פרוטוקולים אופטימליים לדגימת עצם לשליפת דנ"א עתיק משרידים ארכיאולוגיים

Summary

הפרוטוקול מציג סדרה של פרוטוקולים של שיטות עבודה מומלצות לאיסוף אבקת עצם משמונה מיקומי דגימה אנטומיים מומלצים (מיקומים ספציפיים על אלמנט שלד נתון) על פני חמישה יסודות שלד שונים מאנשים מימי הביניים (רדיוקרבון המתוארך לתקופה של 1040-1400 לסה"נ בקירוב, טווח 2-סיגמא מכויל).

Abstract

השיטות המוצגות כאן מבקשות למקסם את הסיכויים לשחזור דנ"א אנושי משרידים ארכיאולוגיים עתיקים תוך הגבלת חומר דגימת הקלט. זה נעשה על ידי התמקדות במיקומי דגימה אנטומיים שנקבעו בעבר כמניבים את הכמויות הגבוהות ביותר של דנ"א עתיק (aDNA) בניתוח השוואתי של התאוששות הדנ"א על פני השלד. מחקרים קודמים הציעו כי פרוטוקולים אלה ממקסמים את הסיכויים להתאוששות מוצלחת של דנ"א אנושי ופתוגני עתיק משרידים ארכיאולוגיים. תפוקת הדנ"א הוערכה בעבר על ידי Parker et al. 2020 בסקירה רחבה של שימור aDNA על פני מספר אלמנטים שלדיים מ-11 פרטים שהתאוששו מימי הביניים (רדיוקרבון המתוארך לתקופה של סביבות (בערך) 1040-1400 לספירה, מכויל רכס 2-סיגמא) בית קברות בקרקאואר ברג, יישוב נטוש מימי הביניים ליד Peißen גרמניה. שמונת כתמי הדגימה הללו, המשתרעים על פני חמישה יסודות שלדיים (pars petrosa, טוחנות קבועות, חוליית חזה, פלנקס דיסטלי וטאלוס) הניבו בהצלחה דנ"א אנושי עתיק באיכות גבוהה, שבו היבולים היו גדולים משמעותית מהממוצע הכללי בכל האלמנטים והפרטים. התשואות היו מספיקות לשימוש ברוב הניתוחים הגנטיים הנפוצים של אוכלוסיות במורד הזרם. התוצאות שלנו תומכות בשימוש מועדף במיקומי דגימה אנטומיים אלה עבור רוב המחקרים הכוללים ניתוח של דנ"א אנושי עתיק משרידים ארכיאולוגיים. יישום שיטות אלה יסייע למזער את ההרס של דגימות ארכיאולוגיות יקרות.

Introduction

הדגימה של שרידי אדם קדומים לצורך שחזור וניתוח דנ"א היא^הרסנית מטבעה 1,2,3,4. הדגימות עצמן הן דגימות יקרות ויש לשמר את השימור המורפולוגי במידת האפשר. ככזה, חובה לייעל את שיטות הדגימה הן כדי למנוע השמדה מיותרת של חומר שאין לו תחליף והן כדי למקסם את ההסתברות להצלחה. טכניקות התרגול המומלצות הנוכחיות מבוססות על קבוצה קטנה של מחקרים המוגבלים לסקרים פורנזיים^5,6, מחקרים על דגימות עתיקות שבהן פיתוח דגימה אופטימלית אינו המטרה הישירה של המחקר⁷, או מחקרים ייעודיים המשתמשים בשרידים שאינם אנושיים⁸ או מכוונים למבחר קטן מאוד של מיקומי דגימה אנטומיים (המשמשים כאן לציון אזור מסוים של אלמנט שלד שממנו אבקת עצם, לשימוש בניתוחי דנ"א במורד הזרם, נוצר)^9,10. פרוטוקולי הדגימה המוצגים כאן עברו אופטימיזציה במחקר השיטתי הראשון בקנה מידה גדול של שימור דנ"א על פני מספר אלמנטים שלדיים ממספר פרטים¹¹. כל הדגימות נבעו מיסודות שלד שנמצאו מ-11 פרטים שנחפרו מבית הקברות הכנסייתי של היישוב הנטוש מימי הביניים קראקאואר ברג ליד פייסן, סקסוניה-אנהלט, גרמניה (ראו טבלה 1 לדמוגרפיה מפורטת של דגימות), ולכן ייתכן שיהיה צורך בשינוי לשימוש בדגימות מחוץ לטווח גיאוגרפי/זמני זה.

בודדים	מין	גיל משוער במוות	14 C תאריכים (לספירה, קאל 2-סיגמא)
KRA001	זכר	25-35	1058-1219
KRA002	נקבה	20-22	1227-1283
KRA003	זכר	25	1059-1223
KRA004	זכר	15	1284-1392
KRA005	זכר	10-12	1170-1258
KRA006	נקבה	30-40	1218-1266
KRA007	נקבה	25-30	1167-1251
KRA008	זכר	20	1301-1402
KRA009	זכר	ידוע	1158-1254
KRA010	זכר	25	1276-1383
KRA011	נקבה	30-45	1040-1159

טבלה 1: מין שנקבע גנטית, גיל משוער שנקבע ארכיאולוגית במוות, ותיארוך רדיוקרבוני (¹⁴C Cal 2-sigma) עבור כל 11 הפרטים שנדגמו. טבלה זו הותאמה מתוך Parker, C. et al. 2020¹¹.

פרוטוקולים אלה מאפשרים ייצור פשוט ויעיל יחסית של אבקת עצם משמונה אתרי דגימה אנטומיים על פני חמישה אלמנטים שלדיים (כולל pars petrosa) עם זיהום DNA מוגבל המושרה במעבדה. מתוך חמשת יסודות השלד הללו, שבעה מקומות דגימה אנטומיים שנמצאו על ארבעה יסודות שלד נקבעו כחלופות בנות קיימא לדגימה ההרסנית של הפירמידה הפטרולית^11,12. אלה כוללים את הצמנטום, הדנטין ותא העיסה של טוחנות קבועות; עצם קליפת המוח נאספה מחריץ החוליות העליון וכן מגוף חוליות החזה; עצם קליפת המוח הנובעת מפני השטח הנחותים של הפלנגות האפיקליות והפיר של הפלנגות הדיסטליות; והעצם הקורטיקלית הצפופה לאורך החלק החיצוני של הטלי. בעוד שישנן מספר שיטות המיושמות באופן נרחב לדגימת pars petrosa 4,12,13,14, דנטין, ותא מוך השן^1,2,15, שיטות שפורסמו המתארות את הדור המוצלח של אבקת עצם מן הצמנטום ¹⁶ גוף חוליה, חריץ חוליות נחות וטלוס יכולים להיות קשים להשגה., ככזה, כאן אנו מדגימים פרוטוקולי דגימה אופטימליים עבור פירמידת פטרוס (שלב 3.1); צמנטום (שלב 3.2.1), דנטין (שלב 3.2.2) ומוך השן (שלב 3.2.3) של טוחנות בוגרות; עצם קליפת המוח של גוף החוליה (שלב 3.3.1) וקשת החוליות העליונה (שלב 3.3.2); הפלנקס הדיסטלי (שלב 3.4); והטאלוס (שלב 3.5) על מנת להפוך את השימוש היעיל באלמנטים שלדיים אלה הן עבור aDNA והן עבור מחקר פורנזי לנגיש יותר.

Protocol

כל המחקרים המוצגים כאן בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי מכון מקס פלנק למדע ההיסטוריה האנושית, יינה, גרמניה לעבודה עם שרידי אדם עתיקים. לפני ביצוע שלבים כלשהם של פרוטוקול זה, הקפד לדבוק בכל הדרישות האתיות המקומיות/מדינתיות/פדרליות הנוגעות הן לקבלת אישור למחקר מדעי והן לשימוש בשרידי אדם לדגימה הרסנית באזורך. כל ההליכים/אחסון כימיקלים צריכים להתבצע על פי הנחיות בטיחות מוסדיות פרטניות.

1. שיקולים לפני עיבוד המדגם

1. התייחסו לדגימות בזהירות מכיוון ששרידים עתיקים הם משאב בלתי ניתן לערעור וסופי (למשל, הדגימה צריכה להיות בזבזנית ככל האפשר, וכל השרידים מוחזרים לספקים המתאימים והחוקיים שלהם במידת האפשר).
2. בצע את כל השלבים בסביבה של חדר נקי, רצוי במתקן DNA עתיק ייעודי^17,18,19. השתמש בציוד מגן אישי (PPE) המורכב מכיסויים מיקרו-נקבוביים סטריליים עם מכסה מנוע, כפפות סטריליות (שני זוגות), מסכה כירורגית, משקפי מגן ומגפיים סטריליים או נעליים מונעות החלקה עם כיסויים סטריליים (ראה טבלת חומרים). החלף כפפות לעתים קרובות, במיוחד בין דגימות.
3. נקו וחטאו היטב את כל הציוד והמשטחים באמצעות תמיסת הלבנה/פירוק DNA/אתנול וקרינת UV (אורך גל: 254 ננומטר) במידת האפשר (למשל, מקדחים, מקדחות, יציצים/מלחציים וכו'). לבסוף, מומלץ מאוד לקחת הפסקות ארגונומיות קבועות (כל 2-3 שעות אם אפשר) כדי למנוע תשישות יתר עקב סביבת החדר הנקי.
   הערה: כל שרידי השלד צריכים להיות מתועדים כראוי (למשל, מצולמים, נשקלים, ובמידת האפשר נסרקים במיקרו-CT, מצולמים בתלת-ממד וכו') לפני הדגימה (פרוטוקולים לתיעוד מתאים אינם מכוסים בכתב יד זה). ניתן להשהות את כל פרוטוקולי הדגימה בין איטרציות הדגימה וניתן לאחסן את הדגימות ללא הגבלת זמן בסביבה יבשה ומבוקרת טמפרטורה (25 מעלות צלזיוס), סטרילית.

2. טיפול מקדים

1. נטרל את כל מיקומי הדגימה האנטומיים לפני יצירת אבקת עצם כדי למזער את הסיכון לזיהום¹⁸.
   הערה: היעילות של הסרת אקונומיקה ו/או פני שטח (ראה הערה בשלב 3.3.2 עבור שלבי הסרת פני השטח) עבור טיהור דגימות היא עדיין נושא לוויכוח בקרב חוקרי aDNA 8,19,20,21,22,23,24,25 מכיוון ששניהם עשויים להשפיע על תשואות הדנ"א הכוללות^, במיוחד בדגימות מושפלות מאוד. לפיכך, השלבים הבאים נחשבים אופציונליים ונכללים כאן מכיוון שהם שימשו בכל הדגימות כדי להפיק את התוצאות המייצגות המוצגות במאמר זה. מומלץ שהשימוש בפרוטוקולים אלה לפני הטיפול ייקבע על בסיס כל מקרה לגופו בהתבסס על היישום המולקולרי, הגיל, הנדירות ורמת ההשפלה המורפולוגית של כל קבוצת דגימות.
   1. בצע את כל הדגימות בחדר ייעודי ונקי תחת מכסה מנוע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) המצויד באור UV או ארון בטיחות ביולוגית עם זרימת אוויר כבויה. פזרו רדיד אלומיניום סטרילי על פני הספסל כדי לתפוס אבקת/שברי עצם תועים.
   2. ודא שכל שברי העצם משוחזרים (להחזרה) לפני סילוק נייר הכסף. שנה את נייר הכסף בין הטיפול של כל אלמנט שלד. יש להשליך רדיד אלומיניום משומש בשקית/כלי קיבול ביולוגי הניתן לעיבוד אוטומטי.
   3. הסירו כמה שיותר לכלוך/מזיק רופף ממקומות דגימה אנטומיים על ידי ניגוב עדין של האזור באמצעות מגבון סטרילי יבש ללא מוך (ראו טבלת חומרים). השליכו את המגבונים לשקיות ביו-האזרד או כלי קיבול אוטומטיים.
   4. יש לפרק את המשטח הנקי על ידי ניגוב במגבון סטרילי רטוב באקונומיקה מסחרית מדוללת (~0.01% v/v, מדולל במים נטולי DNase/RNase אולטרה-טהורים) ולאפשר לדגור במשך 5 דקות. השליכו את המגבונים לשקיות ביו-האזרד או כלי קיבול אוטומטיים.
      אזהרה: אקונומיקה היא כימיקל קורוזיבי ותגובתי ביותר; מכאן שיש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים לפני השימוש בו.
   5. הסירו כמה שיותר שאריות אקונומיקה ממקום הדגימה האנטומי בעזרת מגבון סטרילי עם מים נטולי DNase/RNase אולטרה-טהורים. השליכו את המגבונים לשקיות ביו-האזרד או כלי קיבול אוטומטיים.
   6. יש לחשוף את כל מיקומי הדגימה האנטומיים המנוקים לקרינת UV למשך 30 דקות (אורך גל: 254 ננומטר), ולאחר מכן לאפשר להם להתייבש במלואם בטמפרטורת החדר. ודא שמקומות הדגימה האנטומיים יבשים לחלוטין לפני שתמשיך בדגימה או תחזור לאחסון כדי לא רק להקל על ייצור אבקת העצם, אלא גם כדי למנוע השפלה נוספת של הדגימה (למשל, עובש).
      אזהרה: חשיפה לקרינת UV עלולה להזיק לעיניים.
   7. יש לעבור מיד לדגימה או לאחסן אלמנטים שלדיים בסביבה סטרילית יבשה ומבוקרת טמפרטורה (25°C).

3. יצירת אבקת עצם

הערה: הפרוטוקולים הבאים מיועדים לשימוש במיצוי DNA בעקבות פרוטוקול Dabney et al. 2019²⁶.

1. דגימה של pars petrosa
   הערה: פרוטוקול זה מותאם מהנהלים המתוארים ב- Pinhasi et al. 2019⁴ ומוצג כאן כדי להקל על השימוש. פרוטוקול זה אינו מייצג את השיטה הנוכחית, ההרסנית פחות, לדגימה של pars petrosa. ככזה, מומלץ להשתמש בפרוטוקול המתואר על ידי Sirak et al. 2017¹³ או Orfanou et al. 2020¹⁴ עבור דגימות שבהן שימור מורפולוגי הוא בעל חשיבות מרבית.
   1. בצע את כל הדגימות בחדר ייעודי ונקי מתחת למכסה PCR המצויד באור UV או ארון בטיחות ביולוגית (אורך גל: 254 ננומטר) כאשר זרימת האוויר כבויה. פזרו רדיד אלומיניום סטרילי על פני הספסל כדי לתפוס אבקת/שברי עצם תועים.
   2. ודא שכל שברי העצם וכמה שיותר אבקה משוחזרים (להחזרה) לפני סילוק נייר הכסף. החליפו את נייר הכסף בין כל דגימה. יש להשליך את נייר הכסף המשומש בשקית/כלי קיבול ביולוגי אוטו-קלאב.
   3. אבטחו את האלמנט היבש והמפורק באמצעות מהדק או מראה מעוקרים.
   4. חתכו את הפטרוזה לשניים לאורך פטרוסוס הסולקוס העליון (ראו איור 1) באמצעות מסור של צורף סטנדרטי המצויד בלהב בקוטר 0.6 מ"מ (ראו טבלת חומרים) במהירות בינונית כדי למנוע התחממות יתר (ראו הערה להלן שלב 3.1.6).
      זהירות: pars petrosa הוא צפוף מאוד, וככזה עשוי להיות קשה לחתוך. הקפידו לשמור על האלמנט מהודק היטב כדי למנוע פציעה. יש להשליך את כל להבי המסור השבורים בכלי הקיבול של החדים המתאימים.
   5. מוציאים את החלקים הפטרוסיים מהמהדק. לשחזר ולשמור כל חומר רופף / עודף.
   6. מניחים נייר שקילה בסירת שקילה סטרילית
   7. החזיקו את החלק הפטרוס מעל נייר השקילה, חתוך הצידה מוטה לכיוון מגש השקילה. קדחו לתוך עצם קליפת המוח הצפופה שבין תעלת הפנים לאנטרום המסטואידי (נראה מבריק יותר מהחומר שמסביב, ראו איור 1) באמצעות מקדחה דנטלית המצוידת במעט מד קטן (ראו טבלת חומרים) ומוגדרת למהירות בינונית, מומנט בינוני להפקת אבקת עצם.
      הערה: קידוח/חיתוך צריך להיעשות בהתפרצויות קצרות במהירויות נמוכות עד בינוניות כדי למנוע התחממות יתר של העצם ופוטנציאל להרוס/לפגוע בדנ"א. באופן אנקדוטלי, כאשר החלק הצפוף של הפטרוס מתחיל להתחמם יתר על המידה ניתן להבחין בריח המתואר כבייקון בישול. יש להפסיק את הקידוח/ניסור באופן מיידי ולתת לעצם לנוח עד להתקררות מספקת לפני החידוש.
   8. יש לחזור על הקידוח עד לאיסוף של כ-50-100 מ"ג אבקה בנייר השקילה, כפי שנמדד באמצעות יתרה סגורה מדויקת ל-0.01 מ"ג לפחות (ראו טבלת חומרים).
      הערה: במידת האפשר מומלץ לאסוף 100 מ"ג של אבקת עצם כדי לאפשר מיצוי DNA משוכפל של 50 מ"ג כל אחד. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי על סמך מגבלה של מיקומי הדגימה האנטומיים עצמם (למשל, הפלנקס הדיסטלי, תא מוך השן) או הצורך בשימור מורפולוגי. עבור מקומות אחרים, כגון צמנטום, הרבה פחות מ 50 מ"ג של החומר עשוי להיות זמין. עם זאת, הודגם כי הצמנטום, תא מוך השן והפלנקס הדיסטלי מניבים דנ"א אנדוגני משמעותי 11,27,28^, למרות קלט ראשוני נמוך יותר של אבקת עצם מתהליך המיצוי.
   9. העבר את האבקה מנייר השקילה לצינור בעל 2 מ"ל עם תווית של קשירה נמוכה ונעילה בטוחה למיצוי או לאחסון. אחסן דוגמאות ב- -20 °C, ללא הגבלת זמן.
   10. יש לאחסן את שאריות העצם/עודפי האבקה בסביבה סטרילית יבשה ומבוקרת טמפרטורה (25°C) עד שניתן יהיה להשלים את תהליך ההחזרה/החזרה.
   11. יש להשליך את כל הפסולת לשקיות ביו-האזרד או כלי קיבול הניתנים לעיבוד אוטומטי. לעקר/לפרק את כל הציוד הרב-פעמי (למשל, מלחציים, מקדחות, מקדחות, מסורים וכו') באמצעות תמיסת אקונומיקה/DNA deontamination/אתנול ו-UV (אורך גל: 254 ננומטר), לפי העניין, בין כל דגימה.

איור 1: עצם טמפורלית הכוללת את ה-pars petrosa. (A) דגימה לפני חיתוך המציגה את מיקומם של פירמידת הפטרוס והסולקוס פטרוסה. (B) חלק פטרוס לאחר החיתוך המדגיש את האזורים הצפופים שיש לקדוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. דגימה של טוחנות קבועות
   הערה: לדגימה של טוחנות קבועות, בחר מראש in situ טוחנות עם שורשים מתמזגים ובאופן אידיאלי נטולות עששת, סדקים באמייל או בלאי מוגזם לקבלת התוצאות הטובות ביותר. הסר כל דגימת חצץ דנטלי ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לניתוחים עתידיים אפשריים של המיקרוביום האוראלי (הליך שאינו מכוסה כאן).
   1. דגימת הצמנטום
      1. בצע את כל הדגימות בחדר ייעודי ונקי מתחת למכסה PCR המצויד באור UV או ארון בטיחות ביולוגית (אורך גל: 254 ננומטר) כאשר זרימת האוויר כבויה. פזרו רדיד אלומיניום סטרילי על פני הספסל כדי לתפוס אבקת/שברי עצם תועים.
      2. ודא שכל שברי העצם וכמה שיותר אבקה משוחזרים (להחזרה) לפני השלכת נייר הכסף. החליפו את נייר הכסף בין כל דגימה. יש להשליך רדיד אלומיניום משומש בשקית/כלי קיבול ביולוגי הניתן לעיבוד אוטומטי.
      3. מניחים דף נייר שקילה במגש שקילה סטרילי.
      4. החזק/אבטחו את הטוחנת המפורקת על ידי האמייל, שורש כלפי מטה, מעל מגש שקילה באמצעות מהדק ידני כגון מפתח ברגים מתכוונן (ראו טבלת חומרים).
      5. הצטיידו במקדחה דנטלית בגלגל חיתוך עגול בעל קצוות יהלום. כאשר המקדחה מוגדרת להגדרת מהירות/מומנט בינוניים, יש לגעת קלות בקצה הסיבית עד לשורש בזווית של כ-20°-.
      6. יש לגרד כלפי מטה לתוך המגש כדי להסיר/לאסוף את החומר הצהוב והחיצוני ביותר מהשורש (צמנטום). הפסק את האיסוף כאשר החומר הבהיר (הלבן) של הדנטין הופך לגלוי.
         הערה: חשוב להתאים את כיוון הסיבוב של סיבית החיתוך ביחס למגש האיסוף כדי למנוע מהאבקה להפוך לאירוסולית ועלולה לבזבז את הדגימה על ידי החמצת המגש לחלוטין. הצמנטום עשיר במיוחד בדנ"א; עם זאת, תפוקות טיפוסיות של חומר קטנות בהרבה ממיקומי דגימה אנטומיים אחרים (~7-20 מ"ג)11,27,28.
      7. מסת שיא של אבקה שנאספה בנייר שקילה באמצעות יתרה סגורה מדויקת ל-0.01 מ"ג לפחות (ראו טבלת חומרים).
      8. העבירו את האבקה מנייר השקילה לצינור נעילה בטוח עם קשירה נמוכה של 2 מ"ל למיצוי. יש לאחסן ב-20°C-, ללא הגבלת זמן.
   2. דגימה של תא עיסת
      1. לאחר איסוף הצמנטום (אם רוצים), חתכו את הטוחנת לאורך צומת הצמנטו-אמייל בעזרת מסור של צורף כדי להסיר את הכתר ( ראו איור 2).
      2. הניחו גיליון חדש של נייר שקילה במגש שקילה חדש.
      3. אבטחו את חלק הכתר במהדק או במראה ידני, מעל מגש השקילה. החזיקו את הצד החתוך מוטה כלפי מטה ואת חומר הקידוח/גירוד כמעבר הראשון עם מקדחה דנטלית המצוידת במקדחה קטנה (ראו טבלת חומרים) לאורך שולי תא העיסה בתוך חלק הכתר (ראו איור 2).
         הערה: יש לאסוף רק את המעבר הראשון של פנים תא מוך השן ולסמן אותו כחומר מוך השן (תפוקה אופיינית של 5-15 מ"ג), כל דבר עמוק יותר לתוך השן נחשב לדנטין.
      4. סובבו את השן כשהחלק התחתון פונה כלפי מטה, טפחו על המהדק עם פטיש, ואספו את האבקה המשוחררת על נייר השקילה.
      5. רשום את משקל האבקה שנאספה בנייר השקילה באמצעות איזון מצורף מדויק ל-0.01 מ"ג לפחות (ראו טבלת חומרים).
      6. העבירו את האבקה מנייר השקילה לצינור של 2 מ"ל עם קשירה נמוכה ונעילה בטוחה למיצוי. יש לאחסן ב-20°C-, ללא הגבלת זמן.
   3. דגימה של הדנטין
      1. הניחו גיליון חדש של נייר שקילה במגש שקילה חדש.
      2. החזיקו את חלק הכתר מעל מגש השקילה (לפי שלב 3.2.2.3), קדחו ואספו עוד 50-100 מ"ג דנטין כפי שנמדד באמצעות איזון סגור מדויק ל-0.01 מ"ג (ראו טבלת חומרים) מהחלק הפנימי של תא עיסת הדם באותו אופן לדגימת דנטין נוספת (ראו איור 2).
      3. העבר אבקת עצם מנייר השקילה לצינור 2 מ"ל עם קשירה נמוכה ונעילה בטוחה למיצוי. יש לאחסן ב-20°C-, ללא הגבלת זמן.
      4. יש לאחסן את שאריות חלקי השן/עודפי האבקה בסביבה סטרילית יבשה ומבוקרת טמפרטורה (25°C) עד שניתן יהיה להשלים את החזרה/החזרה.
      5. יש להשליך את כל הפסולת לשקיות ביו-האזרד או כלי קיבול הניתנים לעיבוד אוטומטי. לעקר/לפרק את כל הציוד הרב-פעמי (למשל, מלחציים, מקדחות, מקדחות, מסורים וכו') באמצעות חשיפות של אקונומיקה/פירוק DNA/אתנול ו-UV (אורך גל: 254 ננומטר) לפי העניין, בין כל דגימה.

איור 2: דגימה מוקדמת טוחנת קבועה. (A) טוחנת מטופלת מראש לפני הדגימה, מראה כתר, צמנטום (שכבה צהבהבה של השורש) ואתר החיתוך בצומת צמנטו-אמייל. (B) אותו אוסף טוחנות פוסט-צמנטום, המציג את אתר החיתוך בצומת הצמנטו-אמייל. (C) טוחנות לאחר חיתוך ודגימה המציגות מיקומי דגימה אנטומיים עבור תא מוך השן והדנטין בתוך הכתר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. דגימה של חוליות החזה
   1. דגימה של גוף החוליה
      1. בצע את כל הדגימות בחדר ייעודי ונקי מתחת למכסה PCR המצויד באור UV או ארון בטיחות ביולוגית (אורך גל: 254 ננומטר) כאשר זרימת האוויר כבויה. פזרו רדיד אלומיניום סטרילי על פני הספסל כדי לתפוס אבקת/שברי עצם תועים.
      2. ודא שכל שברי העצם וכמה שיותר אבקה משוחזרים (להחזרה) לפני השלכת נייר הכסף. החליפו את נייר הכסף בין כל דגימה. יש להשליך רדיד אלומיניום משומש בשקית/כלי קיבול ביולוגי הניתן לעיבוד אוטומטי.
      3. הניחו גיליון קטן של נייר שקילה במגש שקילה סטנדרטי.
      4. אבטחו את החוליות באמצעות מהדק או ידי, כאשר גוף החוליה כלפי חוץ.
      5. החזיקו את החוליות מעל מגש השקילה כשגוף החוליה מוטה כלפי מטה. באמצעות מקדחה דנטלית המצוידת במקדחה קטנה (ראו טבלת חומרים) המוגדרת למומנט גבוה במהירות נמוכה, קודחים לאורך השפה החיצונית ביותר (נחותה ועליונה) של עצם קליפת המוח המקיפה את הרקמה הפנימית של גוף החוליה (ראו איור 3).
      6. יש לגרד את הביט כנגד השכבה הקורטיקלית מעל מגש שקילה סטנדרטי עד לאיסוף של 50-100 מ"ג חומר, כפי שנמדד באמצעות איזון מצורף המדויק ל-0.01 מ"ג (ראו טבלת חומרים).
      7. העבירו אבקת עצם מנייר השקילה לצינור נעילה בטוח עם קשירה נמוכה של 2 מ"ל לצורך מיצוי. יש לאחסן ב-20°C-, ללא הגבלת זמן.
   2. דגימה של קשת החוליות העליונה
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי. הסר והשלך את השכבה החיצונית ביותר של עצם קליפת המוח של קשת החוליות העליונה באמצעות מקדחה דנטלית המצוידת במקדחה קטנה (ראו טבלת חומרים) על ידי גירודה לאורך פני השטח¹⁹. הדבר אינו מוצע לדגימה מגוף החוליות, שכן שכבת עצם קליפת המוח היא בדרך כלל דקה מאוד וסביר להניח שתתרוקן לחלוטין בתהליך זה (ראו הערה בסעיף 2).
      1. הניחו גיליון קטן של נייר שקילה במגש שקילה סטנדרטי.
      2. אבטחו את החוליות במהדק/מגן יד כאשר תהליך החוליות כלפי חוץ, היבט עליון כלפי מטה.
      3. תוך כדי החזקת החוליות, ההיבט העליון כלפי מטה, מעל מגש שקילה, קדח כלפי מעלה למרכז החריץ בצורת V שנוצר על ידי מיזוג התהליך הסיבובי עם הלמלה (ראו איור 3) באמצעות מקדחה דנטלית עם סיבית מד קטנה (ראו טבלת חומרים) המוגדרת למהירות נמוכה ומומנט גבוה.
      4. להפסיק לקדוח כאשר יש ירידה ניכרת בהתנגדות. יש לשנות מעט את תנוחת הקידוח ולחזור על הפעולה עד לאיסוף של 50-100 מ"ג אבקת עצם, כפי שנמדד באמצעות איזון סגור המדויק ל-0.01 מ"ג (ראו טבלת חומרים).
      5. העבירו אבקת עצם מנייר השקילה לצינור 2 מ"ל בעל קשירה נמוכה למיצוי. יש לאחסן ב-20°C-, ללא הגבלת זמן.
      6. יש לאחסן את שאריות העצם/עודפי האבקה בסביבה סטרילית יבשה ומבוקרת טמפרטורה (25°C) עד להחזרה/חזרה.
      7. יש להשליך את כל הפסולת לשקיות ביו-האזרד או כלי קיבול הניתנים לעיבוד אוטומטי. לעקר/לפרק את כל הציוד הרב-פעמי (למשל, מלחציים, מקדחים, מקדחות, מסורים וכו') באמצעות תמיסת אקונומיקה/פירוק DNA/אתנול ו-UV (אורך גל: 254 ננומטר), לפי העניין, בין כל דגימה.

איור 3: גוף חוליה ועצם קורטיקלית של עצם קורטיקלית עליונות של חוליית החזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. דגימה של הפלנקס הדיסטלי
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי. יש להסיר ולהשליך את השכבה החיצונית ביותר של עצם קליפת המוח של הפיר ו/או הפתח האפיקלי באמצעות מקדחה דנטלית המצוידת במקדחה קטנה על ידי גירודה לאורך פני השטח¹⁹. ייתכן שהדבר לא יתאפשר עבור דגימות עם עצם קליפת המוח דקה מדי או שרידים צעירים (ראה הערה בסעיף 2).
   1. בצע את כל הדגימות בחדר ייעודי ונקי, מתחת למכסה PCR המצויד באור UV או ארון בטיחות ביולוגית (אורך גל UV: 254 ננומטר) כאשר זרימת האוויר כבויה. פזרו רדיד אלומיניום סטרילי על פני הספסל כדי לתפוס אבקת/שברי עצם תועים.
   2. ודא שכל שברי העצם וכמה שיותר אבקה משוחזרים (להחזרה) לפני השלכת נייר הכסף. החליפו את נייר הכסף בין כל דגימה. יש להשליך רדיד אלומיניום משומש בשקית/כלי קיבול ביולוגי הניתן לעיבוד אוטומטי.
   3. הניחו גיליון קטן של נייר שקילה במגש שקילה סטנדרטי.
   4. אבטח את הדגימה במהדק/מראה כף יד, צד עליון כלפי מעלה.
   5. החזיקו את הדגימה מעל מגש השקילה, אספו אבקת עצם מהעצם הקורטיקלית מהצד התחתון של הפתח והפיר האפיקלי על ידי קידוח דרך השכבות הצפופות החיצוניות ביותר (ראו איור 4) באמצעות מקדחה דנטלית המצוידת במקדחה קטנה (ראו טבלת חומרים).
   6. להפסיק לקדוח כאשר יש ירידה ניכרת בהתנגדות, שכן זה מסמל חומר קל יותר, בטל. חזור על תהליך זה, מקרין החוצה מהקידוח הראשוני עד לאיסוף של לפחות 50-100 מ"ג אבקת עצם, כפי שנמדד באמצעות איזון סגור מדויק ל-0.01 מ"ג (ראו טבלת חומרים).
   7. העבר אבקת עצם מנייר השקילה לצינור 2 מ"ל עם קשירה נמוכה ונעילה בטוחה למיצוי. יש לאחסן ב-20°C-, ללא הגבלת זמן.
   8. יש לאחסן את שאריות העצם/עודפי האבקה בסביבה סטרילית יבשה ומבוקרת טמפרטורה (25°C) עד להחזרה/חזרה.
   9. יש להשליך את כל הפסולת לשקיות ביו-האזרד או כלי קיבול הניתנים לעיבוד אוטומטי. לחטא/לפרק את כל הציוד הרב-פעמי (למשל, מלחציים, מקדחות, מקדחות, מסורים וכו') באמצעות תמיסת אקונומיקה/פירוק DNA/אתנול וחשיפה לקרינת UV, לפי העניין, בין כל דגימה.
      הערה: עבור דגימות קטנות יותר (למשל, דגימות נעורים) ייתכן שיהיו הרבה פחות מהכמות המומלצת של 50-100 מ"ג של עצם קליפת המוח הזמינה לדגימה. עם זאת, גם בכמויות נמוכות, מיקום הדגימה האנטומי הזה הוכח כעשיר במיוחד בדנ"א¹¹.

איור 4: פלנקס דיסטלי המציג את מיקומה של עצם קליפת המוח הצפופה לאורך הפיר והצד התחתון של הפתח האפיקלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. דגימת הטלוס
   1. בצע את כל הדגימות בחדר ייעודי ונקי מתחת למכסה PCR המצויד באור UV או ארון בטיחות ביולוגית (אורך גל: 254 ננומטר) כאשר זרימת האוויר כבויה. פזרו רדיד אלומיניום סטרילי על פני הספסל כדי לתפוס אבקת/שברי עצם תועים.
   2. ודא שכל שברי העצם וכמה שיותר אבקה משוחזרים (להחזרה) לפני השלכת נייר הכסף. החליפו את נייר הכסף בין כל דגימה. יש להשליך רדיד אלומיניום משומש בשקית/כלי קיבול ביולוגי הניתן לעיבוד אוטומטי.
   3. הניחו גיליון קטן של נייר שקילה במגש שקילה סטנדרטי.
   4. אבטח את הדגימה במהדק/ויז כף יד, כיפה כלפי מעלה.
   5. החזיקו את הטלוס, הכיפה כלפי מעלה והמשטח המדיאלי לכיוון האספן, מעל מגש השקילה. גרד עצם קליפת המוח מצוואר הטלוס לעומק של ~1 מ"מ (ראה איור 5) באמצעות מקדחה דנטלית עם סיבית מד נמוכה (ראו טבלת חומרים) המוגדרת למהירות נמוכה ומומנט גבוה.
   6. יש לשנות מעט את מיקום הקידוח ולחזור על הפעולה עד לאיסוף של כ-50-100 מ"ג אבקת עצם, כפי שנמדד באמצעות איזון סגור מדויק ל-0.01 מ"ג (ראו טבלת חומרים).
   7. העבירו אבקת עצם מנייר השקילה לצינור 2 מ"ל בעל קשירה נמוכה למיצוי. יש לאחסן ב-20°C-, ללא הגבלת זמן.
   8. יש לאחסן את העצם/האבקה העודפת הנותרת בסביבה סטרילית יבשה ומבוקרת טמפרטורה (25°C) עד שניתן יהיה להשלים את תהליך החזרה/החזרה.
   9. יש להשליך את כל הפסולת לשקיות ביו-האזרד או כלי קיבול הניתנים לעיבוד אוטומטי. לעקר/לפרק את כל הציוד הרב-פעמי (למשל, מלחציים, מקדחות, מקדחות, מסורים וכו') באמצעות תמיסת אקונומיקה/DNA deontamination/אתנול ו-UV (אורך גל: 254 ננומטר), לפי העניין, בין כל דגימה.

איור 5: אזור הדגימה של הטלוס להתאוששות עצם קליפת המוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הערה: לטלוס יש מעט מאוד עצם קליפת המוח (שכבה חיצונית דקה). יש לאסוף את החומר לא רק מפני השטח אלא גם את השכבה הצפופה שמתחת לעצם הבטלנית.

תוצאות

במחקר נפרד מס' 11, דנ"א הופק מאבקת עצם שנוצרה מכל מיקום דגימה אנטומי^ב-11 פרטים, תוך שימוש בפרוטוקול מיצוי דנ"א סטנדרטי הממוטב למקטעים קצרים מרקמה^2. ספריות חד-גדיליות יוצרו^{אז 28} ורוצפו על HiSeq 4000 (75 bp זוגי-קצה) לעומק של ~20,000,000 קריאות לכל דגימה. נתוני הרצף שהתקבלו הוערכו לאחר מכן עבור תוכן דנ"א אנושי אנדוגני באמצעות צינור EAGER²⁹ (הגדרות BWA: אורך זרע של 32, עונש אי התאמה 0.1, מסנן איכות מיפוי של 37). כל התוצאות המייצגות מדווחות באמצעות אותם מדדים כמו Parker et al. 2020¹¹ לצורך עקביות. ספריות מהחלקים האבקתיים של ה-pars petrosa הניבו, בממוצע, דנ"א אנדוגני גבוה יותר מכל אחד מ-23 אתרי הדגימה האנטומיים האחרים שנסקרו (איור 6A-B). שבעת מיקומי הדגימה האנטומיים הנוספים המוצגים בפרוטוקול זה (הצמנטום, המעבר הראשון של תא מוך השן ודנטין של טוחנות קבועות; עצם קליפת המוח מגוף החוליה וקשת החוליות העליונה של חוליית החזה; עצם קליפת המוח מהציצית האפית של הפלנקס הדיסטלי; ועצם קליפת המוח מצוואר הטלוס) הניבו את התשואות הגבוהות הבאות (ללא מובהקות סטטיסטית בין מיקומי דגימה אנטומיים אלה; איור 6A-B; קובץ משלים 1: אנדוגניDNAPreCap). כל המיקומים החלופיים האלה מייצרים באופן עקבי תפוקות דנ"א המתאימות לניתוחים גנטיים סטנדרטיים של אוכלוסיות, כגון ניתוחים מיטוכונדריאליים וניתוחי פולימורפיזם של נוקלאוטידים בודדים (SNP). שיעורי הכפילויות בספריות שנבעו מכל מיקומי הדגימה האנטומיים היו נמוכים (גורמי אשכול < 1.2 בממוצע, המחושבים כיחס בין כל קריאות המיפוי לקריאות מיפוי ייחודיות, טבלה 2; קובץ משלים 1: ClusterFactor), המציין כי כל הספריות שנבדקו היו בעלות מורכבות גבוהה מאוד. באופן דומה, הערכות הזיהום הממוצעות של דנ"א אנושי אקסוגני היו נמוכות, בממוצע < 2% (זיהום כרומוזום X אצל זכרים, n = 7, כפי שדווח על ידי צינור ANGSD³⁰) בכל אתרי הדגימה האנטומיים למעט קשת החוליות העליונה (זיהום משוער ממוצע: 2.11%, כאשר דגימה אחת הוסרה כחריגה; KRA005: 19.52%, ראה לוח 2; קובץ משלים 1: Xcontamination). אורך השבר הממוצע (לאחר סינון להסרת כל הקריאות < 30 bp) היה הנמוך ביותר בחומר שנאסף מתא מוך השן והדנטין, ללא שונות משמעותית בין מיקומי דגימה אנטומיים אחרים (55.14 bp ו- 60.22 bp, בהתאמה בהשוואה לחציון ממוצע של 62.87, ערכי p זוגיים < 0.019, טבלה 2; קובץ משלים 1: AvgFragLength). בנוסף, השיניים וחוליות בית החזה מכילות כל אחת מספר מקומות דגימה אנטומיים שבהם נצפתה התאוששות דנ"א אנדוגנית גבוהה, מה שהופך אותן למתאימות במיוחד כחלופות ל-pars petrosa.

איור 6: תכולת הדנ"א האנושי עבור כל הדגימות שנבדקו. קווים שחורים מייצגים את הממוצע הכולל, בעוד שקווים אדומים מייצגים את החציון (מוצק: פרופורציית דנ"א אנושי, מקווקו: קריאות אנושיות ממופות למיליון קריאות שנוצרו). בכל הניתוחים נצבעים מיקומי דגימה אנטומיים בודדים עם שיעור דנ"א אנושי ממוצע גבוה מהממוצע הכללי (8.16%). (A) שיעור הקריאות במיפוי לגנום הייחוס hg19. הקו המקווקו הכחול מייצג את המקסימום התיאורטי בהינתן פרמטרי המיפוי של הצינור (שנוצר באמצעות Gargammel³¹ כדי לדמות התפלגות אקראית של 5,000,000 קריאות מגנום הייחוס hg19 עם נזק מדומה). אמצעים בודדים (X שחור) וחציונים (עיגול אדום) מדווחים עבור דגימות עם שיעור דנ"א אנושי ממוצע גבוה יותר מהממוצע הכללי. רווח בר-סמך מציין גבולות עליונים ותחתונים למעט חריגות סטטיסטיות. (B) מספר הקריאות הייחודיות הממפות לגנום הייחוס hg19 למיליון קריאות של מאמץ ריצוף (75 bp זוג סוף). רווח בר-סמך מציין גבולות עליונים ותחתונים למעט חריגות סטטיסטיות. נתון זה הותאם מ- Parker, C. et al. 2020¹¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 2: רמות שכפול ממוצעות (מיפוי קריאות/קריאות ייחודיות), אורכי מקטעים ממוצעים וחציוניים ואומדני זיהום כרומוזום X עבור כל מיקומי הדגימה האנטומית. שגיאה שדווחה כשגיאת התקן של הממוצע. טבלה זו הותאמה מתוך Parker, C. et al. 2020¹¹.

מיקום הדגימה	מקדם שכפול ממוצע (# קריאות ממופות /# קריאות ממופות ייחודיות)	אורך מקטע ממוצע ב- bp	שיעור משוער ממוצע של זיהום כרומוזום X
פירמידת פטרוס	1.188 ± 0.006	65.40 ± 1.36	0.000 ± 0.003
צמנטום	1.197 ± 0.028	67.28 ± 1.76	0.011 ± 0.003
דנטין	1.188 ± 0.061	60.22 ± 2.37	0.002 ± 0.007
זולה	1.179 ± 0.024	55.14 ± 2.90	0.013 ± 0.006
פלנקס דיסטלי	1.191 ± 0.049	65.95 ± 1.08	0.013 ± 0.005
גוף החוליה	1.194 ± 0.037	66.14 ± 1.03	0.008 ± 0.003
קשת חוליות עליונה	1.19 ± 0.017	63.02 ± 1.23	0.021 ± 0.009*
טאלוס	1.198 ± 0.010	68.20 ± 1.24	0.011 ± 0.003
*מדגם KRA005 הוסר כחריג ב- 0.1952

זמינות קוד
כל תוכנות הניתוח ומודולי R המשמשים בניתוחים של כתב יד זה זמינים באופן חופשי ממחבריהם בהתאמה. כל קוד R מותאם אישית זמין על פי בקשה.

זמינות נתונים
כל הנתונים הגולמיים המשמשים לחישוב התוצאות המייצגות זמינים באופן חופשי במאגר הנתונים האירופי Nucleotide Archive ENA (מספר הצטרפות PRJ-EB36983) או בחומרים משלימים של Parker, C. et ^al.11.

קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

הנוהג כיום בגנטיקה של אוכלוסיות אנושיות עתיקות הוא להעדיף דגימה מה-pars petrosa (שלב 2.1) במידת האפשר. עם זאת, pars petrosa יכול להיות מדגם קשה להשגה, שכן הוא מוערך מאוד עבור מספר עצום של הערכות שלד (למשל, היסטוריית אוכלוסייה³², הערכת גיל העובר במוות 33, וקביעת מין³⁴), ומבחינה היסטורית, דגימה של pars petrosa לניתוח DNA יכול להיות הרסני מאוד ^3,4 (כולל הפרוטוקול שהוצג כאן^, למרות שפרוטוקולים חדשים, זעיר פולשניים,^13,14 אומצו כעת באופן נרחב כדי להפיג חשש זה). לכך מצטרפת העובדה שעד לא מזמן, מחקר שיטתי בקנה מידה גדול של התאוששות הדנ"א האנושי על פני השלד לא נוסה¹¹, מה שהופך את מציאת אסטרטגיית הדגימה המתאימה כאשר הפירמידה הפטרולית אינה זמינה למאתגרת.

הפרוטוקולים המוצגים כאן מסייעים להקל על אתגר זה על ידי מתן סדרה של נהלים אופטימליים לדגימת דנ"א משרידי שלד ארכיאולוגיים/פורנזיים, כולל pars petrosa וכן שבעה אתרי דגימה אנטומיים חלופיים על פני ארבעה אלמנטים נוספים של השלד. הצעדים הקריטיים הכלולים נועדו כולם למזער את האפשרות של אובדן / נזק לדנ"א עקב דגימה לא יעילה (שלבים 2.1.6 ו- 3.2.1.3) או התחממות יתר של דגימות במהלך קידוח / חיתוך (שלב 3.1.6). בנוסף, צוין לאורך כל הפרוטוקול כי ייתכן שיהיה צורך לשנות/להשמיט את שלבי טרום הטיפול כדי להבטיח את הביצועים הטובים ביותר בדגימות מושפלות מאוד. כמו כן, יש לציין כי גם בין האלמנטים שנבחרו שהוצגו כאן, נותרו מספר טכניקות דגימה חלופיות אפשריות (במיוחד עבור pars petrosa^13,14), כמו גם מקום רב לאופטימיזציה נוספת של מיקומי הדגימה האנטומיים הלא מנוצלים המוצגים כאן (כלומר^, הטאלוס: שלב 2.5 והחוליות: שלב 2.3).

חשוב גם לזכור כי פרוטוקולים אלה תוכננו ונבדקו באמצעות שרידים עתיקים של צעירים-בוגרים באיכות גבוהה (שימור מורפולוגי טוב) לצורך ניתוחי דנ"א אנושי אנדוגני. ייתכן שהתוצאות המוצגות אינן מתרחבות לחומרים מושפלים יותר, להקשרי שימור אחרים, לשרידי תינוקות, לשרידים לא אנושיים או למחקרים על פתוגנים או על המיקרוביום, שכן עדיין יש צורך בחקירה גדולה יותר של השימוש בפרוטוקולים אלה בהקשרים נוספים. בנוסף, רכיבי השלד החלופיים המוצגים כאן (השיניים, החוליות, הפלנקס הדיסטלי והטלי) עשויים להיות מאתגרים להקצאה לאדם יחיד בין שרידים מתמזגים, מה שמחייב דגימה ממספר אלמנטים כדי להבטיח מקור אחד. למרות מגבלות אלה, הפיכת פרוטוקולים אלה לזמינים באופן נרחב יכולה לסייע בהקלה על חלק מההטרוגניות סביב בחירה ועיבוד דגימות על ידי מתן מסגרת כללית וממוטבת כמותית לשימוש במגוון רחב של מחקרי aDNA/פורנזיים עתידיים על שרידי אדם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#16 Dental Drill Bit	NTI	H1-016-HP	example drilling bit
0.6 mm scroll saw blade	Fisher Scientific	50-949-097	blade for Jewellers Saw
22mm diamond cutting wheel	Kahla	SKU 806 104 358 514 220	Dremel cutting attachment
Commercial Bleach	Fisher Scientific	NC1818018
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil	Fisher Scientific	15-078-29X
DNA LoBind Tubes (2 mL)	Eppendorf	22431048
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment	Dremel	225-01	Dremel flexible extension
Dremel 4300 Rotary Tool	Dremel	4300	Example drill
Dremel collet and nut kit	Dremel	4485	Adapters for various Dremel tool attachments/bits
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag	Fisher Scientific	17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	13-698-792
Ethanol (Molecular Biology Grade)	Millipore Sigma	1.08543
FDA approved level 2 Surgical Mask	Fisher Scientific	50-206-0397	PPE
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-041-171X	PPE
Fisherbrand Safety Glasses	Fisher Scientific	19-130-208X	PPE
Granger Stationary Vise	Fisher Scientific	NC1336173	benchtop vise
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water	Fisher Scientific	10-977-023
Jewellers Saw	Fisher Scientific	50-949-231
Kimwipes	Sigma-Aldritch	Z188956
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet	Fisher Scientific	30-368-1101
LookOut DNA Erase	Millipore Sigma	L9042-1L
Medium weighing boat	Heathrow Scientific	HS120223
MSC 10pc plier/clamp set	Fisher Scientific	50-129-5352	Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance	Fisher Scientific	14-560-019	enclosed balance
Tyvek coveralls with hood	Fisher Scientific	01-361-7X	PPE
Weigh paper	Heathrow Scientific	HS120116