ידי אולטרסאונד. הבדיקה (1) מאפשרת סינון מראש של מספר העכברים החיוביים לתקע בהריון, (2) מוודאת שאף וירוס לא מופשר שלא לצורך ומבוזבז במקרה שעכברות בעלות תוסף חיובי אינן בהריון, ו-(3) מפחיתה התערבויות מיותרות בעכברים (נמנעת מניתוח בנקבות שאינן בהריון).

ב- E7.5, העוברים רגישים לכוחות חיצוניים ויש לטפל בהם בזהירות. לדוגמה, משיכת קרני הרחם או סחיטת ה- deciduas יכולים להוביל לספיגת עוברים. רקמת הרחם צריכה תמיד להישמר לחה כאשר מחוץ לבטן הנשית כדי למנוע את התייבשות הרקמה. רוב המחליטים צריכים להישאר בתוך הבטן הנשית, כאשר רק 3-4 חשופים לזריקות. חדות המחט היא גורם מכריע נוסף להזרקות מוצלחות. קצות מחט קהים או שבורים גורמים לניקוב חוזר ונשנה של deciduas או דחיסה כנגד חימר המידול לפני הכניסה ל- AC, מה שעלול להגביר את קצב הספיגה. לכן, מחטים טחונות היטב וחדות תמיד צריך להיות מאוחסן בבטחה ולהחליף לאחר מקסימום של 2 נקבות.

פרוטוקול זה מתאר כיצד למקד את הצלחת העצבית בזריקה אחת בודדת של לנטי-וירוס. יתר על כן, הוא מראה כיצד ניתן להתאים את יעילות ההתמרה משיבוטים חד-תאיים למוח כולו. עם זאת, רקמות אחרות שאינן עצביות, כולל העור ואפיתל הפה, ממוקדות גם כן. בנוסף, כל סוגי התאים (אבות ותאים ממוינים) מתמרים, מה שהופך גישה זו ליעילה אך לא ספציפית. השימוש ב- MiniPromoters במבנה הנגיפי מוביל לביטוי הספציפי של הטרנסגן בנוירונים או באסטרוציטים¹⁵. יש לכך יתרון בכך שהוא נמנע משימוש בחיות Cre מהונדסות ייעודיות ולכן מקטין את כמות העבודה (תחזוקת זנים וגנוטיפ) ואת העלויות.

המגבלות של NEPTUNE כוללות את הקושי הטכני שלה, אתגרים בהשגת נשים הרות בקצב צפוי ועקבי, ואת העלויות של רכישת מכשור מיוחד. יתר על כן, ניתן לראות במיקוד לא סלקטיבי של תאים על ידי lentivirus גם יתרון וגם מגבלה של הטכניקה. הזרקה של נפחים גדולים יותר לתוך AC גורמת exencephaly¹³, אם כי מומים במוח exencephaly נמנעים עם כרכים המתוארים כאן¹⁵. השפעה שלילית על התפתחות המוח היא אפוא סיכון עם ננו-זריקות ברחם שיש להימנע מהן בזהירות על ידי הזרקת נפחים נכונים המותאמים לשלב העוברי ולגודל AC.

התאמות עתידיות של הטכניקה עשויות להתמקד בטרופיזם ויראלי. לנגיפים הקשורים לאדנו (AAVs) יש סרוטיפים שונים, שהוכחו כמכוונים בחוזקה לסוגי תאים שונים במערכת העצבים המרכזית^17,26. עם זאת, AAVs אינם משתלבים בגנום התא המארח ולכן עלולים ללכת לאיבוד בתאים עם קצב חלוקה גבוה. למרות שישנן מספר דרכים להגדיל את הספציפיות של NEPTUNE, בעלי חיים מהונדסים הם עדיין תקן הזהב כשמדובר מניפולציה גנים in vivo. עכברי Cas9 ו-lentivirus המקודדים ל-sgRNA שימשו לבדיקה גנטית באפידרמיס העוברי²⁷ ועשויים להיות מותאמים גם למערכת העצבים המרכזית המתפתחת.

זריקות ל-AC ב-E7.5 מכוונות ביעילות לתאים של הנוירואקטודרם לפני תחילת הנוירולציה ומכוונות למוח המתפתח בצורה יעילה יותר מאשר באלקטרופורציה של הרחם . זה מאפשר לחקור רמזים גנטיים החשובים להתפתחות המוח מנקודת זמן מוקדמת יותר. בניגוד למודלים גנטיים קלאסיים של עכברים, NEPTUNE מציעה גישה גמישה לביצוע ניתוח גנים פונקציונלי. פנוטיפים בעקבות ביטוי יתר או מחיקת גנים ניתן לחקור תוך ימים עד שבועות בהשוואה לחודשים או שנים. זריקות של מבנים נגיפיים מרובים מאפשרות מניפולציה של מספר גנים בתוך עובר אחד ומונעות יצירת חיות נוקאאוט כפולות או משולשות. לכן, NEPTUNE לא רק חוסך זמן אלא גם יכול להפחית את מספר בעלי החיים המשמשים במחקר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD Bioscience	309628
27 G Needle	BD Bioscience	300635
3.5 inches capillaries	Drummond Scientific	3000203G/X	Were used to pull in house needles
70 MHz MS Series transducer	Visual Sonics	MS700
Aquasonic clear ultrasound gel	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 mice	Charles River, Germany	Crl:CD1(ICR)	Females: from age of 8 weeks old Males: from the age of 12 weeks old
Cotton Swab	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Dressing forceps delicate straight 13 cm	Agnthos	08-032-130
EG-400 Narishige Micropipette Grinder	Narishige	NA
EZ clips 9 mm	Angthos	59027	clips
Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm	Agnthos	307-336-090
Isofluorane	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	Purchased from Swedish Pharmacy
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Membrane Tape	Visual Sonics	SA-11053
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Modeling Clay	Sense AB	10209
Mouse Handling Table	Visual Sonics	50249
Nanoject II Auto Injector Kit	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
Petri dish with central opening (low wall)	Visual Sonics	SA-11620
Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	130000132037	disinfectant
Silicone membrane	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, hot bead sterilizer	Angthos	31100
Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Imaging Station 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament	Agnthos	J384H