JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה של 2 פוטונים בחולדות Wistar Fromter במינכן עם גלומרולי פני השטח כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה ממושכת על הדינמיקה והתפקוד של גלומרולרי.

Abstract

יישום שיטות מיקרוסקופיה חדשניות למודלים מתאימים של מחלות בעלי חיים כדי לחקור את הפיזיולוגיה הדינמית של הכליה נותר אתגר. חולדות עם גלומרולי פני השטח מספקות הזדמנות ייחודית לחקור תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית של 2 פוטונים. כימות של זרימת הדם הנימית הגלומרולרית והתפשטות כלי הדם בתגובה לתרופות, חדירות ודלקת הם רק חלק מהתהליכים שניתן לחקור. בנוסף, חולדות מהונדסות, כלומר פודוציטים המסומנים בצבעים פלואורסצנטיים וגישות אחרות של סמנים ביולוגיים מולקולריים, מספקים רזולוציה מוגברת לניטור וכימות ישיר של אינטראקציות חלבון-חלבון והשפעות של שינויים מולקולריים ספציפיים.

בעכברים, אשר חסרים גלומרולי פני השטח לאחר ארבעה שבועות של גיל, חסימת שופכה חד צדדית (UUO) במשך מספר שבועות שימשה כדי לגרום glomeruli פני השטח. מכיוון שמודל אינדוקציה זה אינו מאפשר מחקרים בסיסיים, כימתנו את ההשפעות של UUO על תהליכים גלומרולריים במודל UUO בחולדות Wistar Frömter (MWF) במינכן, שיש להן גלומרולי פני שטח בתנאים פיזיולוגיים. מודל UUO במשך חמישה שבועות או יותר גרם לשינויים משמעותיים במורפולוגיה הכלייתית ברוטו, microvasculature peritubular ו glomerular, כמו גם את המבנה והתפקוד של אפיתליה צינורית. זרימת תאי הדם האדומים הגלומרולריים והפריטובולריים (RBC) ירדה באופן משמעותי (p < 0.01), ככל הנראה בשל העלייה המשמעותית בהיצמדות של תאי דם לבנים (WBCs) בתוך נימים גלומרולריים ופריטובולריים. מקדם הניפוי הגלומרולרי של אלבומין עלה מ-0.015 ± 0.002 ב-MWFs לא מטופלים ל-0.045 ±-0.05 בחולדות UUO MWF בנות 5 שבועות. 12 שבועות של UUO הביאו לעלייה נוספת בצפיפות הגלומרולרית של פני השטח ובמקדם הניפוי הגלומרולרי (GSC) עבור אלבומין. אלבומין פלואורסצנטי שסונן על פני הגלומרולי לא נספג מחדש על ידי הצינוריות הפרוקסימליות. נתונים אלה מצביעים על כך ששימוש ב- UUO כדי לגרום לגלומרולי פני השטח מגביל את היכולת לחקור ולפרש תהליכים גלומרולריים נורמליים ושינויים במחלות.

Introduction

הבנת תהליכים גלומרולריים, במיוחד ביולוגיה של פודוציטים, היא מטרה כבר למעלה מ-50 שנה. חולדות Wistar ממינכן עם גלומרולי פני השטח מילאו תפקיד מרכזי במחקרים אלה, כולל מחקרי מיקרו-פונקטורה, בהבנת היבטים רבים של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים 1,2,3. השימוש במיקרוסקופיה לחקר רכיבים גלומרולריים באופן תוך-ויטאלי היה מוגבל בשל ההשפעות של פוטוטוקסיות עד להופעת מיקרוסקופיה של 2-פוטונים שמזערה את החשיפה הרעילה הזו והגדילה את עומק החדירה 1,2. יחד עם ההתקדמות המהירה בחומרת המחשב ובתוכנה, זה איפשר לימודים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) וארבע-ממדיים (זמן) במשך שעות במסגרתאחת 1,4,5.

כימות זרימת הדם הנימית הגלומרולרית, התפשטות כלי הדם וההתרחבות בתגובה לתרופות, חדירות והשפעות המטען על חדירות ודלקת הם רק חלק מהתהליכים הגלומרולריים שנחקרו. בנוסף, ניתן לזהות את קטע S1 של הצינורית הפרוקסימלית, ואת ההבדלים בהתנהגות של אפיתל צינורי S1 ו- S2 ניתן לכמת 1,4. מחקרים בעכברים, במיוחד עם הזמינות האוניברסלית של מתקנים מהונדסים לעכברים, הובילו להתקדמות מהירה בהבנת הביולוגיה המולקולרית של תהליכי מחלה גלומרולריים. חלבונים בודדים אחראים לתפקוד לקוי של גלומרולרי במחקרי נוקאאוט, במיוחד בכל הנוגע לפרוטאינוריה 6,7,8. עם זאת, השימוש במודלים של עכברים למחקרי הדמיה גלומרולרית הוגבל מכיוון שגלומרולי נמצאים יותר מ-100 מיקרומטר מתחת לפני השטח בזנים הרבים שנחקרו9.

זה הוביל חוקרים לפתח ולהשתמש במודלים של עכברים וכתוצאה מכך גלומרולי פני השטח שניתן לחקור. המודל הנפוץ ביותר הוא השימוש ב- UUOשלם 10,11,12. בתום תקופת ה-UUO המורחבת, ישנם גלומרולי פני שטח רבים בכליות עכברים שניתן לחקור13,14. לא נערך מחקר בסיס או בקרה במחקרי עכברים אלה כדי לקבוע את ההשפעות של UUO ממושך על הביולוגיה הגלומרולרית. מכיוון שמדובר במודל חמור וממושך של פגיעה וכתוצאה מכך פיברוזיס מהיר והרס קליפת המוח10,11,12, שיערנו שתהיה השפעה על תהליכים גלומרולריים ותפקודם. כדי לענות על שאלה זו, חולדות מינכן Wistar Fromter (MWF) עם גלומרולי פני השטח שימשו לחקר פרמטרים של בקרה/בסיס, והממצא הבסיסי הושווה למחקרים גלומרולריים בחולדות MWF לאחר חמישה שבועות של UUO. חקרנו גם חולדות ספראג דאולי (SD) שאין להן גלומרולי פני השטח בעקבות UUO. הממצאים מצביעים על כך ש-5 שבועות של UUO בחולדות MWF ו-SD אכן מגדילים את מספר הגלומרולי על פני השטח. עם זאת, אלה היו גלומרולי לא תקינים עם שינויים ניכרים בזרימת הדם הגלומרולרית, בדלקת ובחדירות המקרומולקולות ובגודלן.

Protocol

כל הניסויים בוצעו על פי המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה.

1. הכנת חולדה מינכן Wistar Frömter או SD לניתוח UUO

  1. הרדימו את החולדה באמצעות איזופלואורן (5% אינדוקציה, 1.5-2.5% תחזוקה), ולאחר מכן גילחו, שטפו וחטאו את אזור הניתוח מספר פעמים בתנועה מעגלית עם קרצוף על בסיס יוד או על בסיס כלורהקסידין ואלכוהול. יש למרוח משככי כאבים ארוכי טווח/שחרור איטי לטיפול בכאבים, בהתאם להנחיות IACUC המוסדיות.
  2. לבצע חתך לאורך קו האמצע באמצעות אזמל; אתר את הכליה השמאלית ושחרר אותה מאיברי הצפק שמסביב.
  3. אתר בזהירות את pedicle הכליות, הכולל את עורק הכליה, הווריד הכליתי, ואת השופכן. הפרד את השופכן מהמבנים האחרים, תוך נקיטת אמצעי זהירות שלא לפגוע במבנה העדין.
  4. באמצעות מלקחיים עדינים, בזהירות לולאה 3-0 תפר סביב השופכן ולקשור אותו, נזהר לא לקרוע אותו. חזור על הליך זה כמה מילימטרים משני צדי הקשר הראשון כדי לקשור קשר שני ולהבטיח חסימה מוחלטת.
  5. לאחר השלמת ההליך, סגור בזהירות את שכבות השרירים העוקבות. לפני סגירת השכבה הסופית, יש להוסיף 2 מ"ל של מלח חם וסטרילי 0.9% לתוך הבטן לפני סגירתו המלאה. סגור את העור החיצוני עם סיכות כירורגיות.
  6. יש למרוח משככי כאבים ארוכי טווח/שחרור איטי לטיפול בכאב ולעקוב מקרוב אחר ההחלמה בהתאם להנחיות IACUC המוסדיות. עקוב מעת לעת לאחר מכן והתכונן להדמיה בסוף השבוע החמישי.

2. סינתזה של אלבומין בסרום עכברוש אדום טקסס (TR-RSA)

  1. שוקלים 100 מ"ג של אלבומין בסרום עכברוש וממיסים אותו ב-6.67 מ"ל של חיץ סודיום ביקרבונט של 0.1 M ב-pH 8.4 בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  2. לבקבוקון של 5 מ"ג של אסטר טקסס רד-X-סוקסינימידיל, יש להוסיף 100 μL של דימתיל פורמיד (DMF, באיכות גבוהה) ומערבולת עד שכל הצבע מומס.
  3. הניחו את תמיסת האלבומין בסרום החולדה על מערבולת במיקום נמוך/בינוני, כך שנפח התמיסה מסתובב הרבה מתחת לחלק העליון של הצינור הפתוח.
  4. מוסיפים את הצבע המומס בזמן שהצינור מתערבב.
  5. קח את הצינור החרוטי של 50 מ"ל, עטוף אותו בנייר כסף, הנח את הצינור על כל נדנדה או רולר, והתסיס לאט במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
  6. בדלי 5 ליטר של 0.9% NaCl עם מוט ערבוב תחת ערבוב עדין, הרטיבו את הקרומים של דיאליזר מתאים במשקל מולקולרי של 50 kDa (קרום עם קליפסים, צינורות ממברנה סגורים או קסטות דיאליזה מתאימים כולם).
  7. טען את תמיסת TR-RSA במערכת הממברנה והצמד אותה לחיבורי הציפה הכלולים בדרך כלל במערכת. הניחו את מיכל ה-5 ליטר עם תמיסת מלח 0.9% /TR-RSA למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (בחדר קר) עם תסיסה עדינה על צלחת ערבוב. החליפו את תמיסת הדיאליזה לפחות שלוש פעמים במהלך 36 השעות הבאות.
  8. נפיחות של הממברנה תגדיל את נפח הפתרון TR-RSA ברור כעת. חלק את המקורי 100 מ"ג על ידי נפח כדי לקבל ריכוז משוער: צבע :חלבון יחס יהיה 1:1. Aliquot לתוך נפחים מתאימים lyophilize לאחסון לטווח ארוך.

3. הכנה להדמיה תוך-ויטלית של 2 פוטונים במיקרוסקופ הפוך

  1. הסירו את הכיסוי של צלחת תחתית של מכסה בקוטר 50 מ"מ (עם קוטר כיסוי של 40 מ"מ) והניחו 8 חתיכות של סרט הדבקה אוטוקלאב בתחתית הפנימית לצד הקצה. צרו חלון ריק בצורת פירמידה, תוך שימוש ב-4 חלקים לכל צד כדי לאפשר לכליה החיצונית להשתלב היטב בחלל זה תוך שמירה על מגע היקפי עם סרט ה-autoclave, ובכך לסייע בצמצום התנועה. התאימו את המרווח בהתאם לגודל החולדה כדי להבטיח את המגע הטוב ביותר עם הכליה.
  2. יש להניח פד תרמי אחד על כל צד של צלחת הכיסוי התחתונה בקוטר 50 מ"מ. ודאו שמשטח החימום מכסה את הבמה.
  3. השתמש במטרה לטבול במים של 40x בזום של 0.75x ובזום של 1.5x כדי להפיק תמונות של 30x ו- 60x, בהתאמה, כדי לאפשר תמונות בהגדלה נמוכה יותר וגבוהה יותר. במידת הצורך, הוסיפו מים למטרה באמצעות מזרק 1 מ"ל עם חתיכה ארוכה של צינורות PE-200 שיכולים להגיע לחלק העליון של המטרה בזווית כלפי מטה כדי למנוע פתילה של טיפת המים במורד הצינור.
  4. השתמש ב-2% עבירות לייזר, כאשר גלאים כחולים, ירוקים ואדומים מוגדרים לרמות קבועות מראש כדי להבטיח עקביות בתמונות בין המחקרים. הגדר את אורך גל העירור ל-800 ננומטר בלייזר המוזכר (ראו טבלת החומרים), אשר יעורר ביעילות את כל הפלואורופורים ששימשו במחקר זה.
    1. השתמש בגלאים חיצוניים (שאינם מרוסנים) כדי לאסוף פליטות כחולות באמצעות צינור פוטומולטיפלייר (PMT) (420-490 ננומטר, רווח 950).
    2. השתמש בגלאי Hyd כדי ללכוד פליטות ירוקות (500-550 ננומטר, רווח 100).
    3. השתמש בגלאי Hyd כדי ללכוד פליטות אדומות (590-660 ננומטר, רווח 200).
    4. התאם את ההיסט ב- PMT (פליטות כחולות) כך שרק פיקסלים בודדים באזורים הריקים של הרקמה יהיו בעלי ערך של אפס.
      הערה: גלאי HyD לפליטות הירוקות והאדומות כוללים כוונון היסט אוטומטי; ניתן לקבוע רק את הרווח.
    5. הגדר את עומק הסיביות ל- 12 סיביות כדי להעניק לתמונות קנה מידה של 4,096 עוצמה בין שחור ללבן.
      הערה: יש צורך להגדיר את הגבולות התחתונים של הגלאים (היסט ב- PMT) כדי לא לכלול ערכים אלה כדי להבטיח איסוף של פליטות בעוצמה נמוכה בתוך החלל של באומן. אם הגדרת הרגישות נמוכה מדי, סמני האזהרה החזותיים יציינו זאת; ערכים אלה מקבלים ערך עוצמה של אפס.
  5. יש לדלל כ-6 מ"ג של אלבומין בסרום Texas-Red-X-Rat לנפח כולל של 1 מ"ל, לטעון את התמיסה במזרק של 1 מ"ל, ולהניח על קטטר i.v בשלב 4.1 לאחר עירוי של Hoechst 33342 בשלב 9.1.

4. הכנה כירורגית להדמיית 2-פוטון תוך-חיונית

  1. הניחו את החולדה המורדמת מראש עם קו גישה ורידי (עצם הירך או הכד) על צדה כאשר האגף השמאלי המגולח פונה כלפי מעלה בצורה שטוחה וישרה על השולחן. ודאו שהכפות הקדמיות נוגעות זו בזו, וכך גם הכפות האחוריות.
  2. בעדינות למשש את האגף השמאלי ממש מתחת לצלעות כדי להרגיש את הכליה כדי לקבוע את המיקום הטבעי בבטן. במידת הצורך, ציירו קו באמצעות סמן קבוע לאורך האזור המגולח, החוצה את מרכז הכליה בכיוון האף אל הזנב.
  3. באמצעות זוג מלקחיים עם שיניים, תפסו את העור והרימו אותו כלפי מעלה כדי להקל על צביטה של קו הסמן הקבוע עם זוג המוסטאטים כדי למחוץ את כלי הדם הבסיסיים ולמנוע דימום בעת ביצוע החתך עם זוג מספריים כירורגיים. חזור על כך עבור שכבת השריר החיצונית הדקה כדי למזער את הדימום.
  4. כדי לבצע את החתך הסופי של שכבת שריר הבטן הפנימית הדקה, repalpate את הכליה כדי להעריך את הגודל והמיקום. מרימים בזהירות את שכבת השריר הפנימית עם זוג מלקחיים ומועכים קו שחוצה את העור מעל הכליה עם המוסטאטים שהוא בערך 1/3מהגודל המשוער של הכליה.
  5. שמירה על האחיזה בשכבת השריר עם המלקחיים, לבצע את החתך הסופי.
    הערה: עדיף לבצע חתך קטן יותר ולהרחיב לפי הצורך מאשר להפוך אותו לגדול מדי, מה שידרוש סגירה חלקית עם תפר.
  6. אחזו בעדינות בכליה על ידי השומן שמסביב. באמצעות שתי הידיים עם מלקחיים בכל יד, לעבוד כדי לאחוז את השומן בקוטב התחתון של הכליה על ידי שימוש בטכניקה של יד ביד כדי לאחוז ולהחזיק את שומן הכליות, עובד כלפי מטה.
  7. לאחר אחיזה איתנה על השומן בקוטב התחתון של הכליה ביד אחת, בעדינות למשוך את השומן, ואם יש צורך, בעדינות רבה לסחוט את הכליה דרך החתך. אם הכליה לא עוברת בקלות, להרחיב את החתך.

5. מיקום החולדה להדמיה

  1. מניחים בזהירות את הכליה החשופה על קצה המנה, עם סיבוב קל כך שצד הבטן של הכליה יוצר קשר עם הכיסוי והצד הגבי פונה הרחק מהקצה.
  2. כדי למזער עוד יותר את התנועה, לקחת שני סטרילי 2 x 2 רפידות גזה, להרטיב אותם עם מלוחים, ולארוז אותם נגד הצד הגבי של הכליה, חיזוק המגע של הצד הבטן של הכליה לקצה.
  3. הבט דרך עינית המיקרוסקופ תחת תאורת אפיפלואורסצנציה באמצעות קוביית רודמין/FITC בעלת מעבר כפול. אם התנועה מזוהה, לבצע התאמות קלות למיקום בזהירות להתאים את גזה, ולוודא שזה לא לדחוף מתחת לכליה. כדי להפחית עוד יותר את התנועה, גלגלו מעט את החולדה, כך שבית החזה יהיה רחוק יותר מהצלחת.

6. רכישת תמונה לניתוח כמותי

  1. סרוק את פני הכליה באמצעות תאורת אפיפלואורסצנציה (שלב 5.3) וסמן את מיקומי הגלומרולי באמצעות התוכנה המשויכת לבקר הבמה הממונע (תכונה של מערכות מודרניות).
  2. עבור כל ערוץ צבע תחת תאורת 2 פוטונים, צלם נפח תלת-ממדי רדוד של החלק העליון של כל גלומרולוס מסומן, שישמש כתמונות הרקע. השתמש בלוח פסאודו-צבעוני באפשרות התצוגה של תוכנת ההדמיה כדי להמחיש טוב יותר את העוצמות הקלושות של פלואורסצנטיות הרקע של לולאות הנימים הגלומרוליות.
  3. באמצעות כלי דם שטחי כנקודת המוקד, לאט לאט להחדיר את אלבומין פלואורסצנטי, ומאפשר זמן לבחון את עלייתה ונפילתה של פלואורסצנטיות עקב התפלגות מערכתית. החדירו מספיק TR-RSA כדי להשיג עוצמה בכלי הדם הפריטובולאריים ולולאות הנימים שנמצאת ממש מתחת לרוויה.
    הערה: בדרך כלל יש עיכוב של 5 שניות בין עירוי החומר לבין הופעתו בזרם הדם כאשר הזלוף הכלייתי תקין.
  4. המתן כ-10 דקות לפני רכישת נפחים תלת-ממדיים (מרווחים של 1 מיקרומטר) עבור כל הגלומרולי המסומנים והמצולמים משלב 6.2.
    הערה: לחולדות הוויסטאר של סימונסן במינכן יש פחות גלומרולי פני השטח. עם זאת, מכיוון שלזן Frömter של חולדות MW יש מספר גדול יותר של גלומרולי פני השטח, לעתים קרובות ניתן לדמיין עד 10 גלומרולי.
  5. להרדים את החולדה באמצעות מנת יתר של איזופלורן בסוף המחקר. בצע pneumothoracotamy כפול כדי להבטיח המתת חסד.

7. חישוב חדירות גלומרולרית

  1. באמצעות תוכנת הצפייה בתמונות המשויכת למערכת המיקרוסקופים, ייצא את התמונות לתמונות גולמיות של 12 סיביות לצורך עיבוד וניתוח.
  2. טען את אמצעי האחסון התלת-ממדיים ברקע ואת הנפח התלת-ממדי הגולמי המכיל את האלבומין הפלואורסצנטי המסתובב. מקם את מישור המוקד בנפח התלת-ממדי עם הלולאה הנימית השטחית הבהירה ביותר בגלומרולי עם מספיק מקום לקצה הקפסולה של באומן שמסביב.
  3. באמצעות ציוני דרך חזותיים, אתר את אותו מישור מוקד שנמצא בנפח הרקע. בחר אזור בלולאה הנימית ואזור בתוך מרחב באומן וציין את ערכי העוצמה הממוצעים של כל אחד מהם. השתמש בערכי עוצמה אלה כערכי רקע.
  4. שרטטו אזור (לפחות 20 x 20 פיקסלים בשטח) בתוך מרחב באומן בתמונה המכילה אלבומין ושימו לב לעוצמת הקריאה (בחרו אזור שאינו צמוד ללולאה נימית או לקפסולת באומן כדי להבטיח את המדידה הנקייה ביותר של עוצמות החלל של באומן). הזז את האזור המצויר מעל שני אזורים אחרים כדי לקבל ערך ממוצע עבור העוצמה הממוצעת בתוך מרחב באומן.
  5. בחר את עוצמת הפלזמה הפלואורסצנטית הבהירה ביותר בתוך מקטע הלולאה הנימית והקף אזור זה. באמצעות פונקציית הסף , הדגש את הערכים הבהירים (הממוקמים בדרך כלל בשולי קירות הלולאה הנימיים), הימנע ממחזור צללי RBC והקלט את הערך.
    הערה: מכיוון שגורמים בדם יגרמו להערכת חסר של רמות הפלואורסצנציה בפלזמה, חשוב לבחור את האזורים הבהירים ביותר.
  6. הזן את הערכים בגיליון אלקטרוני כדי לחשב את ה- GSC באמצעות Eq (1):
    GSC = figure-protocol-10067 (1)

8. חישוב זרימת תאי הדם האדומים בלולאות נימי פני השטח ובכלי הדם הכלייתיים באמצעות פונקציית linecan

  1. מצא כלי מתאים (או לולאה נימית או כלי peritubular). מכיוון שהפונקציה linescan בתוכנת רכישת התמונה המוזכרת (ראה טבלת החומרים) דורשת שהכלי יהיה בניצב, סובב את התמונה באמצעות פונקציית הסיבוב .
  2. לאחר סיבוב הספינה ושכיבה שטוחה, בחר את פונקציית XT בתפריט הרכישה . הגדר עד לסריקה של 4,000 קווים. מניחים את הקו על פני הכלי כדי להיבדק; ודא שמישור המוקד נמצא בקוטר המרבי של המקטע שיש לצלם.
  3. לחצו לחיצה ימנית על התמונה ללא הפרדות צבע ובחרו 'צלם תמונה' כדי ליצור תמונת ייחוס של האזור שבו צולמה התבנית. לחץ מיד על התחלה כפתור כדי ללכוד את הקווים של הספינה.
  4. כדי לקבוע את קצב הזרימה של RBC, ייבא את הקווים לתוכנת עיבוד התמונה (ראה טבלת חומרים). פתח את תיבת הדו-שיח הצגת סטטיסטיקות אזור תחת התפריט הנפתח מדידה . בחר בכלי ציור קו בודד וצייר קו התואם את שיפוע צללי RBC. שים לב לערכי הרוחב והגובה.
    הערה: ערכי הפיקסלים המתקבלים לרוחב יתאימו למרחק; הפיקסלים לגובה מתאימים לזמן.
  5. השתמש בנוסחה הבאה (Eq (2)) כדי לחשב מהירות.
    קצב זרימת RBC ב- μm/s = figure-protocol-11503 (2)
    הערה: זה מתאים לפרמטרים של רכישה בהגדלה של פי 60 וקצב סריקה של 400 הרץ עם המיקרוסקופ המוזכר (ראה טבלת חומרים).
    1. בצע לפחות חמישה חישובים וממוצע אותם כדי לדווח על המהירות עבור כל קו.
      הערה: פרמטרים אלה יהיו תלויים בממד הפיקסלים ובמהירות הרכישה של מערכת המיקרוסקופים.

9. חישוב חסימת WBC בלולאות נימי גלומרולריות

  1. יש לתת את הכתם הגרעיני Hoechst 33342 (במשקל של ~8 מיקרוגרם/ק"ג) באמצעות קו גישה ורידי כדי לזהות WBCs הנמצאים בלולאות הנימים.
    הערה: העומק השימושי יהיה מוגבל עקב פיזור פוטונים ובליעה על ידי המוגלובין, במיוחד עבור פליטות כחולות באורכי גל קצרים יותר.
  2. מרכז גלומרולוס בשדה ההדמיה וקח מערך נתונים תלת-ממדי המתחיל במשטח הגלומרולרי וסיים את הנתונים לפחות 30 עד 35 מיקרומטר. השתמש בגודל צעד של 1 מיקרומטר בכיוון Z.
  3. זהה WBCs על ידי השוואת ערוץ Hoechst הכחול עם ערוץ האלבומין האדום של טקסס; חפשו הרחקה של צבע אדום בלולאה הנימית וכתם גרעיני תואם כדי לזהות באופן חיובי את ה-WBCs. הגדירו תאי דם לבנים כ"דבקים" אם הם נראים סטטיים מעל 3 חלקים אופטיים. דווח על הערכים כמופעים /10 מקטעים אופטיים מהחלק העליון של הגלומרולוס, שצולמו במרווחים של 1 מיקרומטר.

10. ניקוד נוכחות של תצורות Rouleaux בגלומרולי פני השטח

  1. בצע את אותן הוראות עבור שלב 9.3 ורכוש ערכת נתונים תלת-ממדית. חפשו תצורות Rouleaux המופיעות כ-RBCs שנערמים לתוך מנות שמתנגדות לדיסוציאציה כשהן נעות לאורך הלולאות הנימיות. השתמש בפלואורופור אדום להדמיה טובה יותר של מבנה בעומקים גדולים יותר בשל פחות פיזור פוטונים עבור פליטות אדומות באורך גל ארוך יותר. דווח על הערכים כמופע/25 מקטעים אופטיים מראש הגלומרולוס, שצולמו במרווחים של 1 מיקרומטר.

11. בידוד של גלומרולי

  1. יש לבודד שלוש קבוצות של גלומרולי מכליות טריות באמצעות טכניקת ניפוי סטנדרטית המביאה לטוהר של קרוב ל-90% של גלומרולי חולדה15.
    1. הניחו את קליפת הכליה בתמיסת מלח קרה עם פוספטים (PBS) וטחנו אותה באמצעות מספריים עדינים מרובים או סכיני גילוח.
    2. הוסיפו את הרקמה הטחונה למסננת תאים סטריליים בקוטר 100 מיקרומטר ודחפו אותה בעדינות באמצעות בוכנת מזרק של 5 מ"ל ו-50-100 מ"ל של PBS קר.
      הערה: רוב הצינוריות נשמרות בזמן שהגלומרולי עובר.
    3. הניחו את חלק הגלומרולי המועשר על מסנן של 70 מיקרומטר ושטפו אותם בהרחבה עם PBS קר. לשטוף את המסנן עם 100-200 מ"ל של PBS קר כדי להסיר את רוב tubules הנותרים.
    4. אסוף את הגלומרולי מהמסנן באמצעות 1-2 מ"ל של PBS קר, צנטריפוגה (10,000 × גרם, 2 דקות, 4 מעלות צלזיוס) והקפיא אותם בחנקן נוזלי עד לבידוד RNA.
      הערה: טוהר גלומרולרי שנקבע על ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה הוא >90%, והתפוקה היא כ -10 מ"ג מ מ -2 כליות.

12. בידוד RNA גלומרולרי

  1. הומוגניות של גלומרולי קפוא באמצעות מגיב בידוד RNA על ידי הוספת 400 μL של המגיב ופירוק הכדור באמצעות קצה פיפט של 200 μL, ולאחר מכן מערבולת קצרה ו -5 דקות של דגירה ב- RT16.
  2. יש להוסיף 40 μL של 1-ברומו-3-כלורופרופאן (BCP), מערבולת במשך 15 שניות, ולהחזיק ב-RT למשך 15 דקות.
  3. צנטריפוגה ב 12,000 × גרם, 15 דקות, 4 מעלות צלזיוס. הסר את השכבה המיימית, דילל את השכבה התחתונה בנפח שווה של 70% אתנול, וטען אותה ישירות על עמודת ספין (ראה טבלת חומרים).
  4. לאחר הכביסה, כל אחד מהם מורכב מהוספת התמיסה המתאימה לעמודה ואחריה צנטריפוגה ב 12,000 x גרם, 15 שניות, 26 מעלות צלזיוס [3 בסך הכל, 2 הראשונים עם 500 μL של RPE (חיץ כביסה עדין קנייני עם אתנול כדי להסיר עקבות של מלחים, 3 rd לשטוף עם 500 μL של 80% EtOH], elute את RNA על ידי תוספת של 15 μL של H2 O וצנטריפוגה, באשר לשטיפות. בדוק את הריכוז והטוהר של ה- RNA והעבר את דגימות ה- RNA למתקן הליבה לניתוח ננומסטרינג17,18.
    הערה: תפוקת הרנ"א הכוללת היא כ-1-2 מיקרוגרם. כאן, 24 הדגימות הכילו 200 ננוגרם של RNA ב-30 ng/μL.

13. ניתוח ננומסטרים

הערה: טכנולוגיית Nanostring מבוססת על זיהוי דיגיטלי וברקוד מולקולרי ישיר של מולקולות מטרה המשתמשות בזוגות גשושיות מקודדות צבע. הגשושית Capture נושאת מוטי ביוטין בקצה ה-3', והגשושית Reporter נושאת את האות בקצה ה-5' שלה.

  1. שלח את זוגות הגנים Nanostring ו- CodeSets למתקן הליבה הגנומית של מדינת מישיגן והשתמש בהם לפי הוראות NanoString.
    הערה: ישנם שישה מיקומים עבור קודי הצבעים, וכל מיקום יכול להיות אחד מארבעה צבעים, מה שמאפשר מגוון גדול של תגים שניתן לפתור ולזהות כל אחד בנפרד במהלך איסוף הנתונים.
  2. השג את הנתונים שנאספו על ידי צוות מתקן הליבה הגנומית באמצעות המנתח הקנייני Nanostring nCounter Digital, אשר אוסף שדות ראייה באמצעות מטרת מיקרוסקופ ומצלמת CCD וטבלאות ומציג את ספירות הברקוד.
  3. ייבא את הנתונים הגולמיים לתוכנת nSolver של Nanostring לצורך ניתוח. נרמל את הנתונים המנורמלים באמצעות הגדרות ברירת המחדל שלהם והשווה נתונים בין קבוצות כמתואר במדריך שלהם.
    הערה: המטרה הייתה לעקוב אחר שינויים גנטיים שהוכחו בעבר כמשתנים ברקמת קליפת המוח ממודלUUO 19, מחלת כליות 17,20,21,22,23,24,25,26. בסך הכל 126 גנים, כולל הבקרות החיוביות והשליליות המומלצות, נותחו בכל קבוצת גלומרולי (CONT, SHAM & UUO).

תוצאות

שלוש קבוצות של גלומרולי בודדו באמצעות טכניקת ניפוי סטנדרטית שמביאה לטוהר של קרוב ל-90% של גלומרוליחולדה 15. קבוצת הגלומרולי הראשונה הייתה מהכליה השמאלית של חולדות SD שעברו מהדק שופכן כליה שמאלי במשך 5 שבועות, UUO (5 זכרים, 3 נקבות). קבוצת הגלומרולי השנייה בודדה מכליות הביקורת הקונטרלטרליות מאותה חולדה, CONT (5 זכרים, 3 נקבות). הקבוצה השלישית של גלומרולי בודדה מחולדות SD שעברו ניתוח SHAM, והכליה השמאלית שימשה לבידוד גלומרולי לאחר 5 שבועות, SHAM (4 זכרים, 4 נקבות).

שינויים מורפולוגיים
החצנה של הכליה החסומה לצורך הדמיה גילתה כליה מוגדלת באופן גס, בערך פי ארבעה מהגודל הרגיל, עם אפיתליה דקה הנראית דרך פנים הכליה המלאה בנוזל. באמצעות מטרה של פי 20, תוך שימוש בתאורת אפיפלואורסצנציה וקוביית מעבר כפולה של FITC/Rhodamine, השינוי הבולט ביותר היה הידלדלות האפיתליה הצינורית והקריסה האחידה של לומן צינורי לאורך כל אורך הצינור. ההיסטולוגיה תוארה היטב והיא חמורה בשבוע אחד שלUUO 10,11,12. מספר הגלומרולי הנראה על פני השטח בחולדות MWF ו-SD גדל לאחר חמישה שבועות של חסימת שופכן חד-צדדית. איור 1A מציג את השיטה ששימשה ליצירת מודל UUO. הכליה הימנית אינה נגועה ומספקת קצב סינון גלומרולרי הולם לחולדה. מספר הגלומרולי לכל שדה באמצעות מטרה של פי 20 (363 מיקרומטר x 363 מיקרומטר) נספר והוצג בגרף באיור 1B. מספר גלומרולי פני השטח בחולדות MWF עלה מ-1.08 ± 0.11/שדה בחולדות לא מטופלות ל-2.97 ± 0.65/שדה בקבוצת UUO שנמשכה חמישה שבועות. חולדות SD עברו מלהיות ללא גלומרולי פני שטח ל-2.02 ± 0.37/שדה לאחר 5 שבועות של UUO.

תמונות תוך-חיוניות של 2-פוטונים צולמו של חולדות אלה לאחר הזרקה עם TR-RSA (אדום), דקסטרן כחול 10 kDa אשד (10 kDa-CB), ו- Hoechst 33342 כדי לסמן את הגרעינים (ציאן). אלה מוצגים עבור חולדות MWF רגילות (איור 1C), חולדות MWF לאחר חמישה שבועות של UUO (איור 1D), וחולדות SD לאחר חמישה שבועות של UUO (איור 1E). תמונות אלה מדגישות שינויים דרמטיים המתרחשים באפיתליה הצינורית. ליזוזומים פרוקסימליים של צינוריות, שהם בדרך כלל הצטברות קטנה בצבע כתום בחולדות MWF ו-SD שלא טופלו, הופכים למבנים גדולים של ואקואולאר יחיד הממלאים את רוב התא הצינורי המכווץ. כפי שתואר על ידי אלבומין TR-RSA, כלי הדם נראו מיושרים, ובכלי רבים, נטולי RBCs זורמים, והראו רק פלזמה זורמת. קיבוע הכליות גילה כי קליפת המוח הידלדלה לעור סיבי שאינו עבה יותר ממילימטר. תצפיות אלה מסכימות עם הספרות המוקדמת המשתמשת במודל זה 3,10,11,12.

שינויים בדינמיקה של כלי הדם הכלייתיים וחדירות גלומרולרית
זרימת הדם הכלייתית הופחתה באופן משמעותי הן בקבוצות UUO MWF והן בקבוצות SD במשך חמישה שבועות בהשוואה לחולדות שלא טופלו (איור 2). לחולדות MWF המופעלות על ידי שאם היה קצב זרימת RBC פריטובולרי של 885 ± 25 מיקרומטר לשנייה. זרימת RBC פריטובולרית בחולדות UUO MWF ו-SD במשך חמישה שבועות ירדה ל-250 ± 100 מיקרומטר לשנייה ו-200 ± 125 מיקרומטר לשנייה, בהתאמה. ערכים אלה חושבו על ידי איסוף סריקות קו על פני כלי שיט פריטובולריים כדי לחשב את מהירות RBC. איור דו-ממדי מציג גרף של נתונים אלה.

מהירות ה-RBC בתוך הלולאות הנימיות הגלומרולריות פחתה באופן משמעותי בחולדות UUO MWF ו-SD שנמשכו חמישה שבועות בהשוואה ל-MWF שלא טופלו (איור 3). במקרים רבים, נמצא כי לגלומרולי יש לולאות נימי נטולות לחלוטין RBCs זורמים. קצבי הזרימה של RBC בלולאה נימית היו 1,405 ± 425 מיקרומטר לשנייה, 250 ± 220 מיקרומטר לשנייה ±, ו-190 ± 200 מיקרומטר לשנייה או MWF לא מטופל, UUO MWF של חמישה שבועות וחולדות UUO SD של חמישה שבועות, בהתאמה (איור 3D). בתוך הלולאות הנימיות של קבוצות ה-UUO שנמשכו חמישה שבועות, הזרימה האיטית של ה-RBCs חשפה נוכחות של WBCs דבקים, או שהאטו את הזרימה או חסמו אותה, כאשר רק זרימת פלזמה דמיינה במורד הזרם מהחסימה החלקית או המוחלטת. כדי לכמת את התצפית הזו, נספר מספר ה-WBCs הדביקים שנמצאו בנפח תלת-ממדי ולאחר מכן נורמל להתרחשות לכל 10 מיקרומטר של עומק נפח תלת-ממדי. ניתן היה להבחין במבנה התא הלבן המודבק באמצעות פלואורסצנציה של צבע גרעיני ציאן מ- Hoechst 33342. לרוע המזל, פיזור הפוטונים הגדול יותר של אורות פולטים כחולים הגביל את הזיהוי האמין של WBC על ידי הגרעינים שלהם ל-10 החלקים האופטיים העליונים מלמעלה, שנלקחו בצעדים של 1 מיקרומטר של נפח גלומרולרי. לחולדות MWF שלא טופלו היו פחות מ-0.125 ± 0.05 WBCs/ 10 מקטעים אופטיים מלמעלה, שנלקחו בנפח צעדים של 1 מיקרומטר, בעוד שמספר זה עלה ל-1.5 ± 0.5 ו-3.25 ± 0.7 בחולדות UUO MWF בנות 5 שבועות וחולדות UUO SD בנות 5 שבועות, בהתאמה (איור 3E).

שינוי וסקולרי נוסף שעשוי להסביר גם את זרימת ה-RBC המופחתת בקבוצות ה-UUO בנות 5 השבועות היה המראה הרגיל של תצורות Rouleaux (RBCs מקובצים המודבקים בתצורת "מטבע מוערם", ראו כניסה לאיור 3F). תצורות Rouleaux זורמות לאט יותר וניתן לעצור אותן על ידי WBC חסיד. לחולדות WMF שלא טופלו אין כמעט תצורות Rouleaux בנימים הגלומרולאריים שלהן, שיש להן רק 0.05 ± 0.05 מופעים לכל 25 קטעים אופטיים מלמעלה, שנלקחו בצעדים של 1 מיקרומטר . בחולדות UUO MWF ו-SD שנמשכו חמישה שבועות הייתה עלייה ניכרת בתצורות Rouleaux 2.27 ± 0.46 ו-1.46 ± 0.73 לכל 25 מקטעים אופטיים החל מלמעלה, שנלקחו בצעדים של 1 מיקרומטר, בהתאמה (איור 3F).

בנוסף לירידה בקצבי הזרימה של RBC גלומרולריים שנצפו עם UUO, נצפתה עלייה בחדירות אלבומין. הייתה הטרוגניות גדולה יותר בחדירות אלבומין בין גלומרולי. מדי פעם, הצטברות אלבומין בתוך חלל באומן הייתה אינטנסיבית מספיק כדי שניתן יהיה לראותה בבירור (איור 4B, כוכבית). מקדם הניפוי הגלומרולרי של אלבומין עלה מ-0.015 ± 0.002 ב-MWF לא מטופל, ל-0.045 ±-0.05 ב-UUO MWF של 5 שבועות ו-0.052 ±-0.075 בחולדות UUO SD של חמישה שבועות.

פונקציית צינורית פרוקסימלית שהשתנתה
באופן מעניין, לא ניתן היה לזהות את האלבומין המסונן בתאי צינורית פרוקסימליים בעקבות UUO. מקטע S1 בדרך כלל אנדוציטוזה מכיל כמויות גדולות של אלבומין27,28,29,30, כפי שמוצג כאן בתנאים פיזיולוגיים בחולדות MWF שלא טופלו (איור 5A). לא ניתן היה לראות את אותה קליטה ב-MWF או ב-SD PT לאחר 5 שבועות של UUO (איור 5B,C). צינוריות פרוקסימליות המקיפות את הגלומרולי שצולמו בין 45 ל-60 דקות לאחר עירוי TR-RSA התקבלו עבור נוכחות (1) או היעדרות (0) של אלבומין. חשוב לציין כי בתנאים פיזיולוגיים, מקטע S1 נקשר ומפנים בהתלהבות אלבומין עם מעט מאוד אלבומין המגיע לצינוריות הדיסטליות או לצינורות האיסוף. לכן, סביר להניח שמקטעי הצינורית הפרוקסימלית האחרונים עשויים שלא להכיל אלבומין וכתוצאה מכך חיוביות חלקית לספיגת אלבומין של פחות מ-1.0. איור 5D מראה גרף עם התוצאות של ניקוד קליטת אלבומין צינורית פרוקסימלית. MWF לא מטופל היה ערך ספיגה חלקית של צינורית פרוקסימלית של 0.556 ± 0.126. גם לחולדות UUO MWF וגם לחולדות SD במשך חמישה שבועות היו ערכים נמוכים משמעותית של 0.049 ± 0.126 ו-0.00 ±0.00, בהתאמה.

מחקרים הושלמו גם בחולדות UUO MWF בנות 12 שבועות (טבלה 1). 12 שבועות של UUO הוא הזמן הסטנדרטי המשמש למחקרי עכברים כדי לגרום לגלומרולי פני השטח. שלוש חולדות זכרים של UUO צולמו, והצפיפות הגלומרולרית עלתה עוד יותר ל-6.16 ± 1.83 גלומרולי לכל שדה פי 20 בחולדות אלה. קצב הזרימה של RBC היה 293 ± 67 מיקרומטר לשנייה, הידבקות WBC הייתה 1.47 ± 1.12, שניהם דומים לנתוני UUO של 5 שבועות. גם ה-GSC של אלבומין עלה בהשוואה לחולדות UUO של 5 שבועות ל-0.109 ±-0.04.

שינויים ב-mRNA גלומרולרי המושרים על-ידי UUO הכרוני
טבלה 2 מציגה את כל הגנים (בדיקות) עם ערכי הביטוי המקובצים וסטיית התקן שלהם. שימו לב, הגנים נבחרו לניתוח על סמך תיעוד קודם של שינוי במחלת כליות, כולל UUO כמתואר בפרוטוקול סעיף 13. איור 6 הוא מפת חום של הנתונים המדגישים את השינויים הדרמטיים בביטוי הגנים עבור רוב הגנים בגלומרולי UUO בהשוואה לבקרה או לגלומרולי.

figure-results-8203
איור 1: עלייה במספר גלומרולי פני השטח ואינדוקציה של גלומרולי פני השטח בחולדות SD לאחר UUO של 5 שבועות בחולדות MWF. (A) דיאגרמה כירורגית של השופכן בכליה השמאלית ששוחררה בזהירות מעורק הכליה והווריד לפני שנסתם עם שני קשרים באמצעות תפר כירורגי. (B) גרף המציין את העלייה במספר גלומרולי פני השטח שנמצאים בחולדות MWF לפני וחמישה שבועות לאחר UUO יחד עם מספר גלומרולי פני השטח בחולדות SD, שבדרך כלל אין להן גלומרולי פני השטח. מספר גלומרולי פני השטח בחולדות MWF עלה מ-1.08 ± 0.11/שדה בחולדות לא מטופלות ל-2.97 ± 0.65/שדה בקבוצת UUO בת 5 שבועות. חולדות SD עברו מלהיות ללא גלומרולי משטח ל-2.02 ± 0.37 לשדה. תמונות משוחזרות תלת-ממדיות מציגות את פני הכליה עבור MWF (C) לא מטופל, MWF לאחר 5 שבועות UUO (D) ו-SD לאחר חמישה שבועות UUO (E). שימו לב להופעתם של מבנים גדולים וכתומים שהתלכדו מליזוזומים בודדים קטנים לגופים גדולים ולא תקינים. ה-UUO בן 5 השבועות בחולדות SD לא גרם לכך שאזורים הדומים לאפיתליה צינורית רגילה נצפתה ב-C ובחלקה ב-D. כלי הדם נראו מיושרים באזורים מסוימים, וברבים מהם היו חסימות חלקיות שאפשרו לפלזמה אך לא ל-RBCs לזרום. (n =3 חולדות זכריות לקבוצה) סרגלי קנה מידה = 40 מיקרומטר. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. קיצורים: UUO = חסימת שופכה חד צדדית; SD = ספראג-דאולי; MWF = מינכן ויסטאר פרומטר; G = גלומרולוס; RBCs = תאי דם אדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-9899
איור 2: הפחתה בזרימת RBC בתוך כלי הדם הפריטובולריים השטחיים לאחר 5 שבועות UUO. הקווים נאספו בכלי דם פריטובולריים כדי לקבוע את מהירות הזרימה של RBC ב-μm/s. בקצרה, קווי הייחוס האדומים המוצגים ב- A, B ו - C מייצגים אזור קטן שבו אותו אזור רוחב פיקסלים נסרק שוב ושוב, והתמונות נערמו בעמודה כדי להמחיש את העיוות שנגרם על-ידי RBCs זורמים, שנעים מהר יותר מכפי שהמיקרוסקופ יכול לרכוש אותם. העמודה הסמוכה לנתון הייחוס היא ה-linescan, כאשר השיפוע של עיוות RBC משמש לחישוב מהירות (ציר x = מרחק וציר y = זמן). כאן, מדרונות תלולים יותר ויותר מתאימים למהירויות RBC איטיות יותר ככל שהם נשארים זמן רב יותר באזור הקווים. שימו לב להבדל במראה של RBCs בחולדות MWF (A) שלא טופלו בהשוואה לתמונות UUO שנמשכות חמישה שבועות עבור חולדות MWF (B) ו-SD (C). מהירויות הזרימה של RBC עבור שלוש קבוצות החולדות מוצגות ב-D. זרימת RBC פריטובולרית ב-MWFs לא מטופלים עמדה בממוצע על 885 ± מיקרומטר לשנייה. ערכים אלה ירדו באופן משמעותי חמישה שבועות לאחר UUO בחולדות MWF ו-SD ל-250 ± 100 מיקרומטר לשנייה ו-200 ± 125 מיקרומטר לשנייה, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר, n = 3 חולדות זכריות לכל קבוצה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. קיצורים: UUO = חסימת שופכה חד צדדית; SD = ספראג-דאולי; MWF = מינכן ויסטאר פרומטר; RBC = תא דם אדום; WBC = תא דם לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-11571
איור 3: הפחתה משמעותית בזרימת RBC בלולאה נימית גלומרולרית והפעלה מושרית של הידבקות WBC על ידי UUO של 5 שבועות. אותה גישה של קווים המשמשת לקביעת זרימת RBC פריטובולרית שימשה לחקירת שינויים בזרימת הדם הנימי הגלומרולרית. לוחות A, B ו-C מראים פריסה דומה לאיור 2 ומתמקדים בגלומרולוס ב-MWF המופעל על-ידי בושאם, ב-UUO MWF של חמישה שבועות וב-UUO SDs של חמישה שבועות, בהתאמה. (D) גרף החושף את קצב זרימת ה-RBC הגבוה מבחינה פיזיולוגית בלולאות הנימים מחולדות MWF המופעלות על ידי שאם, בממוצע של 1,405 ± 425 מיקרומטר לשנייה ± 425, ירד ל-250 ± 220 מיקרומטר לשנייה ו-190 ± 200 מיקרומטר לשנייה עבור חולדות UUO MWF ו-5 שבועות של UUO SD, בהתאמה. כאשר בחנו את הלולאות הנימיות הגלומרוליות, WBCs דבקים נראו בקלות תוך כדי התמקדות דרך הגלומרולוס. מקטעים אופטיים תלת-ממדיים של גלומרולי בודדים נלקחו, ו-10 המקטעים האופטיים הראשונים, בהפרש של 1 מיקרומטר זה מזה, שימשו למדידת מספר ה-WBCs הדביקים. לחולדות MWF שלא טופלו לא היו כמעט WBC גלויים בנפחים שלהן, ממוצע של פחות מ-0.125 ± 0.05 WBCs/10 מקטעים אופטיים מלמעלה, שנלקחו בצעדים של 1 מיקרומטר. בחולדות UUO MWF ו-SD בנות 5 שבועות, מספרים אלה עלו ל-1.5 ± 0.5 ו-3.25 ± 0.7 WBCs/10 מקטעים אופטיים מלמעלה, שנלקחו בצעדים של 1 מיקרומטר, בהתאמה. תוצאות אלה מוצגות בתרשים בחלונית E, עם תוספות צבע המציגות WBC המסתירות לולאות נימיות. תצורות Rouleaux (חצים, משובצים בלוח F) מופיעות כ- RBCs הקשורים זה לזה בחוזקה בתצורת "מטבע מוערם", אשר שומרים במידה רבה על הקיבוץ הצרור שלהם גם במערבולת זרימת הדם. ניתן היה להבחין בקלות במבנים פתולוגיים אלה בעומקים גדולים יותר בתוך הגלומרולוס. חולדות MWF המופעלות על ידי שאם היו ברובן נטולות מבנים אלה, עם רק 0.05 ± 0.05 מופעים 25 קטעים אופטיים מלמעלה, נלקחו בצעדים של 1 מיקרומטר של נפח גלומרולרי. לעומת זאת, ב-UUO בן 5 השבועות הן בחולדות MWF והן בחולדות SD הייתה עלייה ניכרת בתצורות Rouleaux עם מופעים של 2.27± 0.46 ו-1.46 ± 0.73/25 קטעים אופטיים מלמעלה, שנלקחו בצעדים של 1 מיקרומטר, בהתאמה. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר, n = 3 חולדות זכריות לכל קבוצה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. קיצורים: UUO = חסימת שופכה חד צדדית; SD = ספראג-דאולי; MWF = מינכן ויסטאר פרומטר; RBC = תא דם אדום; WBC = תא דם לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-14096
איור 4: עלייה משמעותית בחדירות אלבומין נימי גלומרולריים לאחר UUO של 5 שבועות. לוחות A, B ו-C מציגים תמונות פסאודו-צבעוניות של נפח תלת-ממדי עבור ערוץ אלבומין בסרום חולדות ב-MWF שלא טופל, UUO MWF בן 5 שבועות וחולדות UUO SD של חמישה שבועות, בהתאמה. התמונות מוצגות בפלטת צבעים פסאודו-צבעונית כדי להדגיש את הכמות הניכרת של אלבומין מסונן שנראה בחלל של באומן, במיוחד בלוח B (כוכבית). (A) החלל של באומן (כוכבית) מראה את הרמה הנורמלית של אלבומין שנראית בדרך כלל בחולדות MWF לא מטופלות, שאינה ניתנת להבחנה לעין. תמונות של גלומרולי צולמו לפני עירוי אלבומין כדי להפחית ערכי פלואורסצנטיות ברקע מאלה שנלקחו לאחר מתן אלבומין. (D) גרף עם מקדם הניפוי הגלומרולרי עבור אלבומין בחולדות MWF לא מטופלות, בעל ערך של 0.015 ± 0.002. ערך זה עלה באופן משמעותי ל- 0.045± 0.05 בחולדות UUO MWF בנות 5 שבועות ו- 0.052 ± 0.075 בחולדות UUO SD בנות חמישה שבועות. פרמטר זה הוא ערך יחסי של עוצמות פלואורסצנטיות של מרחב באומן חלקי ערך הפלזמה ואין לו יחידת מידה קשורה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר, n = 3 חולדות זכריות לכל קבוצה. סולם עוצמת הצבע המדומה ממוקם מתחת ללוח D. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. קיצורים: UUO = חסימת שופכה חד צדדית; SD = ספראג-דאולי; MWF = מינכן ויסטאר פרומטר; RBC = תא דם אדום; WBC = תא דם לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-15742
איור 5: תפקוד מופחת בצינוריות פרוקסימליות לאחר UUO של 5 שבועות. (A) תמונה של גלומרולוס שטחי ומקטע S1 מחולדה רגילה של וויסטאר פרומטר במינכן שצולמה 40 דקות לאחר עירוי של TR-RSA ו-Cascade Blue dextran. הפנמה של TR-RSA ניתן לראות בקטע S1 ואת הצינורית הפרוקסימלית. בניגוד חד, חולדות MWF (B) וחולדות SD (C), הנתונות ל-UUO של 5 שבועות, מציגות צינוריות פרוקסימליות שהשתנו קשות עם קליטה מינימלית או ללא קליטה כלל של TR-RSA. הליזוזומים האוטופלואורסצנטיים הקטנים בדרך כלל (A) הופכים למבנים צהובים-כתומים גדולים וריקים, לעתים קרובות עם קריסה מוחלטת של לומן צינורי, שלא ניתן למצוא בערכות הנתונים התלת-ממדיות. (C) צינוריות דיסטליות שבדרך כלל נטולות כל צורה של אוטופלואורסצנציה מכילות כעת הצטברות אוטופלואורסצנטית. ניקוד הצינוריות הפרוקסימליות המקיפות את הגלומרולי בתמונות דומות שצולמו 45-60 דקות לאחר העירוי, לצורך קליטת אלבומין, הראה הבדל משמעותי בין קבוצת MWF המופעלת על ידי שאם לבין שתי קבוצות UUO בנות 5 שבועות. לחולדות MWF שלא טופלו היה ערך ספיגה חלקית של צינורית פרוקסימלית של 0.556 ± 0.126. גם לחולדות UUO MWF וגם לחולדות SD במשך חמישה שבועות היו ערכים נמוכים משמעותית של 0.049 ± 0.126 ו-0.00 ±0.00, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר, n = 3 חולדות זכריות לכל קבוצה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. קיצורים: UUO = חסימת שופכה חד צדדית; SD = ספראג-דאולי; MWF = מינכן ויסטאר פרומטר; RBC = תא דם אדום; WBC = תא דם לבן; TR-RSA = אלבומין בסרום עכברוש אדום טקסס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-17523
איור 6: שינויים בביטוי גנים עם UUO . (A) מפת חום של הנתונים. (B) שינויים גנטיים מנורמלים עבור כל הנתונים בחלקת פיזור. ביטוי הגנים בכליות הביקורת הושווה מביטוי נמוך לגבוה, והגנים הן מכליות SHAM והן מכליות UUO הושוו לרמות ביטוי הבקרה. נקודות נתונים של גנים שנמצאות קרוב לערך האלכסוני של גני הביקורת מציינות רמות ביטוי דומות עבור שתי הקבוצות, בעוד שנקודות נתונים מעל או מתחת לאלכסון מציינות רמות ביטוי גבוהות או נמוכות יותר, בהתאמה. שימו לב שהגנים של SHAM מתקבצים קרוב יותר לביטוי האלכסוני של הבקרה מאשר הגנים של UUO, שהם משתנים יותר. קיצור: UUO = חסימת שופכה חד צדדית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: התקדמות הפציעה מ-5 ל-12 שבועות של UUO. השוואה של פרמטרי הדמיה של UUO במשך 5 ו-12 שבועות בשלוש חולדות MWF זכריות ושלוש חולדות זכרות SD בכל נקודת זמן. נתוני חמשת השבועות זהים לנתונים הקודמים. שימו לב לעלייה בצפיפות הגלומרולרית ול-GSC לאלבומין עם המשך UUO. קיצורים: UUO = חסימת שופכה חד צדדית; SD = ספראג-דאולי; MWF = מינכן ויסטאר פרומטר; GSC = מקדם סינון גלומרולרי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: ניתוח סמני דלקת בגלומרולי מ-UUO וחולדות בקרה. זוגות גשושיות גנים ו-CodeSets תוכננו ונעשה בהם שימוש לפי הוראות NanoString. מעל 100 גנים נותחו, בתוספת בקרות חיוביות ושליליות כפי שצוין על ידי Nanostring. כל הגנים (בדיקות) עם הביטוי המקובץ שלהם וערכי SD מוצגים בטבלה. איור 6A הוא מפת חום של הנתונים, ואילו איור 6B מציג את השינויים הגנטיים עבור כל הנתונים בחלקת פיזור. שימו לב לדמיון בין הבקרות ל-SHAM ולשינויים המובהקים ברוב הגנים ב-UUO. קיצורים: UUO = חסימת שופכה חד צדדית; SD = סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

המחקר של פיזיולוגיה גלומרולרית ראה גישות רבות ושונות, בעיקר השימוש במיקרופונקטורה, פרפוזיה של גלומרולי מבודד ומיקרוסקופיה. הזמינות של גלומרולי פני השטח בחולדות ויסטאר במינכן, זני פרומטר וסימונסן, אפשרה מחקרים דינמיים in vivo . הערה חשובה אחת לחוקרים המאמצים טכנולוגיה זו היא הצורך להגדיר פרמטרים לרכישה כדי לשמור על תמונות עקביות בין המחקרים, כך שהאוטופלואורסצנציה ברקמה תישאר עקבית. שימוש בקוביית פלואורסצנט/רודמין אפיפלואורסצנטית בעלת מעבר כפול והתאמת הגדרות הרווח לתעלות הפליטה הירוקות והאדומות כדי לחקות על מסך המחשב את מה שנראה דרך העיניות יבטיחו חתימת צבע עקבית באוטופלואורסצנציה גם בין מערכות מיקרוסקופ שונות.

זן פרומטר נמצא בשימוש נרחב מכיוון שיש לו מספר מופחת של גלומרולי כולל, ~ 75% נורמלי, והזכרים מפתחים באופן ספונטני יתר לחץ דם בסביבות גיל 12 שבועות, עם פרוטאינוריה מתקדמת וטרשת גלומרולרית מוקדית לאחר מכן, ובסופו של דבר מתים מאי ספיקת כליות12. השימוש בחולדות אלה והוספת מיקרוסקופיה של 2 פוטונים עם הפוטוטוקסיות המופחתת שלה, שיפור עומק החדירה והיכולת לצפות במספר בדיקות פלואורסצנטיות בו זמנית סללו את הדרך לתגליות חדשות 1,4,5. עם התפתחות החומרה והתוכנה של המחשב, נתונים כמותיים הם כיום הסטנדרט עבור כל מעבדות 2-פוטון. טכניקות כמותיות מרובות פותחו ויושמו על תהליכים גלומרולריים, פרוקסימליים, כלי דם ותהליכים אינטרסטיציאליים בתנאים פיזיולוגיים ומחלות 1,4,5,27,28,29,30.

מתקנים לייצור עכברים מהונדסים הוסיפו ממד חדש לחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה של הכליות, וזה היה רק עניין של זמן עד שזה ישולב עם מיקרוסקופיה של 2 פוטונים כדי להגדיר עוד יותר את החשיבות של תוצרי גנים ספציפיים במבנה ובתפקוד הכליות. עם זאת, גלומרולי עכבר, למעט בעכברים צעירים מאוד, ממוקמים מעל 100 מיקרומטר מפני השטח של הכליה9. מיקרוסקופיה של שני פוטונים מתבצעת בצורה הטובה ביותר בעומק של בין 20 ל-50 מיקרומטר כרזולוציה, ועוצמת הפלואורסצנציה פוחתת במהירות לאחר מכן עקב פיזור אור של אור שנפלט ובליעה מאינטראקציה עם המוגלובין. לכן, היה צורך לגרום glomeruli פני השטח. הגישה הנפוצה היא מודל חסימה חד-צדדי ממושך למשך 12 שבועות. מכיוון שמודלים אלה אינם מאפשרים קביעות בסיסיות, הפרדת ההשפעות של UUO מהתהליך הנחקר אינה אפשרית.

באמצעות חולדות MWF, ניתן להשוות את הפונקציה הגלומרולרית הבסיסית עם זו שלאחר UUO. מודל UUO זה ידוע כגורם לדלקת ולקצב מהיר של פיברוזיס ושימש לחקר CKD ופיברוזיס10,11,12. כצפוי, חלה עלייה בגלומרולי פני השטח הן בחולדות MWF והן בחולדות SD. יתר על כן, התוצאות הכמותיות שהתקבלו לאחר UUO עבור חולדות MWF ו- SD היו דומות מאוד. הירידה בזרימת הדם שתועדה כאן דווחה בעבר בהשוואה בין נתונים מיקרוסקופיים בעקבות UUO לנתוני מיקרופונקטורה3. זה היה ידוע גם כי היסטולוגיה צינורית interstitial משתנה במידה ניכרת, ואת PTs הם בעיקר לא פונקציונלי, כפי שדווח כאן, עם חוסר אנדוציטוזה אלבומין. המחקרים באיור 2 ובאיור 3 מראים ירידה דרמטית בקצב זרימת ה-RBC בנימים גלומרולריים ופריטובולריים והידבקות WBC מוגברת. ההפחתה בזרימה נובעת ככל הנראה מחסימה נימית מהידבקות WBC ותצורות רולו.

כדי להעריך עוד יותר את הדלקת, כימתנו את חדירות האלבומין והראינו שהיא גדלה פי עשרה. בנוסף, גלומרולי מבודד הראה כי ביטוי mRNA עלה עבור גנים רבים שהיו ידועים בעבר כבעלי עלייה בדלקת בכליות במגוון מצבי מחלת כליות 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . העליות בצפיפות פני השטח הגלומרולרית ובחדירות האלבומין היו הדרגתיות, כפי שמוצג בנתוני UUO של 12 שבועות. הנתונים הנוכחיים הם הראשונים שמראים באופן ישיר כי גלומרולי עובר נזק מבני משמעותי, דלקת ושינויים מולקולריים במודל UUO. התוצאות עולות בקנה אחד עם מחקר קודם של רקמת כליה שלמה שניתח ביופסיות כליות של כבשים בעקבות UUO, ומצא סמני דלקת מרובים גבוהיםב-19. התוצאות הנוכחיות מצביעות על כך שקיימת דלקת ניכרת בתוך הגלומרולי, שבעבר הייתה ידועה רק לרקמת קליפת המוח.

הנתונים הנוכחיים שונים ממחקרים קודמים בעכברים שבהם לא נמצאו שינויים בביטוי מולקולות הידבקות, תצהיר משלים וחדירת נויטרופילים בין 12 שבועות פוסט-הידרונפרוטיים לגלומרולירגיל 31. בנוסף, מעבדת היקי השתמשה במודל UUO בן 12 השבועות כדי לחקור תגובות חיסוניות בגלומרולי של עכברים. הם לא מצאו הבדלים בחדירת נויטרופילים בין גלומרולי עכבר בן ארבעה שבועות לבין גלומרולי32,33 לאחר חסימה. מחקרים מאוחרים אלה נערכו לאחר שהאגן של הכליה החסומה התרוקן משתן. לא עשינו זאת מכיוון שרצינו לקבוע את ההשפעה של UUO על תפקוד גלומרולרי כפי שהוא יהיה in vivo, מבלי להסיר באופן מלאכותי את הנוזל הגורם לחסימה. לבסוף, השימוש ב-UUO בעכברים מוחלף על ידי הדמיה של גלומרולי בעומק של יותר מ-100 מיקרומטר מתחת לפני השטח. אמנם זה אפשרי, אבל יש פשרה של רזולוציה ועוצמה, שניהם מופחתים משמעותית ככל שעוברים את ה-50 מיקרומטר34.

התוצאות המוצגות אינן מפתיעות אם מחברים יחד את הנתונים מהספרות הקיימת על שינויים היסטולוגיים, היווצרות גלומרולי אטובולרי, דלקת, פיברוזיס, המודינמיקה10,11,12. הנתונים שהוצגו, כולל הידבקות WBC, תצורות רולו, סמני דלקת מולקולריים גלומרולריים וחדירות אלבומין מוגברת, מצביעים עוד יותר על הדלקת הנרחבת שנמשכת במודל UUO זה אפילו בחמישה שבועות וגם נוכחת ב-12 שבועות. ברור ש-UUO כרוני אינו מצב פיזיולוגי, והשימוש ב-UUO כדי לגרום לגלומרולי פני השטח מייצג מודל של פציעה. חולדות MWF, שיש להן גלומרולי פני השטח בתנאים פיזיולוגיים, ניתנות לחקירה אורכית כאשר מתרחשת פציעה. אפשר ליצור חולדות מהונדסות, וחוקרים רבים יוצרים אותן עם ביוסנסורים כדי לשאול שאלות ספציפיות. בפרט, במכללה הרפואית של ויסקונסין יש כיום מושבה של חולדות MWF והיא ייצרה חולדות מהונדסות לצורך חקר תהליכים גלומרולריים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. חולדות MWF אלה מציעות הזדמנות מצוינת לחקור תהליכים גלומרולריים בחולדות רגילות, חולות ומשתנות גנטית.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות RO1DK091623 ו- P30DK079312 (ל- B.A.M.). אנו מודים לצוות מתקן הליבה הגנומית של מתקן התמיכה בטכנולוגיית המחקר (RTSF) באוניברסיטת מישיגן סטייט על ביצוע ניתוח הננו-מיתרים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
70 µm sterile cell strainerCorning#421751
100 µm sterile cell strainerCorning#421752
CA Micro scissors Model 1C300Electron Microscopy SciencesCat# 72930
Electric heating padSunbeamKroger
Handling ForcepsElectron Microscopy SciencesCat# 72962
Kelly Hemostatic Forceps (straight)Electron Microscopy SciencesCat#72930
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted MicroscopeLeica MicrosystemsNote: Version 7.1r1
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laserSpectra-PhysicsNA
Mayo Dissecting ScissorsElectron Microscopy SciencesCat# 78180-1C3
Metamorph Image processing SoftwareMolecular DynamicsCat# 78266-04
Microsoft ExcelMicrosoft Corportation2007 version
Quant-iT RNA Assay KitInvitrogen/ThermoFisherQ33140
Reptitherm Undertank HeaterZoomedAmazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)Qiagen74204
RPE bufferQiagen1018013
Strate-Line Autoclave TapeFisher ScientificCat# 11-889-1
TRI ReagentSigmaT9424
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)Electron Microscopy SciencesCat# 70665-07

References

  1. Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).
  2. Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).
  3. Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study. Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).
  4. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
  5. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats. Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).
  6. Huber, T., et al. Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains. Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).
  7. Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).
  8. Roselli, S., et al. Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice. Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).
  9. Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney. PloS One. 8 (1), 52499 (2013).
  10. Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  11. Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model. American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).
  12. Yang, H. -. C., Zuo, Y., Fogo, A. B. Models of chronic kidney disease. Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).
  13. Hackl, M. J., et al. Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags. Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).
  14. Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).
  15. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  17. El Karoui, K., et al. Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2. Nature Communications. 7, 10330 (2016).
  18. VA, M., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Research Notes. 2, 80 (2009).
  19. Springer, A., et al. A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model. The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).
  20. Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. Live or let die: Is there any cell death in podocytes. Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).
  21. Kim, W. The role of angiopoietin-1 in kidney disease. Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).
  22. Liu, F., Zhuang, S. Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972 (2016).
  23. Martini, S., et al. Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).
  24. Mühlberger, I., et al. Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome. International Journal of Nephrology. 2011, 809378 (2010).
  25. Satirapoj, B., et al. Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).
  26. Fengxin, Z., et al. Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M. Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).
  27. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052 (2013).
  28. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).
  29. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states. Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).
  30. Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy. Intravital. 2 (1), 23674 (2014).
  31. Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling. Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).
  32. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).
  33. Finsterbusch, M., et al. Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).
  34. Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. A new view of macula densa cell protein synthesis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181Wistar Fromter

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved