דוגמנות דימום תוך חדרי ילודים באמצעות הזרקה תוך-חדרית של המוגלובין

Summary

אנו מציגים מודל של דימום תוך חדרי ילודים באמצעות גורי חולדות המחקה את הפתולוגיה הנראית בבני אדם.

Abstract

דימום תוך-חדרי בילודים (IVH) הוא תוצאה שכיחה של לידה מוקדמת ומוביל לפגיעה מוחית, הידרוצפלוס פוסט-דימומי (PHH) וליקויים נוירולוגיים לכל החיים. בעוד שניתן לטפל ב- PHH על ידי הליכי הסחה זמניים וקבועים של נוזל מוחי (CSF) (מאגר חדרי ו- shunt ventriculoperitoneal, בהתאמה), אין אסטרטגיות פרמקולוגיות למניעה או לטיפול בפגיעה מוחית והידרוצפלוס הנגרמים על ידי IVH. מודלים של בעלי חיים נדרשים כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה של IVH ולבדוק טיפולים תרופתיים. אמנם ישנם מודלים קיימים של IVH ילודים, אלה המביאים באופן אמין הידרוצפלוס מוגבלים לעתים קרובות על ידי הצורך בזריקות בנפח גדול, אשר עלול לסבך את המידול של הפתולוגיה או להציג שונות הפנוטיפ הקליני שנצפה.

מחקרים קליניים אחרונים קשרו המוגלובין ופריטין בגרימת הגדלת חדר לאחר IVH. כאן, אנו מפתחים מודל חייתי פשוט המחקה את הפנוטיפ הקליני של PHH תוך שימוש בזריקות תוך-חדריות בנפח קטן של המוגלובין תוצר פירוק הדם. בנוסף לגרימת הגדלת חדר והידרוצפלוס באופן אמין, מודל זה גורם לפגיעה בחומר הלבן, דלקת וחדירת תאי מערכת החיסון באזורי החומר הלבן והחומר הלבן. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ורלוונטית קלינית זו למידול IVH-PHH בחולדות ילודים באמצעות הזרקה תוך-חדרית ומציג שיטות לכימות גודל החדר לאחר ההזרקה.

Introduction

IVH ילודים מקורו במטריצת הנבטה, אתר של חלוקת תאים מהירה הסמוכה לחדרים הצדדיים של המוח המתפתח. מבנה כלי דם זה פגיע לחוסר יציבות המודינמית הקשורה ללידה מוקדמת. הדם משתחרר לחדרים הצדדיים בדימום מטריצה נבטית (GMH)-IVH כאשר כלי דם שבירים בתוך המטריקס הנבט נקרעים. במקרה של דרגה IVH IVH, אוטם דימומי periventricular עשוי גם לתרום לשחרור של מוצרי דם בתוך המוח. ¹ השילוב של GMH-IVH עלול לגרום ל-PHH, במיוחד לאחר דימום בדרגה גבוהה (דרגות III ו-IV)¹. ניתן לטפל ב- PHH עם מיקום של shunt חדרי, אך מיקום shunt אינו הופך את הפגיעה המוחית שעלולה להתרחש מ- IVH. למרות שטיפול נמרץ יילודים מודרני הוריד את שיעורי IVH², ^3, אין טיפולים ספציפיים לפגיעה מוחית או הידרוצפלוס הנגרמת על ידי IVH לאחר התרחשותה. מגבלה משמעותית בפיתוח טיפולים מונעים לפגיעה מוחית הנגרמת על ידי IVH ו- PHH היא ההבנה החלקית של פתופיזיולוגיה של IVH.

לאחרונה, רמות CSF מוקדמות של המוגלובין תוצר פירוק דם מרכזי הוכחו כקשורות להתפתחות מאוחרת יותר של PHH בילודים עם IVH⁴ בדרגה גבוהה. יתר על כן, רמות CSF של חלבונים במסלול הטיפול בברזל – המוגלובין, פריטין ובילירובין – נקשרות לגודל החדר בהפריה חוץ גופית בילודים. זה הוכח גם בקבוצה רב-מרכזית של תינוקות עם PHH פג, שם רמות גבוהות יותר של פריטין CSF בחדר נקשרו לגודל חדר גדול^{יותר 5}.

במחקר זה פיתחנו מודל רלוונטי מבחינה קלינית של פגיעה מוחית הנגרמת על ידי IVH והידרוצפלוס באמצעות הזרקת המוגלובין לחדרי המוח, המאפשר כימות של פגיעה מוחית ו-PHH ובדיקת אסטרטגיות טיפוליות חדשות (איור 1)^{6, 7}. מודל IVH זה משתמש בגורי חולדות ילודים, אשר ממוקמים תחת הרדמה כללית למשך ההליך. חתך בקו האמצע נעשה בקרקפת, וקואורדינטות הנגזרות מציוני דרך בגולגולת – ברגמה או למבדה – משמשות למיקוד החדרים הצדדיים להזרקה. הזרקה איטית באמצעות משאבת עירוי מעבירה המוגלובין לחדר. פרוטוקול זה קל לשימוש, רב-תכליתי ויכול ליצור מודלים של רכיבים שונים של IVH שמביאים ל-PHH.

Protocol

הערה: כל הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסדות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת פתרונות המוגלובין ו- CSF

1. הכן תמיסת CSF מלאכותית סטרילית (aCSF) על ידי הוספת 500 μL של תמיסת aCSF למיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל ואחסן על קרח.
2. הכינו תמיסת המוגלובין סטרילית של 150 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 75 מ"ג המוגלובין ל-500 מיקרו-ליטר של aCSF במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל ואחסנו על קרח.

2. הכנת החיה להזרקה

1. סובבו את כרית החימום לסביבה הבינונית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה.
2. הרדימו חולדות לאחר הלידה ביום 4 (P4) בתא אינדוקציה מלא ב-3% איזופלורן.
   הערה: יש לוודא הרדמה מספקת באמצעות תגובת כיווץ הבוהן/הזנב כל 15 דקות. עקוב אחר ההרדמה עם תצפית חזותית על צבע הרקמה, טמפרטורת הגוף וקצב הנשימה.
3. מתן שיכוך כאבים באמצעות הזרקת קרפרופן תת עורי של 5 מ"ג/ק"ג לחולדה המורדמת.
4. מקם את החולדה המורדמת נוטה במנגנון הסטריאוטקטי כאשר האף ממוקם במתאם ההרדמה עם זרימה קבועה של 1.5% איזופלורן.
5. הדקו את מוטות האוזניים שאינם נקרעים על הבשר השמיעתי החיצוני כדי לאבטח את הראש.
   הערה: יש למרוח משחה וטרינרית כדי לשמור על לחות העיניים אם העיניים פקוחות בגיל ההזרקה.
6. נקו את הראש, לסירוגין עם אפליקטורים סטריליים בעלי קצוות כותנה ספוגים בבטאדין ו-70% אתנול.
   1. גע באפליקטור ספוג הבטאדין למרכז הקרקפת ופזר את הבטאדין במעגלים, תוך תנועה החוצה.
   2. חזור על שלב 2.6.1.1 עם המוליך ספוג האתנול.
   3. חזור על שלב 2.6.1.1 ועל שלב 2.6.1.2 3x.
7. יש למרוח וילון כירורגי סטרילי כדי להגן על שדה הניתוח.
8. באמצעות אזמל סטרילי, לבצע חתך של 0.3 ס"מ אנכית במרכז הראש כדי לחשוף את bregma של הגולגולת.
   הערה: אם מזריקים מהלמבדה, חושפים את הלמבדה של הגולגולת במקום את הברגמה.
9. השתמש באפליקטור סטרילי עם קצה כותנה כדי לייבש את האזור.

3. הגדרת המזרק הסטריאוטקטי

1. צייר את תמיסת ההמוגלובין שהוכנה בשלב 1.2 לתוך מזרק סטרילי של 0.3 מ"ל עם מחט 30G והנח את המזרק למערכת המזרקים הסטריאוטקטית.
   הערה: אם אתה יוצר תנאי בקרה, צייר תמיסת aCSF שהוכנה בשלב 1.1 לתוך מזרק סטרילי של 0.3 מ"ל והמשך עם הפרוטוקול.
2. הפעל את ממשק המזרק הסטריאוטקטי ולחץ על כפתור התצורה כדי להזין את עוצמת הקול והקצב של ההזרקה.
   1. לחץ על עוצמת קול והגדר את עוצמת הקול על 20,000 nL (20 μL).
   2. לחץ על קצב עירוי והגדר את הקצב על 8,000 nL /min (8 μL/min).
3. צא מהתצורה על ידי לחיצה על אפס קופה לחצן.
4. שטפו את קצה המחט על ידי לחיצה על כפתור ההחדרה עד שצץ חרוז קטן של תמיסת המוגלובין בקצה המחט.
5. לפות בעדינות את תמיסת ההמוגלובין מקצה המחט עם אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה.

4. הזרקת בעלי חיים

1. הגדר את הברגמה כאפס במערכת המזרקים הסטריאוטקטית על ידי התאמת התנוחות הבינוניות והאנטרופוסטריות של המזרק לפני הורדת קצה מחט המזרק הסמוק כדי לגעת בעדינות בגולגולת בברגמה.
   הערה: אם מזריקים מהלמבדה, מגדירים את למבדה כאפס.
2. זהה את קואורדינטות הבחירה.
   1. אם מזריקים מהברגמה, בחולדות P4 המתוארות כאן, השתמשו ב-1.5 מ"מ לרוחב, 0.4 מ"מ קדמיים ו-2.0 מ"מ עומק מברגמה.
   2. אם מזריקים מהלמבדה, השתמשו בקואורדינטות הבאות עבור חולדות P4: 1.1 מ"מ לרוחב, 4.6 מ"מ קדמי ועומק 3.3 מ"מ מלמבדה.
3. הרם את מחט המזרק 1 ס"מ מעל הגולגולת כדי לנקות את הקרקפת. כאשר המזרק מורם, המשך להגדיר את הקואורדינטות הבינוניות והאנטרופוסטריות.
4. הורידו את מחט המזרק כדי לגעת בעדינות בגולגולת. בדוק שהמחט נוגעת בגולגולת.
5. הגדר את הקואורדינטות הגבי על פני תקופה של 30 שניות.
   הערה: בעת קביעת הקואורדינטות הדורסובנטרליות, המחט תנקב את הגולגולת. יש להקפיד על כך שהמזרק יעבור דרך הגולגולת מבלי לעוות את הגולגולת. דפורמציה בגולגולת נמנעת על ידי משיכה איטית של המחט לאורך הקואורדינטות הגבי אם מתרחש דפורמציה, ולאחר מכן החזרת המחט לאורך אותו מסלול. זה מאפשר למחט לעבור דרך החור בגולגולת עם פחות כוח וללא עיוות.
6. בממשק המזרק הסטריאוטקטי, לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל בהזרקה.
7. לאחר סיום ההזרקה, השאירו את מחט המזרק במקומה למשך 2 דקות כדי למזער את זרימת התמיסה.
8. מושכים את המזרק באיטיות לאורך הקואורדינציה הגבית במשך 2 דקות עד שקצה המחט נמצא 2 ס"מ מעל הקרקפת.
9. סובב את זרוע המזרק הסטריאוטקטית הרחק מהשדה המבצעי.

5. טיפול לאחר הניתוח

1. סגור את הקרקפת עם תפר מונופילמנט 6-0. הכינו תפר אחד פשוט שנקטע במרכז החתך באורך 0.3 ס"מ.
2. הוציאו את הגור מההרדמה והניחו אותו על אזור בטוח על כרית החימום.
3. החזירו את המכרסם לכלוב הביתי כדי להתאושש מההרדמה תחת טיפול הסכר שלו.
   הערה: חזרה בזמן לטיפול בסכר מפחיתה את התמותה המוקדמת לאחר הניתוח.
4. עקוב אחר בעלי החיים להרדמה על ידי אובדן רפלקס התיקון מדי שעה לאחר הניתוח במשך 3 שעות.
5. עקוב אחר בעלי החיים מדי יום במשך 7 ימים עבור פעילות רגילה, צריכת מזון, ועלייה במשקל. עקוב אחר אתר החתך לריפוי פצעים, סגירה והופעה חוזרת של פרווה באתר הניתוח.
   הערה: במקרה הנדיר כי שינויים נוירולוגיים כגון התקפים, דיכאון מרכזי, או ירידה בתיאבון נצפים במהלך הניטור, להרדים את החיה באמצעות זלוף תוך וסקולרי או פריקת צוואר הרחם תחת הרדמה.
6. כדי למנוע זיהום ברגע שהתפר נסגר והפצע מחלים, יש למרוח אנטיביוטיקה משולשת מקומית באתר החתך.

6. רכישה וכימות MRI

1. בצע MRI בסורק 4.7T או 9.4T של בעלי חיים קטנים.
2. סובבו את כרית החימום לסביבה הבינונית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה.
3. לגרום הרדמה בתא באמצעות 3% isoflurane.
   הערה: יש לוודא הרדמה מספקת באמצעות תגובת כיווץ הבוהן/הזנב כל 15 דקות. עקוב אחר ההרדמה עם תצפית חזותית על צבע הרקמה, טמפרטורת הגוף וקצב הנשימה.
4. מקם את החולדה המורדמת נוטה ב- MRI כאשר האף ממוקם במתאם ההרדמה עם זרימה קבועה של 1.5% איזופלורן.
5. בצע הדמיה משוקללת T2 על-ידי בחירת רצף הד ספין מהיר במשקל T2.
   1. אם אתה משתמש בסורק MRI 4.7T, הזן את הפרמטרים הבאים לתוכנת MRI: זמן חזרה = 3,000 אלפיות השנייה, זמן הד = 27.50 אלפיות השנייה, מספר ממוצעים = 3, שדה ראייה = 18.0 מ"מ x 18.0 מ"מ, מטריצה = 128 x 128, מספר פרוסות ציריות = 24, עובי = 0.50 מ"מ.
   2. אם אתה משתמש בסורק MRI 9.4T, הזן את הפרמטרים הבאים בתוכנת MRI: זמן חזרה = 5,000 אלפיות השנייה, זמן הד = 66.00 אלפיות השנייה, מרווח הד = 16.50 אלפיות השנייה, מספר ממוצעים = 2, חזרות = 1, גורם נדיר = 8, שדה ראייה = 16.0 מ"מ x 16.0 מ"מ, מטריצה = 256 x 256, מספר פרוסות ציריות = 32, עובי = 0.50 מ"מ.
6. לחץ על הלחצן המשך כדי להתחיל את הרצף.

7. עיבוד וניתוח תמונה

1. השתמש בנתונים מקוריים משוקללים של T2 כדי לנתח את נפח המוח. השתמש בתוכנת סגמנטציה כדי להגדיר באופן ידני את החדרים הצדדיים⁶. לחצו על 'מצב מברשת צבע' ובחרו סגנון מברשת מרובעת . התאימו את גודל המברשת ל-1. לחץ על מפקח הפריסה ובחר תצוגה צירית. לחץ על זום כדי להתאים. מקם את הסמן על התמונה; לעקוב ולמלא את חלל החדר לרוחב.
2. לחץ על סגמנטציה בסרגל הכלים | נפח וסטטיסטיקה כדי להציג את אמצעי האחסון המפולחים.

תוצאות

הצלחת ההזרקה אושרה באמצעים רדיולוגיים ואימונוהיסטוכימיים. בעלי חיים שעברו הזרקת המוגלובין פיתחו חדריות חריפה בינונית כאשר הוערכו באמצעות MRI (איור 2A), עם חדרים רוחביים גדולים יותר באופן משמעותי ב-24 שעות ו-72 שעות לאחר הזרקת המוגלובין בהשוואה לבעלי חיים שהוזרקו על-ידי aCSF (

Discussion

מודל IVH זה המשתמש בהזרקת המוגלובין מאפשר לחקור את הפתולוגיה של IVH בתיווך ספציפי על ידי המוגלובין. עבור מחקרים משלימים, המוגלובין יכול גם להיות מועבר בקלות במבחנה ואינו מבלבל בדיקות ביוכימיות עבור חלבונים המיוצרים על ידי microglia / מקרופאגים הנמצאים בדם שלם.

התיאוריות המוב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL insulin syringe	BD Microfine + Insulin Syringe	230-4533	0.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtube	USA Scientific	1615-5500	Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRI	Agilent/Varian	4.7T/33 cm	Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament suture	ETHICON	667G
9.4T MRI	Bruker	BioSpec 94/20	Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balance	CCURIS Instruments	W3200-320
Artificial CSF (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	Batch No: 72A
Betadine	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable)	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
Ethanol	Decon Laboratories	2701
Heating pad	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobin	MP Biomedicals	100714	LOT NO. SR02321
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizer	VETEQUIP	911103
Light for stereotactic insturment	Dolan-Jenner industries	Fiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	MICRO21	Serial 184034 T08K
MRI software	Bruker BioSpin	Paravision 360 3.2
Oxygen	Airgas Healthcare	UN1072	LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley rats	Charles River Laboratories	Strain code: 001
Stereotactic instrument	KOPF Instuments	Model 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicator	Fischerbrand	23-400-118
Surgical blade	covetrus	#10
Topical triple antibiotic	Triple Antibiotic Ointment	NDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification software	ITK-SNAP	ITK-SNAP 4.0.0 beta