JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משופרת להגברת הביטוי המשותף של פקטורי שעתוק PDX1 ו-NKX6.1 באבות לבלב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בחד-שכבתיים מישוריים. זה מושג על ידי חידוש המטריצה הטרייה, מניפולציה של צפיפות התא, וניתוק התאים האנדודרמליים.

Abstract

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) הם כלי מצוין לחקר התפתחות מוקדמת של הלבלב ולחקר התורמים הגנטיים לסוכרת. תאים מפרישי אינסולין שמקורם ב-hPSC יכולים להיווצר לצורך טיפול בתאים ומידול מחלות, עם יעילות מוגבלת ותכונות תפקודיות. אבות לבלב שמקורם ב-hPSC שהם מבשרי תאי בטא ותאים אנדוקריניים אחרים, כאשר מבטאים במשותף את שני גורמי השעתוק PDX1 ו-NKX6.1, מציינים את אבות האב לתאי בטא מתפקדים המפרישים אינסולין הן במבחנה והן ב-in vivo. אבות לבלב שמקורם ב-hPSC משמשים כיום לטיפול בתאים בחולי סוכרת מסוג 1 כחלק מניסויים קליניים. עם זאת, ההליכים הנוכחיים אינם מייצרים שיעור גבוה של NKX6.1 ואבות לבלב, מה שמוביל לייצור משותף של תאים אנדוקריניים לא מתפקדים ומעט תאים מגיבים לגלוקוז ומפרישי אינסולין. עבודה זו פיתחה אפוא פרוטוקול משופר ליצירת אבות לבלב שמקורם ב-hPSC, אשר ממקסמים את הביטוי המשותף של PDX1 ו-NKX6.1 במונו-שכבה דו-ממדית. הגורמים כגון צפיפות תאים, זמינות של מטריצה טרייה ודיסוציאציה של תאים אנדודרמליים שמקורם ב-hPSC מווסתים שהגדילו את רמות PDX1 ו-NKX6.1 באבות הלבלב שנוצרו וצמצמו את המחויבות לשושלת הכבד החלופית. המחקר מדגיש כי מניפולציה של הסביבה הפיזית של התא במהלך התמיינות במבחנה יכולה להשפיע על מפרט השושלת ועל ביטוי הגנים. לכן, הפרוטוקול הממוטב הנוכחי מאפשר את הדור הניתן להרחבה של PDX1 ו- NKX6.1 המבטאים צאצאים משותפים לטיפול בתאים ומידול מחלות.

Introduction

סוכרת היא הפרעה מטבולית מורכבת המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם. תוספת של אינסולין נחשבת לאפשרות הטיפול היחידה בסוכרת. מקרים מתקדמים יותר מטופלים באמצעות טיפול בהחלפת תאי בטא, המושג באמצעות השתלת לבלב שלם או איים 1,2. מספר סוגיות מקיפות את הטיפול בהשתלה, כגון הגבלה בזמינות ובאיכות הרקמה, פולשנות של הליכי השתלה בנוסף לצורך המתמשך בתרופות מדכאות חיסון. זה מחייב את הצורך בגילוי אפשרויות חדשניות ואלטרנטיביות לטיפול בתחליפי תאי בטא 2,3. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) התגלו לאחרונה ככלי מבטיח להבנת הביולוגיה של הלבלב האנושי וכמקור לא ממצה ואולי מותאם אישית יותר לטיפול בהשתלות 4,5,6,7. hPSCs, כולל תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs), הם בעלי יכולת התחדשות עצמית גבוהה ומעוררים כל סוג רקמה של גוף האדם. hESCs מופקים ממסת התא הפנימית של העובר, ו- hiPSCs מתוכנתים מחדש מכל תא סומטי 4,8.

פרוטוקולי התמיינות מכוונים ממוטבים ליצירת תאי בטא בלבלב מ-hPSCs המכוונים ברצף hPSCs דרך שלבי התפתחות הלבלב. פרוטוקולים אלה מייצרים אורגנואידים של איון שמקורם ב-hPSC. בעוד שהם השתפרו מאוד בהגדלת חלקם של תאי בטא בלבלב בהם, היעילות של פרוטוקולים משתנה מאוד. זה לא עולה ליותר מ ~ 40% של NKX6.1+/אינסולין+ או C-פפטיד + תאים 5,9,10,11,12,13. עם זאת, תאי הבטא שנוצרו אינם זהים לחלוטין לתאי הבטא האנושיים הבוגרים מבחינת פרופילי השעתוק וחילוף החומרים שלהם ותגובתם לגלוקוז 4,5,14. תאי הבטא שמקורם ב-hPSC חסרים ביטוי גנטי של סמני תאי בטא מרכזיים כגון PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 ו-KCNK3 בהשוואה לאיים5 של בני אדם בוגרים. בנוסף, תאי הבטא שמקורם ב-hPSC הפחיתו את איתות הסידן בתגובה לגלוקוז. הם מזוהמים בתאים הפוליהורמונליים שנוצרו במשותף שאינם מפרישים כמויות מתאימות של אינסולין בתגובה להעלאת רמות הגלוקוז5. מצד שני, אבות לבלב שמקורם ב-hPSC, שהם מבשרי איונים, יכולים להיווצר בצורה יעילה יותר במבחנה בהשוואה לתאי בטא, וכאשר הם מושתלים ב-vivo, הם יכולים להבשיל לתאי בטא מתפקדים המפרישים אינסולין15,16. ניסויים קליניים מתמקדים כיום בהוכחת בטיחותם ויעילותם בעת השתלה בנבדקי T1D.

יש לציין כי ביטוי של גורמי השעתוק PDX1 (הומיאובוקס של הלבלב ותריסריון 1) ו- NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) בתוך אותו תא אב בלבלב הוא חיוני למחויבות כלפי שושלת תאי בטא5. אבות לבלב שאינם מצליחים לבטא את NKX6.1 מולידים תאים אנדוקריניים פוליהורמונליים או תאי בטא לא מתפקדים17,18. לכן, ביטוי משותף גבוה של PDX1 ו- NKX6.1 בשלב האב של הלבלב חיוני ליצירת מספר רב של תאי בטא פונקציונליים. מחקרים הראו כי גוף עוברי או תרבית תלת-ממדית משפרים את PDX1 ו-NKX6.1 אצל אבות לבלב שבהם התאים המתמיינים מצטברים, ונעים בין 40%-80% מאוכלוסיית PDX1+/NKX6.1+12,19. עם זאת, בהשוואה לתרביות השעיה, תרביות התמיינות דו-ממדיות הן חסכוניות יותר, ישימות ונוחות יותר ליישום בקווי תאיםמרובים 5. לאחרונה הראינו שתרביות בידול חד-שכבתי מניבות יותר מ-90% מ-PDX1+/NKX6.1+ המבטא במשותף20,21,22 אבות לבלב שמקורם ב-hPSC. השיטה המדווחת העניקה יכולת שכפול גבוהה לאבות הלבלב שנוצרו ומנעה מפרטי גורל חלופיים כגון שושלת הכבד21. לכן, כאן, פרוטוקול זה מדגים שיטה יעילה ביותר להתמיינות של hPSCs למבשרי תאי בטא בלבלב המבטאים במשותף PDX1 ו- NKX6.1. שיטה זו משתמשת בטכניקה של ניתוק אנדודרם שמקורו ב-hPSC ומניפולציה של צפיפות התא, ולאחר מכן איתות FGF ורטינואידי מורחב, כמו גם עיכוב קיפוד כדי לקדם ביטוי משותף של PDX1 ו-NKX6.1 (איור 1). שיטה זו יכולה להקל על דור מדרגי של מבשרי תאי בטא בלבלב שמקורם ב-hPSC לטיפול בהשתלות ומידול מחלות.

Protocol

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר המוסדי המתאים ובוצע על פי הסטנדרטים האתיים שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר או סטנדרטים אתיים דומים. הפרוטוקול אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של HMC (מס' 16260/16) ומכון המחקר הביו-רפואי של קטאר (QBRI) (מס' 2016-003). עבודה זו ממוטבת עבור hESCs כגון H1, H9 ו- HUES8. דגימות דם התקבלו מאנשים בריאים מבית החולים חמד מדיקל קורפוריישן (HMC) בהסכמה מדעת מלאה. ה- iPSCs מופקים מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי (PBMCs) של בקרה, אדם בריא23.

1. הכנת המדיה התרבותית

  1. הכנת תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC)
    1. הכן מדיית תרבית hPSC מהמדיום הזמין מסחרית לשמירה והרחבה של תאי גזע עובריים אנושיים על ידי השלמת 100 יחידות/מ"ל של פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים). Aliquot ולאחסן את המדיה המלאה ב -20 °C לטווח ארוך או 4 °C לשימוש מיידי.
  2. הכן מדיית בידול שלב 1 (עבור אנדודרם סופי (DE)).
    1. הכינו את המדיה הבסיסית ממצע MCDB 131 על ידי תוספת של 0.5% אלבומין בסרום בקר ללא חומצות שומן (FFA-BSA), 1.5 גרם/ליטר של סודיום ביקרבונט (NaHCO3), 10 מ"מ גלוקוז, 2 מ"מ של גלוטמקס, 100 יחידות/מ"ל של פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים). מסננים את המדיה המוכנה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הכינו מדיה שלב 1 המכילה CHIR99021 מהמדיה הבסיסית (שהוכנה בשלב 1.2.1) על ידי חימום המדיה הבסיסית ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן תוספת של 2 מיקרומטר של CHIR99021, 100 ננוגרם/מ"ל של אקטיבין A, 10 מיקרומטר של מעכב סלע (Y-27632), ו-0.25 מ"מ של ויטמין C (ראו טבלת חומרים). ערבבו היטב את חומרי הגלם המשלימים וכסו אותה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור.
      הערה: מדיה זו תשמש רק ביום הראשון של ההבחנה.
    3. הכינו את המדיה של שלב 1 ללא CHIR99021 מהמדיה הבסיסית על ידי חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והוספתה ל-100 ננוגרם/מ"ל של Activin A ו-0.25 מ"מ של ויטמין C וערבבו היטב.
      הערה: ניתן להוסיף למדיה זו 5 ננוגרם/מ"ל של FGF או FGF2 בסיסיים. מדיה זו תשמש לימים הנותרים של שלב 1.
  3. הכן את מדיית ההבחנה של שלב 2 (עבור שפופרת מעיים פרימיטיבית; PGT).
    1. הכן את מדיית ההבחנה של שלב 2 המכילה מעכב רוק מהמדיה הבסיסית על ידי חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ותוספת של 50 ננוגרם/מ"ל של FGF10, 50 ננוגרם/מ"ל של NOGGIN, 0.25 מיקרומטר של CHIR99021, 10 מיקרומטר של Y-27632 (מעכב סלע), ו-0.25 מ"מ של ויטמין C.
      הערה: מדיה זו משמשת ביום הדיסוציאציה של תאים אנדודרמליים.
    2. הכן את מדיית ההבחנה של שלב 2 ללא מעכב רוק לאחר אותו הליך עבור המדיה שהוכנה בשלב 1.3.1, למעט מעכב הסלע.
      הערה: מדיה זו משמשת ביום השני של שלב 2.
  4. הכן את מדיית ההבחנה של שלב 3 (עבור פורגוט אחורי).
    1. יש להכין מדיית DMEM המכילה 4.5 גרם לליטר גלוקוז, ולאחר מכן ליטול תוסף עם 1% של פניצילין-סטרפטומיצין ו-2 mM של גלוטמקס ולהשתמש כמדיה בסיסית בשלבים 3 ו-4.
    2. יש לחמם את מדיית ה-DMEM (שהוכנה בשלב 1.4.1) ולהשלים עם 2 מיקרומטר של חומצה רטינואית, 0.25 מיקרומטר של SANT-1, 50 ננוגרם/מ"ל של FGF10, 50 ננוגרם/מ"ל של NOGGIN, 0.25 mM של ויטמין C ותוסף 1% B27 ללא ויטמין A (ראו טבלת חומרים).
      הערה: מדיה זו משמשת במשך 4 ימים של שלב 3 עבור P2-D (פרוטוקול 2, ממוטב, מנותק) ויומיים של שלב 3 עבור P1-ND (פרוטוקול 1, לא ממוטב, לא מנותק).
  5. הכן את מדיית ההבחנה של שלב 4 (עבור אבות הלבלב).
    1. הוסף DMEM המכיל 4.5 גרם/ליטר גלוקוז עם 100 ננוגרם/מ"ל של EGF, 10 מ"מ של ניקוטין-אמיד, 50 ננוגרם/מ"ל של NOGGIN, 0.25 מ"מ של ויטמין C ו-1% של תוסף B27 ללא ויטמין A (ראו טבלת חומרים). השתמש במדיה זו לכל הימים של שלב 4.
      הערה: שמור על כל הריאגנטים בטמפרטורות המתאימות, ויש לצטט את כל הציטוקינים והריאגנטים הרגישים. הפשירו את הריאגנטים המצוטטים והוסיפו לתקשורת הבסיסית בזמן שינוי מדיית ההבחנה. ההרכבים של מדיות ההבחנה השונות מובאים בטבלה 1.

2. הכנת כלים מצופים ממברנת מרתף

  1. הפשרה מסחרית של מטריצת מרתף (ראו טבלת חומרים) ואליקוט על קרח; להקפיא את aliquots ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. לפני הציפוי של כלי תרבית הרקמה, הפשירו את האליקוטים הקפואים על הקרח. הוסף נפח מתאים של תמיסת מטריצת הממברנה למדיית KO-DMEM/F-12 המצוננת (KnockOut DMEM/F-12) (ראה טבלת חומרים) כדי להשיג את הריכוז המדולל הרצוי ולערבב היטב. אחסן את תמיסת המטריצה המדוללת ב-4 °C לשימוש מיידי.
  3. מכסים את פני השטח של הלוחות המטופלים בתרבית רקמה (ראו טבלת חומרים) בתמיסת מטריצת ממברנה מדוללת ומניחים את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפחות לפני ציפוי התאים. השתמש בדילול של 1:50 של תמיסת מטריצת הממברנה ב- KO-DMEM/F-12 לציפוי תאים לניסוי התמיינות לבלב ו- 1:80 להרחבת hPSCs לא מובחנים.

3. תרבות של hPSCs לא מובחנים

  1. מעבירים את ה-hPSCs כאשר המושבות מגיעות למפגש של 70%-80%.
  2. כדי לעבור, שטפו את ה-hPSCs פעם אחת עם PBS חם, שאפו באמצעות שואב אבק נייד בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה, והוסיפו 0.5 mM של תמיסת EDTA ב-PBS כדי לכסות את פני השטח של המושבה. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך דקה אחת או עד שגבולות המושבות מתנתקים מפני השטח של הצלחת.
  3. הסר תמיסת EDTA ואסוף את המושבות המתנתקות עם אמצעי תרבית hPSC באמצעות מיקרופיפט P1000. צנטריפוגה התאים שנאספו ב 128 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופר-נטנט ולהשלים את התאים עם מדיית תרבית hPSC המכילה 10 מיקרומטר של Y-27632 (מעכב סלע)23,24.
    הערה: העבירו את ה-hPSCs ביחס של 1:3 לפחות על כלים מצופים מטריצת ממברנה 1:80. עם זאת, עבור ניסויי התמיינות, צלחת את hPSCs על מנות מצופות 1:50.

4. אינדוקציה של התמיינות אנדודרם סופית (DE) ב- hPSCs (שלב 1)

  1. כאשר מושבות hPSC מגיעות למפגש של 70%-80%, שטפו אותן פעמיים עם PBS חם ושאפו באמצעות שואב אבק נייד בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה כדי להתחיל בהתמיינות שלב 1.
  2. הוסיפו מדיום בידול שלב 1 המכיל CHIR99021 (משלב 1.2.2) למושבות, 2 מ"ל לכל צלחת של 6 בארות, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  3. למחרת, החלף את המדיה המושקעת במדיום בידול שלב 1 ללא CHIR99021 (שלב 1.2.3).
  4. כל 24 שעות, שאפו את המדיה המושקעת באמצעות שואב אבק נייד בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה והחליפו אותו במדיום בידול שלב 1 רענן ללא CHIR99021.
    הערה: ניתן להאריך את שלב 1 עד 4 ימים. אורכו של שלב 1 תלוי בקו hPSC שבו נעשה שימוש ויש לייעל אותו בהתאם.

5. ניתוח אימונופלואורסצנציה של DE שמקורו ב-hPSC (שלב 1)

  1. עבור אימונופלואורסצנציה, שאפו את המדיה המושקעת באמצעות שואב אבק נייד בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה מהבארות ושטפו פעמיים עם PBS חם. סובבו את הצלחת כדי להיפטר מכל פסולת תאים.
  2. לכסות את פני השטח של בארות עם 4% של paraformaldehyde (PFA) כדי לתקן את תאי DE; לדוגמה, להוסיף 250 uL של PFA לכל באר של צלחת 24 באר. מניחים את הצלחת על שייקר דו-ממדי בגודל 20XG למשך 20 דקות.
  3. לאחר הקיבוע, שטפו את תאי ה-DE בתמיסת מלח עם 0.5% מ-Tween (TBST) (ראו טבלת חומרים) והניחו את הצלחת על השייקר בגודל 20 x גרם למשך 10 דקות. חזור על שלב זה פעם נוספת.
  4. חלחלו לתאים הקבועים על ידי הוספת נפח נדיב של מי מלח שאוגרים בפוספטים עם 0.5% של Triton X-100 (PBST); לדוגמה, להוסיף 1 מ"ל של PBST לכל באר של צלחת 24 באר ולהניח את הצלחת בחזרה על השייקר ב 20 x גרם במשך 20 דקות.
  5. הכינו 5%-6% מה-BSA ב-PBST כמאגר חוסם והוסיפו אותו לתאים המחלחלים. לדגור את הצלחת לפחות 1 שעה בתמיסת החסימה על השייקר.
  6. יש לדלל את הנוגדנים העיקריים כנגד SOX17 ו-FOXA2 יחד (ראו טבלת חומרים) ב-2%-3% BSA בתמיסת PBST. מוסיפים את הנוגדנים המשולבים לתאים חסומים ומניחים את הצלחת על השייקר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במהירות נמוכה עם ניעור עדין.
    הערה: SOX17 ו- FOXA2 הם סמני DEמבוססים היטב 25,26.
  7. למחרת, לשאוף את הנוגדנים העיקריים באמצעות מסנן ואקום נייד לשטוף את הבארות עם TBST שלוש פעמים, כל לשטוף במשך 10 דקות על השייקר.
  8. הכינו דילול של 1:500 נוגדנים משניים מצומדים מסוג אלקסה 488 ו-568 (ראו טבלת חומרים) כנגד המין שבו גודלו הנוגדנים הראשוניים.
  9. מוסיפים את שילוב הנוגדנים המשני לבאר המוכתמת ומכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום להגנה מפני אור. מניחים את הצלחת על השייקר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  10. שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית באמצעות מסנן ואקום נייד ושטפו את הבארות המוכתמות ב- TBST על השייקר למשך 10 דקות, תוך כיסוי הצלחת בנייר כסף. חזור על שלב הכביסה בסך הכל שלוש פעמים.
  11. הכינו דילול של 1 מיקרוגרם/מ"ל של Hoechst 33342 ב-PBS כדי להכתים את הגרעינים. מוסיפים את תמיסת Hoechst לבארות ומניחים את הצלחת על השייקר למשך 2-3 דקות.
  12. שאפו את תמיסת Hoechst באמצעות מסנן ואקום נייד ושטפו את הבארות עם PBS פעמיים.
  13. לבסוף, הוסיפו PBS לתאים המוכתמים ודמיינו אותם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (ראו טבלת חומרים) בחושך. שמור את הצלחת מכוסה בנייר כסף כאשר לא הדמיה כדי למזער את הלבנת הפלואורופור.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בציטומטריה של זרימה כדי להעריך את יעילות DE כמתואר בשלב 9.2.

6. ייצור של צינור המעי הפרימיטיבי (PGT) מ-hPSCs (שלב 2)

הערה: אם ניתוח האימונופלואורסצנציה בשלב 5.13 נקבע כביטוי משותף של SOX17-FOXA2 של 80% ומעלה, הניסוי ממשיך לשלב 2. אם היעילות היא <80%, להאריך את משך שלב 1 עד 4 ימים.

  1. ביום הראשון של שלב 2, נתקו את התאים האנדודרמליים שמקורם ב-hPSC באמצעות TrypLE או Accutase (ראו טבלת חומרים) עבור פרוטוקול P2-D הממוטב. שטפו את התאים הדבקים עם PBS חם והוסיפו 1 מ"ל חמים של תמיסת TrypLE או Accutase לכל באר של צלחת 6 בארות למשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, או עד שהתאים מתחילים להתנתק זה מזה.
  2. נתקו את היריעות המנותקות או את המונו-שכבתיות של התאים בבארות ולאחר מכן אספו אותן יחד בצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל באמצעות מצע בסיסי שלב 1/2 ללא ציטוקינים המכילים לפחות 0.5% מסרום בקר עוברי (FBS) או מסרום נוקאאוט (KOSR) (ראו טבלת חומרים).
  3. סובבו את התאים בטמפרטורה של 800 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופר-נטנט. הוסף 1 מ"ל של PBS סטרילי ו resupress את הכדור לתוך תאים בודדים.
  4. ספור את התאים באמצעות מונה אוטומטי (ראה טבלת חומרים) על-ידי טעינת נפח התאים המומלץ בשקופית התא. סובבו את התאים המחיים ב-800 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופר-נטנט.
  5. יש לתלות את הכדור בנפח המתאים של מדיום התמיינות שלב 2 המכיל מעכב רוק בצפיפות של 2.5-3.5 x 105 תאים לס"מ2.
    הערה: ספירה זו עשויה להסתכם ביחס פיצול של 1:2 עבור רוב שורות התאים, בהתאם לקצב ההתפשטות. הנפח הכולל יהיה 2 מ"ל של מדיה עם תאים מחיים ב 1 באר של צלחת 6 באר.
  6. צלחת את התאים המחודשים על לוחות מצופים מטריצת ממברנה 1:50 (מוכן בשלב 2) ולדגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באינקובטור.
  7. 24 שעות לאחר מכן, החלף את המדיה במדיום בידול שלב 2 ללא מעכב רוק (הוכן בשלב 1.3.2).

7. יצירת פורגוט אחורי מ-hPSCs (שלב 3)

  1. שאפו את מדיית שלב 2 באמצעות שואב אבק נייד בתוך מכסה המנוע של תרביות הרקמה ושטפו את התאים עם PBS חם.
  2. הוסף מדיית התמיינות שלב 3 משלב 1.4 לתאים ודגירה ב- 37 °C, 5% CO2.
  3. לאחר 24 שעות, החלף את המדיה המושקעת במדיית בידול שלב 3 שהוכנה זה עתה. חזור על פעולה זו במשך 4 ימים בסך הכל עבור פרוטוקול P2-D (ממוטב) ויומיים בלבד עבור P1-ND שאינו מנותק.

8. דור של אבות לבלב מ- hPSCs (שלב 4)

  1. לאחר 4 ימים של טיפול שלב 3, לשטוף את התאים עם PBS חם, בעדינות לסובב את הצלחת, ולשאף באמצעות שואב אבק נייד. לאחר מכן, הוסף מדיית התמיינות שלב 4 משלב 1.5 לתאים.
  2. לאחר 24 שעות, החלף את המדיה המושקעת במדיה טרייה של שלב 4. חזור על פעולה זו במשך 4 ימים בסך הכל.

9. הערכת יעילות ההבחנה של יצירת אבות לבלב מ- hPSCs

  1. בצע את ניתוח האימונופלואורסצנציה של אבות הלבלב שמקורם ב- hPSC (שלב 4) לביטוי של PDX1 ו- NKX6.1.
    הערה: PDX1 ו- NKX6.1 הם סמני אב לבלבמבוססים היטב 17,18.
    1. בצעו קיבוע, חדירה, חסימה ודגירה של נוגדנים ושטיפות בהתאם לשלב 5.
    2. הכתימו את אבות הלבלב שמקורם ב-hPSC בשילוב של נוגדני PDX1 ו-NKX6.1 (ראו טבלת חומרים) מדוללים ב-2%-3% BSA ב-PBST.
    3. יש להשתמש ב-1:500 דילולים של נוגדנים משניים מצומדים מסוג Alexa fluor 488 ו-568 (ראו טבלת חומרים).
  2. בצע ניתוח ציטומטריה של זרימה של אבות לבלב שמקורם ב- hPSC לביטוי של PDX1 ו- NKX6.1.
    הערה: ניתוח ציטומטריה של זרימה של סמני לבלב באב הלבלב שנוצר על ידי hPSC מספק דרך לכמת את התאים המבטאים במשותף PDX1 ו- NKX6.1.
    1. בסוף שלב 4, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS חם ולהוסיף מספיק TrypLE או Accutase כדי לכסות את פני השטח של בארות, למשל, 1 מ"ל של TrypLE או Accutase לכל באר של צלחת 6 באר. מניחים את הצלחת באינקובטור למשך 5-7 דקות או עד שהתאים מתנתקים מפני השטח.
    2. יש לנתק את יריעות התאים בתוך הבאר באמצעות מיקרופיפט P1000 לפני איסופם בצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל.
    3. סובבו את התאים באבות הלבלב שמקורם ב-hPSC ב-800 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ואז השליכו את הסופר-נטנט. לשטוף את התאים עם PBS על ידי ניתוקם לתאים בודדים. ספרו את התאים באמצעות מונה אוטומטי (ראו טבלת חומרים) ושימו לב לריכוז במספר התאים למ"ל.
    4. סובבו ב-800 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופר-נטנט. הוסיפו 200 μL של PBS מצונן לכדור והתנתקו.
    5. הוסיפו 2 מ"ל של 80% אתנול מקורר, כשהצינור על מערבולת במהירות נמוכה-בינונית (400 x גרם בטמפרטורת החדר). סוגרים את הפקקים בחוזקה ומניחים את הצינורות מוטים מעט על השייקר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    6. סובבו את התאים ב-800 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ושטפו עם PBS כדי לנתק כל גושים של תאים קבועים.
    7. חסום את התאים הקבועים עם תמיסת BSA של 5%-6% ב-PBST למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר או 4°C בלילה על השייקר.
    8. כתם עבור סמני אב הלבלב בעקבות השלבים הבאים.
      1. להפיץ 2,00,000 תאים לכל מצב, כולל בקרות איזוטיפ מתאימות התלויות בתת-מחלקה IgG של המין המארח של הנוגדן הראשוני, בקרות נוגדנים לא מוכתמות ומשניות בצלחת תחתית V 96-well או צינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
      2. סובבו את הצלחת ב-800 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והפכו את הצלחת בתנועה מהירה כדי להשליך את הסופר-נטנט מבלי לאבד את הכדורים. הכינו דילולים של נוגדנים ראשוניים בתמיסת BSA של 3% (ראו טבלת חומרים).
        הערה: ריכוז הנוגדנים העיקריים יכול להיות בין 1:50 ל-1:200.
      3. דגירה של התאים המוכתמים למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר עם ניעור עדין במהירות נמוכה.
      4. שטפו את התאים המוכתמים ב-TBST שלוש פעמים על ידי הזרמת התאים למעלה ולמטה בבארות. סובבו והשליכו את הסופר-נטנט כמו בשלב 9.2.8.2.
      5. הוסף דילול 1:500 של נוגדנים משניים (נוגדנים מצומדים אלקסה פלואור 488 ו-647) שהוכנו ב-PBS (ראו טבלת חומרים). לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      6. שטפו את התאים המוכתמים ב-TBST לפחות פעמיים על ידי ניתור התאים למעלה ולמטה. סובבו את הצלחת והשליכו את הסופר-נטנט כמו בשלב 9.2.8.2.
      7. אסוף את התאים המוכתמים ב-100 μL לפחות של PBS והעבר אותם לצינורות FACS מוגנים לאור (ראו טבלת חומרים). הפעל את הדגימות במכונת ציטומטריה של זרימה.

תוצאות

התוצאות מראות כי פרוטוקול P2-D ממוטב (איורים 1A) שיפר את יעילות ההתמיינות של אבות הלבלב על-ידי ויסות הביטוי המשותף PDX1 ו-NKX6.1 (איור 2A,B ואיור 3A). בפרט, התוצאות הראו כי דיסוציאציה של תאים אנדודרמליים וציפוי מחדש שלהם על מטריצת ממברנה טרייה ?...

Discussion

עבודה זו מתארת פרוטוקול משופר ליצירת אבות לבלב מ- hPSCs עם ביטוי משותף גבוה של PDX1 ו- NKX6.1. דיסוציאציה וציפוי מחדש של האנדודרם שמקורו ב-hPSC בחצי צפיפות על מטריצה טרייה הביאו ל-PDX1 ו-NKX6.1 גבוהים יותר באבות לבלב שמקורם ב-hPSC.

למרות שקוקטייל גורם הגדילה עבור כל שלב דומה מאוד ל- P1-ND

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מענק מקרן המחקר הלאומית של קטאר (QNRF) (מענק מס'. NPRP10-1221-160041).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24-well culture plates, flat bottom with lidCostar3524
50 mL, conical, centrifuge tubesThermo Scientific339652
6- well culture plates, multidishThermo Scientific140685
AccutaseStem Cell Technologies0-7920
Activin AR&D338-ACReconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonalDSHBF55A12-CDiluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonalAbcamab47308Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit AThermoFisher12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid freeSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucoseThermoFisher41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10R&D345-FGReconstituted in PBS
GlucoseSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
Inverted microscopeOlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
KnockOut SR serum replacementGibco10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C)SigmaA92902Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning354230Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131ThermoFisher10372019
Mouse anti-SOX17ORIGENECF500096Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PESThermoFisher566-0020
NicotinamideSigma72340Reconstituted in distilled water
NOGGINR&D6057-NGReconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBSChemCruzsc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2Cell signaling technology3143Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic AcidSigma AldrichR2625Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632)ReproCell04-0012-02Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILEStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonateSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis SlideInvitrogenT10794
Tali image-based cytometer automated cell counterInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575-038

References

  1. Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
  2. Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
  3. Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
  4. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  5. Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
  6. Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
  7. Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
  8. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  9. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  10. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  11. Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
  12. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  13. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  14. Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
  15. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  16. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  17. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  18. Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
  19. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  20. Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  21. Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
  22. Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
  23. Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
  24. Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
  25. Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
  26. Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
  27. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  28. Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
  29. Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
  30. Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
  31. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  32. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  33. Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
  34. Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
  35. Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
  36. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
  37. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
  38. Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
  39. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved