כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית

Summary

הפרוטוקול מתאר שינוי של שיטת גולגי המהירה, אשר ניתן להתאים לכל חלק של מערכת העצבים, עבור הכתמת נוירונים בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם מצחית המדיאלית של החולדה.

Abstract

ספיגת גולגי, באמצעות ערכת הכתמת גולגי עם התאמות קלות, משמשת להפריית קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס החולדה ובקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית. טכניקה זו היא שיפור ניכר לעומת שיטות קודמות של הספגת גולגי מכיוון שהכימיקלים המעורבים מראש בטוחים יותר לשימוש, נוירונים ספוגים היטב בעקביות, יש הרבה פחות פסולת רקע, ועבור אזור נתון, יש סטיות קטנות מאוד בצפיפות עמוד השדרה בין ניסויים. יתר על כן, המוח יכול להצטבר לאחר נקודה מסוימת ולשמור קפוא עד עיבוד נוסף. באמצעות שיטה זו ניתן ללמוד כל אזור מעניין במוח. לאחר מוכתם וכיסוי החליק, צפיפות עמוד השדרה דנדריטי נקבע על ידי ספירת מספר קוצים לאורך דנדריט מבוטא כמו צפיפות עמוד השדרה לכל 10 מיקרומטר דנדריט.

Introduction

השיטה של שימוש באשלגן דיכרומט וכסף חנקתי לתיוג נוירונים תוארה לראשונה על ידי קמילו גולגי ^1,2 ולאחר מכן שימשה את סנטיאגו רמון y Cajal כדי לייצר גוף עצום של עבודה המבדילה תת-סוגים עצביים וגליאליים. ספר שפורסם לאחרונה עם האיורים שלו זמין כעת³. בעקבות מחקריו של רמון y Cajal, אשר פורסמו לפני יותר מ -100 שנה, מעט מאוד ספיגה גולגי שימש. הספגת גולגי היא תהליך מייגע המאפשר הדמיה תלת ממדית של נוירונים עם מיקרוסקופ אור. היו שינויים רבים בשיטת Golgi לאורך השנים כדי להפוך את השיטה לקלה יותר ואת הכתמים עקביים יותר⁴. בשנת 1984, Gabbott ו Somogyi⁵ תיארו את הליך ההספגה גולגי סעיף אחד שאיפשר עיבוד מהיר יותר. שיטת הספגה גולגי זו דורשת זלוף עם 4% paraformaldehyde ו 1.5% חומצה picric, לאחר קיבוע ואחריו חלוקת ויברטום לתוך אמבטיה של 3% אשלגן dichromate. חלקים רכובים על מגלשות זכוכית, ארבע פינות הכיסוי מודבקות כך שכאשר שקועים בכסף חנקתי, הדיפוזיה הדרגתית. לאחר מכן מכסים נפתחים, חלקים מיובשים, ובסופו של דבר מכסים החליק לצמיתות עם מדיום הרכבה. טכניקה זו שימשה בהצלחה כדי לתייג נוירונים גליה ^6,7,8 בהיפוקמפוס. שיטת גולגי המהירה המתוארת כאן היא שיפור מכיוון שיש הרבה פחות חשיפה הן אשלגן דיכרומט והן חנקתי כסף ולא נעשה שימוש בפרפורמלדהיד וחומצה פיקרית. בנוסף, למרות תאים שהיו ספוגים באמצעות שינויים של שיטת Gabbott ו Somogyi⁵ ניתן לנתח, לעתים קרובות החלקים היו חשופים יתר על המידה או מתחת או נפלו מהשקופיות במהלך שלב ההתייבשות ובאופן כללי, כמה ניסויים היו צריכים להיות משולבים יש מספיק תאים לניתוח.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בערכת הכתמה של גולגי (ראה טבלת חומרים) לתיוג דנדריטים וקוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) של החולדה. היתרונות של שיטה זו על פני קודמים הם שזה מהיר, יש פחות חשיפה לכימיקלים רעילים עבור החוקר ויש כתמים עקביים של נוירונים. הפרוטוקול המתואר להלן שימש עם שינויים קלים כדי להעריך את צפיפות עמוד השדרה דנדריטי בהיפוקמפוס ו- mPFC של החולדה במחקרים רבים 9,10,11,12,13,14,15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת הלב הקדוש והם בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

1. בידוד וחדירה של רקמת המוח

1. פתרונות Premix A ו- B של ערכת הכתמים Golgi 24 שעות לפני השימוש ולשמור בבקבוקים כהים ו / או בחושך. הפוך כ 80 מ"ל של פתרון A ו- B לערבב אשר מספיק כדי לשנות את הפתרון לאחר 24 שעות. יש לאחסן בבקבוקים אטומים.
   הערה: זלוף עם תמיסת מלח או paraformaldehyde אינו הכרחי.
2. להקריב חולדות על ידי גיליוטינה בעקבות המתת חסד פחמן דו חמצני ולהסיר מוחות בתוך שניות. יש לשטוף את המוח בתמיסת מלח במידת הצורך, אך אין צורך בכך.
   1. מניחים את המוח, קליפת המוח כלפי מטה כך ההיפותלמוס גלוי כי החתכים נעשים קדמיים ואחוריים אליו, על משטח שאינו נקבובי. חותכים לבלוק קדמי (מכיל את קליפת המוח הקדם-מצחית) ואת הבלוק האחורי (מכיל את ההיפוקמפוס) כפי שמוצג באיור 1.
3. מקם בלוקים בפתרונות המעורבים מראש של A ו- B, וודא שהם שקועים היטב בפתרון. ודא שאמצעי האחסון של פתרונות A ו- B מספיק כדי לטבול את הבלוקים. יש לאחסן בלוקים בבקבוקים חומים או בבקבוקים שקופים המכוסים בנייר כסף (כדי להרחיק את האור) בחושך בטמפרטורת החדר.
4. החליפו את התמיסה לאחר 24 שעות ושמרו בחושך למשך 13 ימים נוספים בטמפרטורת החדר.
   הערה: אם משתמשים בו עם מוחות עכבר, אין צורך לחסום, וניתן למקם את המוח כולו בתמיסה. אם מכתימים אזורים במוח, השונים בגודלם, ייתכן שהזמן בפתרונות A ו- B ייקבע על ידי ניסוי וטעייה.
5. לאחר שבועיים הרקמה מסתננת היטב עם פתרונות A ו- B, להעביר את הבלוקים לפתרון cryoprotectant (פתרון C בערכת הכתמה Golgi), ולהשאיר אותם במשך 48-72 שעות ב 4 °C (4 °F).
   הערה: לאחר cryoprotection, בלוקים עשויים להיות מוקפאים עד עיבוד נוסף. כמו כן, שימו לב כי כל הפתרונות מהערכה נאספים ונפטרים כפסולת מסוכנת.
6. להקפיא את המוח, קליפת המוח למטה, על מגלשת זכוכית על קרח יבש. פעם קפוא או לחתוך על cryostat או לאחסן ב -80 °C (80 °F) עד חתך באמצעות cryostat.
   הערה: אין להקפיא בחנקן נוזלי מכיוון שהדבר מייצר סדקים ברקמה.

2. חתך של רקמות המוח

1. מניחים כמות קטנה של רקמות בינוניות על צ'אק קריוסטט מקורר מראש. הר בלוקים על צ'אקים קריוסטט על ידי הפשרת צד אחד של הבלוק מעט ביד (בכפפה) והנחתו על מדיום הרקמה.
   הערה: אין צורך להטמיע את הרקמה. הבלוק המכיל את ההיפוקמפוס הוא קצת יותר קל לחתוך מאשר הבלוק עם קליפת המוח הקדם מצחית כי האחרון הוא קדמי לקורפוס callosum ושני החצאים נפרדים.
2. חותכים מקטעי 100 מיקרומטר על קריוסטט ב -22 °C (60 °F) ולהעלות על שקופיות subbed. ניתן להשתמש במקטעים עד 150 מיקרומטר של עובי. נסה להרכיב 3-4 מקטעי coronal לכל שקופית כמו זה מקטין את מספר השקופיות הדורשות עיבוד. השתמש באחת מהטכניקות הבאות כדי לשמור על החלקים קפואים עד שהם נכנסים לשקופית.
   הערה: מקטעים אלה אינם קבועים בדרך הרגילה ולכן הם נוטים להינמס במהירות. אפשר למקטעים להינמס בשקופית. אם הם מתחילים להינמס לפני שהם ממוקמים על השקופית, אי אפשר לגרום להם להיות שטוחים על השקופית. ישנן מספר טכניקות לעשות זאת.
   1. השתמש בתרסיס הקפאה על הסכין והבלוק. בהתאם לטמפרטורה ולחות בחדר, ייתכן שיהיה צורך בכל חלק. השתמשו בלוח האנטי-רול או במברשת כדי לשמור על החלק שטוח בזמן החיתוך.
      הערה: הקפד לקבל מספיק תרסיס הקפאה. מספר פחיות ניתן להשתמש בעת חיתוך 20 בלוקים.
   2. להפשיר את ההר, אם אפשר, באמצעות שקופית טמפרטורת החדר במהירות appose אותו לחלק. עם תרגול, אפשר להרכיב כמה חלקים בבת אחת. אם זה לא עובד, לשמור שקופיות בקריוסטט כך שהם קרים מאוד ולהעביר את החלק עם מלקחיים קרים או מברשת צבע קרה ולאחר מכן להפשיר הר.
3. נקו את הסכין עם מגבוני נייר בין הפרוסות. אם הסכין דורשת ניקוי נוסף, השתמש 100% אתנול (EtOH), ולתת לו להתייבש לפני חיתוך הפרוסה הבאה.
4. לאחר ההתקנה על המגלשה, מניחים את השקופית שטוחה על מגשי שקופיות קרטון ולאפשר למקטעים להתייבש בטמפרטורת החדר (למשך מספר שעות עד 48 שעות לכל היותר) בחושך. אל תכסה את מגש השקופיות. ודא כי החלקים יבשים לחלוטין לפני כניסת גולגי. יש לאחסן שטוח, בחושך, על מגשי שקופיות עד לספיגת גולגי.
   הערה: ייבוש המקטעים אינו גורם נזק.

3. הכתמה והתייבשות של רקמת המוח

1. בצעו ויטראז'ים במנות ויטראז' מזכוכית. יש לערבב את הפתרונות D ו-E מיד לפני ההכתמה. לפי הפרוטוקול, הוסף חלק אחד של פתרון D, חלק אחד של פתרון E ושני חלקים של מים מזוקקים. עבור כלי ויטראז 'זכוכית, לעשות פתרון 200 מ"ל כדי להטביע לחלוטין את החלקים. עבור צנצנות קופלין, זה דורש פחות נפח.
2. מקם שקופיות בארון תקשורת במרווחים רחוקים מספיק זה מזה כדי לאפשר גישה לפתרון למקטעים.
3. מניחים חלקים במים מזוקקים במשך 4 דקות (2x) לפני שמכניסים אותם לתמיסת הכתמת הספיגה של גולגי למשך 10 דקות. שנה את תמיסת ההכתמה כל 70 חלקים. שנה את המים המזוקקים כאשר הוא הופך צהוב.
   הערה: התזמון של שלב ההכתמה הוא קריטי. קצר מדי אינו מאפשר מספיק כתמים וגורמים ארוכים מדי על כתמים, מה שהופך את הדנדריטים קשה להפריד בעת ביצוע ניתוח. ברגע שמחוץ לתמיסת ההכתמה התזמון פחות קריטי.
4. ייבשו את הסעיפים כדלקמן: 70% EtOH (5 דקות), 95% EtOH (5 דקות; 2x), 100% EtOH (5 דקות; 2x), חומר סליקה (5 דקות; 3x). שנה את כל הפתרונות לעתים קרובות, במיוחד 100% EtOH וסוכן סליקה כדי להבטיח את החלקים להישאר נטולי מים.
   הערה: אין צורך לעבור שלב EtOH של 50%. אין צורך בהבעת מונים להדמיה של תאים מכיוון שהספגת גולגי מספקת ניגודיות מספקת. השימוש בחומרי סליקה אחרים לא עבד כמו גם זה המשמש כאן (ראה טבלת חומרים).
5. כיסוי עם כיסוי זכוכית באורך 60 מ"מ עם כמות נדיבה של מדיום הרכבה. ודא שיש, כמה שפחות בועות אוויר. במידת הצורך, להסיר בזהירות, ולעשות שוב את המכסה (ניתן לעשות זאת גם שבועות לאחר מכן). לעשות את זה לאט מאוד כדי לא לפגוע בקטע (יכול להיעשות בגלל כמות גדולה של מדיום הרכבה).
   הערה: כמות גדולה של מדיום הרכבה היא מבולגנת במקצת אך עדיין הכרחית מכיוון שיש להשתמש במדיום הרכבה מספיק כדי לכסות את החלקים העבים של 100 מיקרומטר.
6. כדי להבטיח כי רק כיסוי אחד ממוקם על המקטעים, להפריד את כיסויים מראש של התהליך.
7. לאחר שהכיסוי החליק, החלקות היבשות שטוחות על כל נייר שאינו נקבובי במשך 3-5 ימים, מעבירות אותם מעט, במיוחד לאחר היום הראשון, כדי למנוע דבק. לאחר 3-5 ימים להעביר את השקופיות למחזיקי שקופיות, באופן אידיאלי, שקופיות יבשות לפחות 3 שבועות לפני בדיקתם. שמור שקופיות שטוחות כדי להקטין את האפשרות של בועות אוויר להרכיב.

4. קביעת צפיפות עמוד השדרה הדנדריטית

1. לניתוח צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי בתאי עצב פירמידליים הן של ה- mPFC והן של אזור CA1 של ההיפוקמפוס, בחן את הדנדריטים הבסיסיים המשניים הצדדיים הצדדיים ביותר ואת הדנדריטים השלישוניים המאוחרים ביותר כמתואר בשלב 4.1.1 (איור 2).
   1. בחר דנדריט, מדוד את אורך הדנדריט באמצעות תוכנית ניתוח תמונה, ספור את עמוד השדרה על הדנדריטים באמצעות מונה ידיים, ורשום הן אורך והן מספר קוצים.
2. למד וניתח שישה תאים לכל אזור (mPFC, CA1) לכל מוח. לכמת לפחות שישה מוחות לכל קבוצה כפי שתואר בעבר ^7,8. בחר נוירונים העונים על הקריטריונים הבאים לניתוח: גופי תאים ודנדריטים ספוגים היטב; דנדריטים נבדלים מתאים סמוכים והם רציפים.
3. ספרו את קוצים בגודל 1000x (טבילה בשמן) בספירה ידנית עם מיקרוסקופ אור ומדדו אורך דנדריטי באמצעות תוכנית ניתוח תמונה. חשב את צפיפות עמוד השדרה על ידי חלוקת מספר עמוד השדרה באורך הדנדריט והבע נתונים כמספר קוצים / 10 מיקרומטר דנדריט.
   הערה: ישנן שיטות מתוחכמות בהרבה להבחנה בין תת-סוגים של עמוד השדרה לבין ארכיטקטורה דנדריטית שניתן להשתמש בהן, אך ספירת ידיים עם מיקרוסקופ אור בגודל 1000x יכולה לתת תוצאה מהירה שיכולה לקבוע אם יש צורך בחקירה נוספת. למרות שנעשה כל מאמץ לדגום באופן עקבי דנדריטים דומים, ישנן וריאציות בעובי שעשויות להשפיע על הספירה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות שיטת Golgi המהירה, תאים הם ספוגים היטב באופן עקבי, כך שיש הרבה תאים לנתח. זהו שיפור ניכר לעומת שיטות קודמות שבהן היה צורך לאגד ניסויים כדי שיהיו מספיק נתונים לניתוח. לכן, ניתן לעבד דגימות נוספות בבת אחת וניתן לאחסן את המוח קפוא עד לעיבוד. דוגמאות לתאים ספוגים של גולגי באזור CA1 של ההיפוק?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה של הספגת גולגי המאפשרת עיבוד סימולטני מהיר של חלקים רבים. זהו שיפור לעומת^{שתוארו בעבר 5} שיטות עתירות עבודה יותר, בעקביות מניב נוירונים ספוגים לניתוח. בנוסף, יש פחות חשיפה לכימיקלים רעילים המשמשים בהספגת גולגי. החלק המאתגר ביותר של התהליך הוא מקבל את ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck