JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כדי להשיג חרק אקסני, משטח הביצה שלו מעוקר, והזחל הבוקע גדל לאחר מכן באמצעות עלים אקסניים. שיטה זו מספקת דרך יעילה להכנת חרקים אקסניים מבלי לתת אנטיביוטיקה או לפתח תזונה מלאכותית, אשר ניתן ליישם גם על חרקים אוכלי עלים אחרים.

Abstract

מעיים של חרקים מיושבים על ידי חיידקים מגוונים שיכולים להשפיע באופן עמוק על התכונות הפיזיולוגיות של הפונדקאי. החדרת זן חיידקי מסוים לחרק אקסני היא שיטה רבת עוצמה לאימות תפקוד המיקרוביאלי של המעיים ולהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין חיידקי המעיים לפונדקאי. מתן אנטיביוטיקה או עיקור משטחי ביצים הן שתי שיטות נפוצות להסרת חיידקי מעיים מחרקים. עם זאת, בנוסף להשפעות השליליות הפוטנציאליות של אנטיביוטיקה על חרקים, מחקרים קודמים הצביעו על כך שהאכלת אנטיביוטיקה לא יכולה לחסל את חיידקי המעיים. לפיכך, דיאטות מלאכותיות ללא חיידקים משמשות בדרך כלל לשמירה על חרקים אקסניים, שהוא תהליך מייגע ועתיר עבודה שאינו יכול להידמות באופן מלא למרכיבים תזונתיים במזון טבעי. מתואר כאן פרוטוקול יעיל ופשוט להכנה ותחזוקה של זחלים אקסניים של חיפושית עלים (Plagiodera versicolora). באופן ספציפי, משטחים של ביצי החיפושית עוקרו, ולאחר מכן עלי צפצפה נטולי חיידקים שימשו לגידול זחלים אקסניים. מעמדם האקסני של החרקים אושש עוד יותר באמצעות מבחנים תלויי תרבות ובלתי תלויי תרבות. באופן קולקטיבי, על ידי שילוב של חיטוי ביצים וטיפוח ללא חיידקים, פותחה שיטה יעילה ונוחה להשגת P. versicolora אקסני, המספקת כלי הניתן להעברה בקלות לחרקים אוכלי עלים אחרים.

Introduction

בדומה ליונקים, מערכת העיכול של החרקים היא חלל לעיכול המזון ולספיגתו. רוב החרקים מכילים חיידקים קומנסליים מגוונים שמשגשגים במעיים שלהם וחיים על תזונה המסופקת על ידי פונדקאים1. לקהילת המעיים יש השפעה עמוקה על תהליכים פיזיולוגיים מרובים בחרקים, כולל עיכול מזון וניקוי רעלים 2,3,4, תזונה והתפתחות 5,6,7, הגנה מפני פתוגנים וטפילים 8,9,10,11, תקשורת כימית 12,13 והתנהגויות14 ,15. באופן מסקרן, מיקרוביוטה מסוימת של המעיים יכולה להיות פתוגנית מבחינה פקולטטיבית או להיות מתומרנת על ידי פלישה לפתוגנים כדי להחמיר את הזיהום, מה שמצביע על כך שחיידקי המעיים עלולים להזיק במקרים מסוימיםל-16,17,18. חיידקי המעיים יכולים גם לשמש משאב מיקרוביאלי ליישומים ביוטכניים ולהדברת מזיקים. לדוגמה, חיידקים מעכלי ליגנוצלולוז מחרקים פיטופגוסים וקסילופגוסים שימשו לעיכול תאים צמחיים לפיתוח דלקים ביולוגיים19. פיזורם של סימביונטים מהונדסים במעיים המבטאים מולקולות ביו-אקטיביות הוא טקטיקה חדשנית ומבטיחה לניהול מזיקים חקלאיים וייעוריים ויתושים המשדרים מחלות זיהומיות 19,20,21, שניתן להשתמש בהן גם כדי לשפר את כושרם של חרקים מועילים 22. המחשת האופן שבו חיידק מעיים מתנהג ב-in vivo נחשבת אפוא לעדיפות למנף את תפקודו באופן מלא ולנצל אותו עוד יותר ליישומים שונים.

בעלי חיים יכולים להכיל 1 עד >1000 מינים מיקרוביאליים סימביוטיים במעיים1. כתוצאה מכך, קשה לאמת במדויק כיצד טקסונים חיידקיים בודדים או הרכבתם מתפקדים בתוך בעל חיים, והאם הפונדקאי או שותפיו המיקרוביאליים מניעים פונקציה מסוימת. לכן, הכנת זחלים אקסניים להשגת חרקים גנוטוביוטים על ידי התיישבות חד-מינית או מרובת מינים נחוצה כדי לחקור את תפקוד החיידקים ואת האינטראקציה עם חרקים23. כיום, מתן קוקטיילים אנטיביוטיים ועיקור פני השטח של ביצי חרקים הן שיטות נפוצות להסרת חיידקי המעיים 14,24,25,26. עם זאת, דיאטות אנטיביוטיות אינן יכולות לחסל לחלוטין את חיידקי המעיים ולהשפיע לרעה על הפיזיולוגיה של החרקים המארחים27,28. כתוצאה מכך, השימוש בחרקים שטופלו באנטיביוטיקה עלול לטשטש את היכולות האמיתיות של חלק מחיידקי המעיים. למרבה המזל, עיקור פני השטח של ביצים יכול לשלול את הבעיה הזו23,29, שאין לה השפעות או זניחות על חרקים ניסיוניים. יתר על כן, תזונה מלאכותית אינה יכולה להידמות באופן מלא למזון חרקים טבעי, ופיתוח תזונה מלאכותית הוא תהליך יקר וצורך עבודה30,31.

חיפושית עלי הערבה, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), היא מזיקה אוכלת עלים נפוצה הניזונה בעיקר מעצים סלעיים, כגון ערבות (Salix) וצפצפה (Populus L.) 32,33. כאן, חיפושית עלי הערבה שימשה כחרק אוכל עלים מייצג כדי לפתח פרוטוקול להכנה וגידול של חרק ללא חיידקים. ניצלנו את תרבית הרקמה הצמחית כדי להשיג עלי צפצפה נטולי חיידקים כדי לגדל זחלים אקסניים מסוג P. versicolora מביצים מעוקרות. הסטטוס האקסני של זחלי P. versicolora אומת באמצעות מבחנים תלויי תרבות ובלתי תלויי תרבות. פרוטוקול זה יכול לשמור על חרקים אקסניים המחקים טוב יותר את המצב הפראי מאשר גידול חרקים עם תזונה מלאכותית. חשוב מכך, שיטה זו נוחה בעלות נמוכה מאוד, מה שמגדיל את ההיתכנות של השגת חרקים אקסניים למחקרי אינטראקציה עתידיים בין חרקים למעי מיקרוביוטה, במיוחד עבור חרקים שאינם מודלים ללא תזונה מלאכותית מפותחת היטב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. גידול חרקים

  1. שמור על אוכלוסיית P. versicolora בתא גידול במצב של 27 ° C ו 70 ± 5% לחות יחסית עם photoperiod של 16 שעות בהיר / 8 שעות כהה. מניחים אותם בקופסאות פלסטיק מחוררות עם נייר סופג רטוב מרוצף אריחים ומזינים אותם בענפי צפצפה טריים. מרססים מים נקיים על נייר סופג כדי לשמור על הלחות ולהחליף את הענפים כל יומיים.
  2. לבודד מבוגרים עבור oviposition לאחר הגור. האכילו אותם בעלים רכים כדי להשיג יותר ביצים.
  3. אספו ביצים שהוטלו לאחרונה (תוך 24 שעות). מניחים את הביצים על נייר סופג לח במשך 60 שעות כדי להכין זחלים אקסניים.
    הערה: ביצים שהוטלו לאחרונה יבקעו לאחר ~ 72 שעות. הזמן הטוב ביותר לעקר משטחי ביצים הוא יום לפני הבקיעה; אחרת, מספר הביצים שבקעו בהצלחה יקטן.

2. תרבות צפצפה ללא חיידקים

  1. הכן תמיסות מלאי בינוניות של Murashige ו-Skoog (MS) ו-1 מ"ג/מ"ל α-נפטלין חומצה אצטית (NAA) (ראו טבלת החומרים).
  2. במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית, מוסיפים 50 μL של תמיסת NAA של 1 מ"ג/מ"ל ל-500 מ"ל ל-500 מ"ל של מדיום טרשת נפוצה, מנערים כדי לערבב היטב, ויוצקים כ-50 מ"ל לכל מיכל תרבית רקמה ומחכים להתמצקות.
  3. להכין אזמלים, מנורת אלכוהול ומלקחיים; לעקר את האזמלים והמלקחיים בלהבת מנורת האלכוהול במכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית.
  4. חותכים מקטעי גזע בקוטר 3-4 ס"מ עם ניצני אפיקל או ניצנים לרוחב משתילי צפצפה בצמיחה של כחודש אחד (שתילים בתרבית רקמה ללא נבט), ומכניסים אותם למדיום התרבית, מקטע גזע אחד או שניים לכל מיכל.
  5. דגירה של מקטעי גזע אלה בתא צמיחה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-50 ± 10 cd עוצמת אור עם פוטופריוד של 16 שעות אור/8 שעות חושך למשך כ-30 יום. השתמשו בעלים נטולי הנבטים כדי להזין את הזחלים האקסניים.

3. עיקור פני הביצה וגידול זחלים אקסניים

  1. כלי פטרי אוטוקלאב, מכחולים, נייר פילטר, מים מזוקקים וצלחת פטרי המכילה מדיום אגר LB (לוריא-ברטאני).
  2. מניחים עלים עם ביצים דביקות בצלחת פטרי, מסירים בזהירות את הביצים מהעלים באמצעות מלקחיים, ומעבירים אותם לצלחת פטרי אחרת.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע בזהירות רבה מכיוון שהביצים דבקות בעלים.
  3. לשטוף את הביצים האלה עם 75% אתנול במשך 8 דקות, ולחזור על לשטוף ארבע פעמים עם מים סטריליים.
  4. מעבירים את הביצים למדיום אגר LB כדי לשמר את הלחות לבקיעה.
    הערה: שימוש במדיום אגר LB יכול לעזור לוודא אם הביצה המחויטת נקייה מחיידקים.
  5. מניחים את צלחת הפטרי בתא גידול ומחכים שהביצים יבקעו תוך 24 שעות.
  6. במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית, מרצפים שלוש פיסות נייר מסנן רטוב בצלחת פטרי, מניחים עלי צפצפה נטולי חיידקים על הנייר, אוספים את הזחלים ומניחים אותם על העלים, אוטמים את צלחת הפטרי בפרפילם, ודוגרים אותם בתא צמיחה בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ו-70 ± 5% לחות יחסית עם פוטופריוד של 16 שעות אור/8 שעות כהה.
    הערה: העלים מתרבית הרקמה עדינים ועלולים לאבד מים במהירות. לכן, שימוש בנייר מסנן לח הוא הכרחי בעת העברת העלים לצלחת פטרי.
  7. החליפו את העלים כל יומיים.
  8. עבור הקבוצות שגודלו באופן קונבנציונלי, מעבירים את הביצים מהעלים לצלחת פטרי המכילה נייר סינון לח ומאכילים את הזחלים האלה בעלי צפצפה נטולי חיידקים.

4. אימות של זחלים אקסניים באמצעות מבחנים תלויי תרבות

  1. בחרו באופן אקראי שלושה זחלי 1st, 2nd ו-3rd instar מתוך הקבוצות נטולות הנבטים והמגודלות באופן קונבנציונלי.
  2. נתחו את הזחליםה-3 עם מספריים ומלקחיים סטריליים מתחת לסטריאומיקרוסקופ ואספו את המעיים שלהם בצינורות מיקרו-סנטריפוג'. לאסוף שלם 1st ו 2nd instar זחלים בצינורות.
    הערה: אסוף זחלים שלמים של 1st ו-2 nd nd instar מכיוון שהם קטנים מכדי לנתח אותם, ולשמור על המעיים שלהם שלמים.
  3. הוסיפו 100 μL של מי מלח עם מאגר פוספט ושלושה כדורי פלדה לצינורות של 1.5 מ"ל וטוחנים את הרקמות להומוגנטים באמצעות הומוגנייזר מכה חרוזים.
  4. הוסיפו 100 μL של הומוגנט למדיום אגר LB וצלחת באמצעות מוט התפשטות זכוכית סטרילי.
  5. הניחו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות והתבוננו במושבות החיידקים.

5. אימות של אנשים אקסניים עם מבחנים שאינם תלויים בתרבות

  1. מחלצים את סך הדנ"א של הרקמות (המתקבל בסעיף 4) באמצעות ערכת מיצוי DNA.
  2. מדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר ב-260 ננומטר.
  3. הגבר את הגן החיידקי 16S rRNA באמצעות פריימרים אוניברסליים של 16S rRNA עם PCR. הגדר את מערכת התגובה עם 18 μL של תערובת מאסטר PCR של 1.1x (ראה טבלת החומרים), 0.5 μL של פריימר 27F (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0.5 μL של פריימר 1495R (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') ודנ"א של תבנית 100 ng. הגדר את תנאי ה- PCR ב- 95 ° C למשך 3 דקות; 28 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס לדקה אחת, ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; ואחריו 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אחסן את מוצרי ה-PCR בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.
  4. מערבבים את מוצרי ה-PCR עם צבע חומצת גרעין ומנתחים אותם באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1% ב-1x TAE buffer. השתמש ב- 10 μL של סמן DNA כאסמכתא.
  5. שימו לב לג'ל עם טרנסילומינטור UV וחפשו את שבר המטרה בסביבות 1,500 bp.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שלבי החיים של P. versicolora מוצגים באיור 1. הזכר הבוגר קטן יותר מהנקבה הבוגרת (איור 1A). בשדה, החיפושית מקבצת את ביציה על עלה; כאן, ארבע ביצים נותקו מעלה (איור 1B). מקטעי גזע הצפצפה והשתילים המשמשים לגידול חרקים אקסניים מוצגים באיור 2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הכנת זחלים נטולי חיידקים והשגת זחלים גנוטוביוטים על ידי הכנסה מחדש של זני חיידקים ספציפיים הן שיטות רבות עוצמה להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין פונדקאי למיקרובים. זחלים שזה עתה בקעו משיגים מיקרוביוטה של המעיים בשתי דרכים עיקריות: העברה אנכית מהאם לצאצאים או רכישה אופקית ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31971663) ותוכנית החסות למדעני עילית צעירים על ידי CAST (2020QNRC001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm syringe filtersMilliporeSLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solutiona. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water).
b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water.
c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubesSangon BiotechF600620
10x PBS stock solutionBiosharp Life SciencesBL302A
2 M KOH solutionDissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakersShubosb16455
50 mL sterile syringesJintaJT0125789
500 mL measuring cylinderShubosb1601
50x TAE stock solutiona. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water.
b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL.
d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanolXingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA)Solarbio Life Sciences86-87-3
Absorbing paper22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
AgarCoolaber9002-18-0
AgaroseBiowest111860
AutoclavePanasonicMLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizerJing XinXM-GTL64
DNA extraction kitMP Biomedicals116560200
EDTASaiguo Biotech1340
Filter paperJiaojie70 mm diameter
Gel electrophoresis unitBio-rad164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dyeTsingKeTSJ003
Germ-free poplar seedlingsShan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×)TsingKeTSE101
Growth chamberRuihuaHP400GS-C
LB agar mediuma. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water.
b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar.
c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifugeDRAGONLABD1008
MS basic mediumCoolaberPM1121-50LM0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culturea. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water.
b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL.
d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometerThermo Fisher Scientific
Paintbrush1 cm width, used to collect the eggs
ParafilmBemisPM-996
PCR Thermal CyclersEppendorf6331000076
Petri dishesSupin90 mm diameter
pH meterMETTLER TOLEDOFE20
Pipettes 0.2-2 µLGilsonECS000699
Pipettes 100-1,000 µLEppendorf3120000267
Pipettes 20-200 µLEppendorf3120000259
Pipettes 2-20 µLEppendorf3120000232
Plant tissue culture containerChembaseZP21240 mL
Plastic box2.35 L
Potassium hydroxide (KOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA geneSangon Biotech27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls0.25 mmused to grind tissues
StereomicroscopeOLYMPUSSZ61
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA markerTransgene BiotechBM121-01
Tris baseBiosharp Life Sciences1115
TryptoneThermo Fisher Scientific LP0037
UV transilluminatorMonad BiotechQuickGel 6100
VortexerScilogexMX-S
Willow branchesSha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetleHuazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extractThermo Fisher ScientificLP0021

References

  1. Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
  2. Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
  3. Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
  4. Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
  5. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  6. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
  7. Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838(2014).
  8. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  9. Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
  10. Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
  11. Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
  12. Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851(2000).
  13. Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
  14. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  15. Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698(2021).
  16. Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
  17. Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98(2021).
  18. Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
  19. Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
  20. Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202(2016).
  21. Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
  22. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  23. Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52(2018).
  24. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  25. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464(2018).
  26. Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942(2021).
  27. Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
  28. Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
  29. Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456(2019).
  30. Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7(2001).
  31. Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
  32. Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
  33. Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
  34. Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
  35. Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352(2020).
  36. Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011(2016).
  37. Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212(2019).
  38. Meilan, R., Ma, C. Poplar (Populus spp.). Methods in Molecular Biology. 344, Clifton, N.J. 143-151 (2006).
  39. Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
  40. Grout, B. W. Meristem-tip culture. Methods in Molecular Biology. 6, Clifton, N.J. 81-91 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved