JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל ייחודי ורלוונטי מבחינה קלינית של מחלת עורקים היקפית המשלב עורק הירך ואלקטרו-קרישת ורידים עם ניהול מעכב סינתאז תחמוצת החנקן כדי לגרום לנמק אחורי בעכברים FVB. זלוף תוך-לבבי DiI משמש לאחר מכן להדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל.

Abstract

מחלת עורקים היקפית (PAD) היא גורם משמעותי לתחלואה הנובעת מחשיפה כרונית לגורמי סיכון טרשת עורקים. חולים הסובלים מצורתה החמורה ביותר, איסכמיה כרונית מסכנת גפיים (CLTI), מתמודדים עם ליקויים משמעותיים בחיי היומיום, כולל כאב כרוני, מרחק הליכה מוגבל ללא כאב ופצעים שאינם מחממים. מודלים פרה-קליניים פותחו בבעלי חיים שונים כדי לחקור PAD, אבל איסכמיה אחורית עכבר נשאר הנפוץ ביותר בשימוש נרחב. יכולה להיות שונות משמעותית בתגובה לעלבון איסכמי במודלים אלה בהתאם לזן העכבר המשמש ואת האתר, המספר והאמצעים להפרעה עורקית. פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית המשלבת עורק הירך ואלקטרו-קרישת ורידים עם ניהול של מעכב סינתאז תחמוצת החנקן (NOS) כדי לגרום באופן אמין נמק משטח כף הרגל בעכברים וירוס חבר B (FVB) הדומה לאובדן הרקמה של CLTI. בעוד אמצעים מסורתיים להערכת reperfusion כגון הדמיית זלוף דופלר לייזר (LDPI) עדיין מומלץ, זלוף תוך לב של צבע ליפופילי 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) משמש לתיוג כלי הדם. מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית בהרכבה מלאה לאחר מכן מאפשרת שחזור ברזולוציה גבוהה ותלת-ממדית (3D) של רשתות כלי דם של משטחי רגליים המשלימים אמצעים מסורתיים להערכת רפרטפוזיה במודלים של איסכמיה אחורית.

Introduction

מחלת עורקים היקפית (PAD), המאופיינת בזרימת דם מופחתת לגפיים עקב טרשת עורקים, משפיעה על 6.5 מיליון אנשים בארצות הברית ועל 200 מיליון אנשים ברחבי העולם1. חולים עם PAD חווים ירידה בתפקוד הגפיים ובאיכות החיים, ואלה עם CLTI, הצורה החמורה ביותר של PAD, נמצאים בסיכון מוגבר לכריתה ולמוות עם שיעור תמותה של 5 שנים המתקרב ל -50%2. בפרקטיקה הקלינית, חולים עם מדדי ברכיאל קרסול (ABI) <0.9 נחשבים כבעלי PAD, ואלה עם ABI <0.4 הקשורים לכאב מנוחה או לאובדן רקמות כבעלי CLTI3. הסימפטומים משתנים בין חולים עם ABIs דומים בהתאם לפעילות היומיומית, עמידות שרירים לאיסכמיה, וריאציות אנטומיות, והבדלים בהתפתחות בטחונות4. נמק ספרות וגפיים הוא הביטוי החמור ביותר של כל מחלות אוטם כלי הדם הגורמות CLTI. זהו סוג של נמק יבש שחונט את הרקמות הרכות. בנוסף PAD טרשת עורקים, זה יכול להיות נצפה גם בחולים עם סוכרת, vasculitides כגון מחלת Buerger ואת התופעה של Raynaud, או calciphylaxis בהגדרה של מחלת כליות סופנית5,6.

מספר מודלים פרה קליניים פותחו כדי לחקור את הפתוגנזה של PAD / CLTI ולבדוק את היעילות של טיפולים פוטנציאליים, הנפוץ שבהם נשאר איסכמיה אחורית עכבר. גרימת איסכמיה אחורית בעכברים מושגת בדרך כלל על ידי חסימת זרימת הדם מעורקי הכף או הירך, בין אם על ידי קשירת תפר, אלקטרו-קרישה או אמצעים אחרים של כיווץ הכלי הרצוי7. טכניקות אלה מפחיתות באופן דרסטי זלוף לחלק האחורי וממריצות את הניאווסקולריזציה בשרירי הירך והשוק. עם זאת, ישנם הבדלים חיוניים תלויי זן מורין ברגישות לעלבון איסכמי חלקית בשל הבדלים אנטומיים בהתפלגות בטחונות8,9. לדוגמה, עכברי C57BL/6 עמידים יחסית לאיסכמיה אחורית, ומדגימים תפקוד גפיים מופחת אך בדרך כלל אין ראיות לנמק בפנקס הרגליים. מצד שני, לעכברי BALB/c יש יכולת ירודה מטבעה להתאושש מאיסכמיה ובדרך כלל לפתח קטיעה אוטומטית של כף הרגל או הרגל התחתונה בעקבות קשירת עורק הירך בלבד. תגובה חמורה זו לאיסכמיה מצמצמת את החלון הטיפולי ויכולה למנוע הערכה אורכית של רפרטפוז ותפקוד הגפיים. מעניין, הבדלים גנטיים לוקוס תכונה כמותית אחת הממוקם על כרומוזום מורין 7 היו מעורבים אלה רגישות דיפרנציאלית של C57BL / 6 ו BALB / c עכברים נמק רקמות ו reperfusion גפיים10.

בהשוואה לזני C57BL/6 ו- BALB/c, עכברי FVB מדגימים תגובה בינונית אך לא עקבית לקשירת עורק הירך בלבד. בעלי חיים מסוימים מפתחים נמק משטח כף הרגל בצורה של מסמרים איסכמיים שחורים או ספרות חנוטות, אך אחרים ללא כל סימנים גלויים של איסכמיה11. ניהול בו זמנית של Nω-Nitro-L-ארגנין מתיל אסתר הידרוכלוריד (L-NAME), מעכב סינתאז תחמוצת החנקן (NOS)12, מונע מנגנוני vasodilatory מפצה ומגביר עוד יותר את הלחץ החמצוני ברקמה האחורית. בשילוב עם קשירת עורק הירך או קרישה, גישה זו מייצרת בעקביות אובדן רקמת משטח כף הרגל בעכברים FVB הדומה לשינויים הנטרופיים של CLTI אך לעתים רחוקות מתקדם לכריתת איברים אוטומטית11. עקה חמצונית היא אחד מסימני ההיכר של PAD / CLTI והוא מופץ על ידי תפקוד לקוי של אנדותל וזמינות ביולוגית מופחתת של תחמוצת החנקן (NO)13,14. NO היא מולקולה פלוריפוטנטית שבדרך כלל מפעילה השפעות מועילות על זרימת דם עורקית ונימית, הידבקות טסיות דם וצבירה, וגיוס לויקוציטים והפעלה13. רמות מופחתות של NOS הוכחו גם להפעיל את האנזים ממיר אנגיוטנסין, אשר גורם סטרס חמצוני ומאיץ את ההתקדמות של טרשת עורקים15.

ברגע שנוצר מודל של איסכמיה אחורית, ניטור ריפוזיון הגפיים הבאים ואת ההשפעה הטיפולית של כל טיפולים פוטנציאליים נדרשים גם. במודל נמק מורין המוצע, ניתן לכמת תחילה את מידת אובדן הרקמות באמצעות ציון פייבר כדי להעריך את המראה הגס של כף הרגל (0: נורמלי, 1-5: אובדן מסמרים שבהם הציון מייצג את מספר הציפורניים המושפעות, 6-10: ניוון של ספרות שבהן הציון מייצג את מספר הספרות המושפעות, 11-12: ניוון חלקי ומלא כף הרגל, בהתאמה)9. מדידות כמותיות של זלוף אחורי נעשות בדרך כלל באמצעות LDPI, המסתמך על אינטראקציות דופלר בין אור לייזר לתאי דם אדומים כדי לציין זלוף ברמת הפיקסל באזור מעניין (ROI)16. בעוד שטכניקה זו היא כמותית, לא פולשנית ואידיאלית למדידות חוזרות ונשנות, היא אינה מספקת פירוט אנטומי פרטני של כלי הדם האחוריים16. שיטות הדמיה אחרות, כגון טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT), אנגיוגרפיה של תהודה מגנטית (MRA) ומיקרואנגיוגרפיה של קרני רנטגן, מוכיחות יקרות, דורשות מכשור מתוחכם, או מאתגרות מבחינה אחרת מבחינה טכנית16. בשנת 2008, Li et al. תיאר טכניקה לתיוג כלי דם בתוך הרשתית עם צבע קרבוציאנין ליפופילי DiI17. DiI משתלב בתאי אנדותל, ועל ידי דיפוזיה ישירה, כתמים מבני קרום כלי דם כגון נבטים אנגיוגניים ותהליכים פסאודופודיים17,18. בשל המסירה הישירה שלה לתאי אנדותל ואופי פלואורסצנטי מאוד של הצבע, הליך זה מספק תיוג אינטנסיבי וארוך טווח של כלי הדם. בשנת 2012, בודן ואח ' התאים את הטכניקה של זלוף DiI למודל איסכמיה אחורית מורין באמצעות הדמיה הר שלם של שרירי תוספת הירך שנקטפו בעקבות קשירת עורק הירך19.

השיטה הנוכחית מספקת דרך זולה יחסית וישימה מבחינה טכנית להערכת ניאווסקולריזציה בתגובה לאיסכמיה אחורית וטיפולים מבוססי גנים או תאים. בהסתגלות נוספת, פרוטוקול זה מתאר את היישום של זלוף DiI כדי לדמות את כלי הדם של משטח כף הרגל ברזולוציה גבוהה ותלת-ממד במודל מורין של נמק אחורי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים בפרוטוקול אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת מיאמי (IACUC). עכברי FVB, גברים ונשים כאחד, בגילאי 8-12 שבועות, שימשו למחקר.

1. הכנת פתרון L-NAME

  1. בתנאים סטריליים במכסה המנוע של זרימה למינארית, הכינו פתרון מלאי L-NAME על ידי המסת 1 גרם אבקת L-NAME (ראו טבלת חומרים) עם 20 מ"ל של מים סטריליים ליצירת תמיסה של 50 מ"ג/מ"ל. לאחסן את פתרון המלאי ב 300-500 μL aliquots ב -20 °C (60 °F) עד 3 חודשים.
  2. כדי ליצור פתרון L-NAME עובד, להפשיר aliquot של פתרון מלאי L-NAME ולדלל עם PBS (1:4) בתנאים סטריליים כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ"ג / מ"ל.
  3. כדי להכין PBS (pH 7.4), להמיס 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם של Na2HPO4, ו 0.23 גרם של NaH2PO4 ב 800 מ"ל של מים מזוקקים. כווננו את רמת החומציות ל-7.4 עם HCl. הוסיפו מים לנפח כולל של 1,000 מ"ל וסיננו דרך מסנן עליון של בקבוק בגודל 0.22 מיקרומטר.
    הערה: הזרקה תוך-אפריטונית (IP) של 4 μL/g של פתרון עבודה מסוג L-NAME שקולה למינון הרצוי של 40 מ"ג/ק"ג/ק"ג של L-NAME. פתרון עבודה L-NAME צריך להישמר על קרח במהלך השימוש, ודילולים חדשים צריכים להיעשות מדי יום באמצעות aliquots מופשר טרי של פתרון מלאי.

2. אינדוקציה כימית וניתוחית של נמק אחורי

  1. להשיג עכברי FVB, בגילאי 8-12 שבועות, או ממגדל או bred במתקן (ראה טבלת חומרים). 2 שעות לפני הניתוח, לנהל מינון IP 40 מ"ג/ק"ג של L-NAME.
  2. עכברים מרדימים עם הזרקת IP של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג של קסילאזין (ראו טבלת חומרים) מדוללים ב-PBS. אשר הרגעה נאותה על ידי היעדר רפלקס צביטת בוהן ולהמשיך ניטור קצב הנשימה במהלך ההליך.
    1. יש להסיר את השיער מהידיים האחוריים והמפשעות הדו-צדדיים באמצעות מזמרה ו/או קרם דפילטורי. מקם את החיה תחת מיקרוסקופ כירורגי supine; להרחיב ולהדביק את הגפיים במקום. לחטא את השדה הכירורגי על ידי החלת היקף פתרון povidone-יוד לאתר הניתוח.
  3. תחת הגדלה של פי 10-20, השתמש במספריים או באזמל כדי לבצע חתך של 1 ס"מ לאורך קמט המפשעה רק נחות מהרצועה המפשעתית. השתמשו במלקחיים עדינים ובמוליך קצה כותנה סטרילי כדי לנתח בבוטות את כרית השומן המפשעתית לרוחב מהרצועה המפשעתית ולחשוף את נדן הירך הבסיסי, כך שעורק הירך, הווריד והעצב מזוהים בבירור (איור 1).
  4. בעזרת מלקחיים עדינים, חודרים את נדן הירך. בזהירות לצחצח את עצב הירך הרחק מעורק הירך. זהה את ההמראה של ענף ההקפה לרוחב של עורק הירך (LCFA) עמוק לעצב הירך (איור 1).
    1. המשך עם electrocoagulation של עורק הירך הווריד רק קרוב LCFA על ידי הפעלת מכשיר הצריבה (ראה טבלת חומרים) ויצירת קשר בעדינות עם כלי הדם בתנועה מצד לצד, להבטיח כי עצב הירך מבודד היטב ונשאר מוגן מפני פגיעה תרמית. חלקו את מקטע כלי הדם הקרוש במספריים.
  5. המשך עם החשיפה של עורק הירך דיסטלי וריד על ידי גיוס כרית השומן מפשעתית באופן בינוני. זהה את העורק האפיגסטרי השטחי ואת צומת saphenopopliteal יותר distally.
    1. לנקב את נדן הירך בין שני מקומות אלה ולנתח בזהירות את עצב הירך הרחק מכלי הירך. המשך עם קרישה והעברה של עורק הירך וריד הירך כמתואר בשלב 2.4.1.
  6. להשקות את השדה כירורגי באמצעות מזרק מלא PBS סטרילי. להשיג hemostasis על ידי החלת לחץ עדין עם אפליקטור קצה כותנה במשך 3-5 דקות לכל אזורים של דימום.
    1. המשך עם סגירת החתך באמצעות תפר 5-0 נספג בצורה רציפה פשוטה. תן מנה תת עורית של 1 מ"ג/ק"ג של buprenorphine בשחרור מתמשך (ראה טבלת חומרים) להקלה על הכאב לאחר הניתוח.
  7. אשר אובדן זלוף משטח כף הרגל באחוריים הקשורים על ידי LDPI (ראה טבלת חומרים). בעוד עדיין מורדם, למקם את החיה על כרית קצף כהה במצב נוטה מתחת למכונת LDPI ולהשתמש לולאות של סרט חשמלי כדי לאבטח את הרגליים במקום.
    1. המשך עם LDPI של רגליים דו-צדדיות. לאחר השלמת הסריקה, צייר החזר השקעה סביב כל משטח כף רגל וקבל את ערכי השטף הממוצעים.
    2. חשב את מדד הזלוף כיחס בין ערכי השטף הממוצעים ממשטח הרגליים הקשור למשטח שאינו קשור. ודא שמדד הזלוף קטן מ- 0.1.
  8. העבר את החיה בחזרה לכלוב נקי עם כרית חימום או מנורה תקורה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הליבה. ודאו החלמה מלאה מהרדמה לפני העברת עכברים בחזרה למתקן לבעלי החיים.

3. ניהול לאחר הניתוח של L-NAME וניטור של נמק אחורי

  1. בימים שלאחר הניתוח 1-3, לנהל תוספת של 40 מ"ג/ק"ג מינון IP של L-NAME לכל בעל חיים. יחד עם זאת, להעריך בזהירות את כף הרגל מן האיבר האיסכמי.
  2. לכמת את מידת האיסכמיה והנמק האחוריים באמצעות ציון איסכמיה הינדימב של פייבר9. ציונים 1-5: מספר מסמרים איסכמיים; ציונים 6-10: 1-5 ספרות איסכמיות; ציונים 11 ו -12: ניוון רגל חלקי ומלא. הקלט ציוני פייבר בימים שלאחר הניתוח 1-3 ולאחר מכן שבועי.

4. הכנת DII ופתרונות עבודה לתזוזת בעלי חיים

  1. להכנת פתרון מלאי DiI, יש להמיס 100 מ"ג גבישי DiI (ראו טבלת חומרים) ב-16.7 מ"ל של 100% אתנול. מכסים בנייר אלומיניום ומשאירים על משטח נדנדה למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר.
  2. כדי להכין את הדילול, להמיס 50 גרם של גלוקוז ב 1,000 מ"ל של מים מזוקקים כדי להניב פתרון גלוקוז 5%. סנן באמצעות מסנן עליון של בקבוק 0.22 מיקרומטר. ערבבו פתרונות PBS ו-5% גלוקוז ביחס של 1:4 כדי להכין פתרון דילול עבודה.

5. התקנת ציוד וזלוף DiI

  1. הפוך פתרון עבודה DiI על ידי הוספת 200 μL של פתרון מלאי DiI ל 10 מ"ל של פתרון דילול עובד (מוכן בשלב 4.2) מיד לפני השימוש. לחץ ביד כדי לערבב היטב.
  2. חבר שניים או שלושה עצירות תלת-כיווניות ומחט פרפר 25 גרם בסדרה. הכינו מזרקים של 10 מ"ל עם 4 מ"ל של PBS, 10 מ"ל של פתרון DiI ו-10 מ"ל של 10% פורמלין ניטרלי עם חוצץ (ראו טבלת חומרים).
  3. חבר את המזרק עם פורמלין ליציאת הזרימה הפרוקסימלית והזריק את הפתרון לשטיפת אוויר מהקו; סובב את העצירה כדי לסגור את הנמל. חזור על אותו הליך ברצף, חיבור המזרקים עם DiI ולאחר מכן PBS ליציאות הזרימה האמצעית והדיסטלית, בהתאמה, תוך הקפדה לשטוף את כל בועות האוויר דרך הרכבת stopcock.
    הערה: ודא כי אין בועות אוויר בחלק כלשהו של הרכבת stopcock או צינורות. בועות אוויר יכולות לחסום עורקים קטנים במהלך זלוף וכתוצאה מכך הפצת DiI תוך וסקולרית לקויה ותוצאות הדמיה נפגעות.
  4. לאחר השלמת ההתקנה, להרדים את החיה על ידי מנת יתר CO2 בתא אינדוקציה.
  5. מניחים את החיה להיות perfused במצב supine על כרית סופגת ו axillae מאובטח וגפיים תחתונות עם מחטים.
  6. באמצעות מספריים, לעשות חתך רוחבי כדי לפתוח את חלל הבטן. לחשוף ולאחר מכן לחלק את הסרעפת השמאלית והימנית כדי לגשת לחלל בית החזה.
    1. חותכים את דופן החזה משני צדי עצם החזה מהצלעות התחתונות לצלע הראשונה או השנייה, תוך הימנעות מעורקי בית החזה הפנימיים (החלביים) באופן בינוני. השתמש בהמוסטט (ראה טבלת חומרים) כדי לתפוס את הקצה התחתון של עצם החזה ולשקף אותו לכיוון ראשו של בעל החיים כדי לחשוף את חלל בית החזה.
  7. זהה את החדר השמאלי, שנראה בהיר יותר בצבעו מאשר החדר הימני. לאחוז בעדינות את הלב עם מלקחיים קהים ולהכניס את מחט הפרפר לחדר השמאלי.
    1. השתמש במספריים או מחט 18 גרם כדי לנקב את האטריום הנכון, ומאפשר פתרונות דם וזלוף לחזור ללב לנקז. לייצב את המחט עם יד אחת או שתיים, תוך הקפדה שלא לנקב בשוגג את החדר הימני ולפרוע את ריאתי ולא מחזור מערכתי.
  8. פתחו את היציאה למזרק עם PBS והזריקו ידנית 2-4 מ"ל בקצב של 1-2 מ"ל/דקה למשך 1-2 דקות כדי לשטוף דם ממערכת כלי הדם. להבטיח זלוף מוצלח על ידי התבוננות דימום מן האטריום הימני. לאחר ההזרקה, סגור את היציאה של מזרק PBS.
  9. פתחו את היציאה למזרק עם DiI והזריקו 5-10 מ"ל בקצב של 1-2 מ"ל/דקה למשך 5 דקות. נטר את האוזניים, האף וכפות הידיים שאמורים להפוך ורודים מעט עם הזרקת פתרון DiI. לאחר ההזרקה, סגור את היציאה של מזרק DiI ולחכות 2 דקות כדי לאפשר שילוב של הצבע לפני הזרקה של קבוע.
  10. פתחו את הנמל למזרק עם פורמלין והזריקו 5-10 מ"ל בקצב של 1-2 מ"ל/דקה למשך 5 דקות. לאחר ההזרקה, להסיר את המחט מהחדר השמאלי ולהמשיך לקצור את רקמות העניין.
  11. באמצעות מספריים כבדים, לפרוק את השוקה בקרסול, הפרדה מוחלטת את הרגליים השמאלית והימנית מן הרגליים התחתונות. מניחים רגליים שנקטפו בצלחת של 6 או 12 בארות עם 1-2 מ"ל של תמיסת פורמלין של 10%. עוטפים את הצלחת בנייר כסף ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות בלילה.

6. הכנת רקמת משטח כף הרגל למיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלי

  1. למחרת, החלף את הפתרון המקבע בצלחת של 6 או 12 בארות עם 1-2 מ"ל של PBS לבאר.
  2. כדי לפשוט את כף הרגל, ראשית, לעשות חתך אורך עם אזמל על ההיבטים plantar ו הגב של כף הרגל. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים שיניים hemostat קטן, להסיר בזהירות את כל העור מכף הרגל וספרות, לא לפגוע ברקמות הרכות הבסיסיות.
  3. המשך הרכבה והדמיה של רקמות, רצוי בתוך 1-2 ימים של זלוף וקציר. לחלופין, החזירו את משטחי הרגליים לצלחות של 6 או 12 בארות עם 1-2 מ"ל של PBS; לכסות בנייר כסף ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על פלואורסצנטיות עד חודש אחד.
  4. כדי להרכיב רקמות, למקם בנפרד את הרגליים בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם כרית ביופסיה קצף מקופל על עצמו (פעם או פעמיים בהתאם לעובי הרקמה) בכל קצה (ראה טבלת חומרים). השתמש בשני מהדקי קלסר קטנים כדי לדחוס את שקופיות הזכוכית יחד בכל קצה (עובי סופי כ 1 מ"מ).
    הערה: רקמות עבות יותר ידרשו זמני סריקה ארוכים יותר. ניתן לדחוס את לוח הרגליים העור בין שקופיות זכוכית יום אחד לפני ההדמיה כדי להפחית את עובי הרקמה.

7. מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקל

  1. היכונו למפגש ההדמיה: הפעילו את מערכת ההדמיה והפעילו את תוכנת הרכישה (ראו טבלת חומרים). השתמש במטרה של הגדלה נמוכה/צמצם מספרי נמוך (לדוגמה, x5/0.15) כדי ללכוד תמונות מכיוון שלעדשות הגדלה נמוכות יותר יש בדרך כלל מרחקי עבודה ארוכים יותר הנדרשים לניסוי זה.
  2. לחץ על כן לתיבת הדו-שיח הפעלת שלב. הפעל את הלייזר 561 ננומטר בכרטיסיה תצורה. במסך הראשי, הפעל נתיב קרן גלוי על-ידי לחיצה על לחצן גלוי . הגדר גלאי לטווח של 570-600 ננומטר על-ידי לחיצה על תיבת הסימון הפעילה המתאימה.
  3. בחר בסמל סריקת אריחים בכרטיסיה רכישה > והגדר את הרזולוציה הרצויה (512 x 512 x 512 או 1024 x 1024 x 1024).
  4. מקם דגימת רקמה יבשה (ללא תוספת מים או PBS) דחוסה בין שקופיות זכוכית על במת המיקרוסקופ ומביאה את הרקמה לפוקוס.
  5. כדי להגדיר את גבולות הסריקה, נווט לפינה השמאלית העליונה או הימנית של המדגם. בכרטיסיה רכישה, תחת תפריט סריקת אריחים, לחץ על לחצן סמן מיקום . נווט לפינה הנגדית (ימינה או שמאלה, בהתאמה) ולחץ שוב על לחצן סמן מיקום .
  6. כדי להגדיר את עומק מחסנית Z, לחץ על לחצן Live בפינה הימנית התחתונה של המסך ונווט למרכז המדגם. השתמש בידית ציר z כדי לגלול לתחתית המדגם.
  7. בכרטיסיה רכישה, תחת תפריט Z-Stack, לחץ על לחצן התחל . גלול אל החלק העליון של המדגם ולחץ על לחצן סיום . לחץ על גודל שלב Z והגדר את הערך הרצוי (למשל, 50 מיקרומטר).
  8. בפינה השמאלית התחתונה של המסך, לחץ על התחל כדי להתחיל ברכישת תמונה.

8. ניתוח כמותי ושחזור תלת מימדי של כלי הדם של משטח כף הרגל

  1. הורד והתקן את הגרסה העדכנית ביותר של פיג'י (ImageJ) כמו גם את תוסף ניתוח כלי שיט20. פתחו קובצי תמונה מיקרוסקופיים בפיג'י, שישלבו סדרות Z בודדות לערימות Z שניתן להציג בציר z באמצעות המחוון בתחתית התמונה.
  2. בחרו בתמונת מחסנית Z המורכבת ולאחר מכן, תחת התפריט 'תמונה', בחרו 'ערימות' > Z Project ליצירת הקרנה דו-ממדית. לאחר מכן, המר את הקרנת Z לבינארית תחת תהליך > בינארי > הפוך בינארי.
  3. הפעל את תוסף צפיפות כלי הדם תחת תוספים > צפיפות כלי הדם. כאשר תתבקש, השתמש בסמן כדי לעקוב אחר החזר השקעה סביב היקף לוח הרגליים והספרות. שימו לב לצפיפות כלי הדם המדווחת, המתבטאת כאחוז מהחזר ההשקעה (שבר באזור כלי הדם).
  4. ליצירת שחזורים תלת-ממדיים בפיג'י, בחרו 'ערימות' >'פרוייקט תלת-ממדי' והגדירו את ציר הסיבוב, הזווית והמהירות הרצויים מתחת לתפריט 'תמונה'. לחלופין, בחרו ' מציג עוצמת הקול' מתפריט 'תוספים ' כדי להציג תמונות באופן חזותי כפרוסות או לטפל בשחזור בצירים הרצויים.
  5. לעיבוד תלת-ממדי מעורב יותר, השתמש בתוכנת ניתוח ועיבוד תמונה חלופית (ראה טבלת חומרים). המר קבצים לתבנית התוכנה הרצויה ותפר סריקות אריחים בודדות באמצעות פונקציונליות תפירת האריחים.
  6. לאחר תפירת סריקות אריחים בודדות יחד, פתח את הקובץ המורכב והמשיך בעיבוד משטח עוצמת הקול. לחץ על הוסף משטח חדש כדי לפתוח את אשף יצירת פני השטח ולהשתמש בחצים כדי לעבור בין תפריטים, ובמיוחד להגדיר את ההחזר על ההשקעה ואת עוצמת הסף. לאחר שמרוצה מעיבוד פני השטח, השתמש בפונקציונליות ההנפשה כדי ליצור סרטוני וידאו של התמונה המעובדת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול זה מפרט אמצעי אמין של גרימת איסכמיה ואובדן רקמות בפנקס הרגליים murine באמצעות שילוב של עורק הירך וקרישת ורידים עם ניהול L-NAME, מעכב סינתאז תחמוצת החנקן, בעכברים FVB רגישים. איור 1 מפרט את האנטומיה של כלי הדם האחוריים של מורין ומציין את האתרים של עורק הירך וקרישת הוורידים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעוד איסכמיה אחורית עכבר הוא המודל הפרה קליני הנפוץ ביותר ללמוד neovascularization ב PAD ו- CLTI, יש שונות משמעותית חומרת איסכמיה והתאוששות בהתאם לזן העכבר הספציפי המשמש ואת האתר, מספר, ואת השיטה של הפרעה עורקית. השילוב של קשירת עורק הירך וניהול IP של L-NAME יכול באופן אמין לגרום נמק אחורי בעכברים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל- Z-J L ו- OC V מהמכונים הלאומיים לבריאות [R01HL149452 ו- VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. אנו מודים גם למתקן המיקרוסקופיה והדמיה של פרויקט מיאמי לריפוי שיתוק בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מיאמי על מתן גישה לתוכנת ניתוח ועיבוד התמונות שלהם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Binder clips (small)Office supply store
Buprenorphine (sustained-release)
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)VWR10148-584
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)InvitrogenD282
Electrocautery deviceGemini Cautery System5917
Ethanol (100%)VWR89370-084
Fiji (ImageJ) softwareNIHUsed version 2.1.0. Free download, no license required.
Foam biopsy padsFisher Scientific22-038-221
Formalin (neutral buffered, 10%)VWR89370-094
FVB miceJackson Laboratory001800
GlucoseSigma-AldrichG7528
HCl (1 M)Sigma-Aldrich13-1700
Imaris softwareOxford InstrumentsUsed version 9.6.0.
IsofluranePivetalNDC 46066-755-04
KClSigma-AldrichP9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)Sigma-AldrichN5751
Laser Doppler perfusion imagerMoorLDImoorLDI2-HIRUsed moorLDI V5 software.
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)VWR48311-703
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS7653
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaOHSigma-AldrichS8263
Needles (27 G)BD305109
Povidone-iodine swabstick (10%)MedlineMDS093901ZZ
Surgical instrumentsRoboz SurgicalFine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.
Suture (5-0 absorbable)DemeTECHG275017B0P
Syringes (10 mL)BD305482
Three-way stopcocksCole-Parmer19406-49
Vascular Analysis PluginFree download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).
Xylazine

References

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  2. Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
  3. Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
  4. Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
  5. Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
  6. Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
  7. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035(2009).
  8. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  9. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
  10. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
  11. Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
  12. Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
  13. Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
  14. McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
  15. Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
  16. Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
  17. Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
  18. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
  19. Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
  20. Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106(2015).
  21. Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  22. Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
  23. Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
  24. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166(2016).
  25. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
  26. Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
  27. Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047(2013).
  28. Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
  29. Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
  30. Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181L NAMEDiI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved