JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים את שיטת הייצור של מערכת אופטרודה עם סיבים אופטיים להעברת אור ומערך אלקטרודות להקלטה עצבית. ניסויי In vivo עם עכברים מהונדסים המבטאים את channelrhodopsin-2 מראים את ההיתכנות של המערכת לגירוי אופטוגנטי סימולטני ורישום אלקטרופיזיולוגי.

Abstract

במהלך העשור האחרון, אופטוגנטיקה הפכה לכלי חיוני לחקר אותות עצביים בשל יכולתה הייחודית של אפנון או ניטור עצבי סלקטיבי. מכיוון שניתן להנדס גנטית סוגים מסוימים של תאי עצב כדי לבטא חלבוני אופסין, אופטוגנטיקה מאפשרת גירוי אופטי או עיכוב של תאי העצב שנבחרו. היו מספר התקדמות טכנולוגית במערכת האופטית לאופטוגנטיקה. לאחרונה הוצע לשלב את מדריך הגל האופטי להעברת אור עם הקלטה אלקטרופיזיולוגית כדי לעקוב בו זמנית אחר התגובות העצביות לגירוי אופטוגנטי או לעיכוב. במחקר זה פותח מערך אופטרודות מושתל (2x2 סיבים אופטיים) עם אלקטרודות רב-ערוציות משובצות.

דיודה פולטת אור (LED) שימשה כמקור אור, ומערך מיקרולנים מיקרו-דחוסים שולב כדי לספק עוצמת אור מספקת בקצה הסיבים האופטיים. מערכת מערך האופטרודות כוללת את החלק החד פעמי ואת החלק הניתן לשימוש חוזר. לחלק החד פעמי יש סיבים אופטיים ואלקטרודות, בעוד שלחלק הניתן לשימוש חוזר יש את ה- LED והמעגלים האלקטרוניים לבקרת אור ועיבוד אותות עצביים. העיצוב החדשני של מערכת מערך האופטרודים המושתל מוצג בסרטון הנלווה בנוסף להליך של ניתוח השתלת אופטרודה, גירוי אור אופטוגנטי ורישום עצבי אלקטרופיזיולוגי. התוצאות של ניסויי in vivo הראו בהצלחה קוצים עצביים נעולים בזמן המתעוררים על ידי גירויי האור מתאי עצב מעוררים בהיפוקמפוס של עכברים.

Introduction

רישום ושליטה בפעילות עצבית חיוניים להבנת האופן שבו המוח מתפקד ברשת עצבית וברמות התאית. שיטות הקלטה אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונליות כוללות את מהדקהמדבקה 1,2,3,4 באמצעות מיקרופיפט והקלטה חוץ-תאית באמצעות אלקטרודות מיקרונורליות 5,6,7,8. כשיטת נוירומודולציה, גירוי חשמלי שימש לעתים קרובות כדי לעורר ישירות אזור מוח מוקדי באמצעות דה-פולריזציה ישירה או עקיפה של תאי עצב. עם זאת, השיטה החשמלית אינה יכולה להבחין בין סוגי תאים עצביים להקלטה או לגירוי מכיוון שהזרמים החשמליים התפשטו לכל הכיוונים.

כטכנולוגיה מתפתחת, האופטוגנטיקה הביאה לעידן חדש בהבנת האופן שבו מערכת העצבים פועלת 9,10,11,12,13,14,15,16. המהות של טכניקות אופטוגנטיות היא להשתמש באור כדי לשלוט בפעילות של חלבוני אופסין רגישים לאור המתבטאים על ידי תאים מהונדסים גנטית. לפיכך, אופטוגנטיקה מאפשרת אפנון או ניטור מתוחכמים של תאים שנבחרו גנטית במעגלים עצביים מסובכים14,17. השימוש הרחב יותר בגישה האופטוגנטית הצריך רישום עצבי סימולטני כדי לאשר ישירות נוירומודולציה אופטית. לכן, מכשיר משולב עם פונקציות בקרת אור והקלטה יהיה בעל ערך רב 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

ישנן מגבלות של גירוי אופטוגנטי קונבנציונלי, מבוסס לייזר, הדורש מערכת העברת אור מגושמת ויקרה 26,27,28,29,30. לכן, כמה קבוצות מחקר השתמשו בבדיקות סיליקון מבוססות μLED כדי למזער את גודל מערכת העברת האור 31,32,33,34. עם זאת, קיים סיכון לנזק מוחי תרמי הנגרם על ידי מגע ישיר עם μLEDs בשל יעילות המרת האנרגיה הנמוכה של נוריות LED. מדריכי גלים קלים, כגון סיבים אופטיים, SU-8 ואוקסיניטריד סיליקון (SiON), יושמו כדי למנוע נזק תרמי 30,35,36,37,38,39. עם זאת, לאסטרטגיה זו יש גם חיסרון בשל יעילות הצימוד הנמוכה שלה בין מקורות האור לבין מנחי הגלים.

מערך המיקרולנים הוצג בעבר כדי לשפר את יעילות צימוד האור בין נוריות LED לסיבים אופטיים40. מערכת אופטרודה פותחה על בסיס טכנולוגיות של מערכות מיקרואלקטרומכניות (MEMS) לגירוי אופטי והקלטה חשמלית בקנה מידה זעיר40. מערך המיקרולנים בין LED לסיבים אופטיים הגדיל את יעילות האור ב-3.13 dB. כפי שניתן לראות באיור 1, מערך סיבים אופטיים בגודל 2x2 מיושר על מערך המיקרולנים בגודל 4x4, ונורית ה-LED ממוקמת מתחת למערך המיקרולנים. הסיבים האופטיים 2x2 מותקנים במקום 4x4 כדי להפחית את הנזק המוחי. מערך אלקטרודות טונגסטן ממוקם בצמוד למערך האופטרודה באמצעות סיליקון דרך חורים להקלטה אלקטרופיזיולוגית (איור 1B).

המערכת מורכבת מחלק חד פעמי עליון וחלקים תחתונים הניתנים להסרה. החלק החד-פעמי העליון, הכולל את מערך הסיבים האופטיים, מערך המיקרולנים ומערך האלקטרודות של טונגסטן, מתוכנן להיות מושתל באופן קבוע במוח לצורך ניסויי in vivo . החלק התחתון כולל מקור אור LED וקו אספקת חשמל חיצוני, הניתן להסרה בקלות ולשימוש חוזר לניסוי אחר בבעלי חיים. כיסוי פלסטיק הניתן לחיבור מגן על החלק החד-פעמי כאשר החלק הניתן להסרה מוסר.

ההיתכנות של המערכת מאומתת על ידי השתלה במוחם של עכברים מהונדסים המבטאים channelrhodopsin-2 (ChR2) בתאי עצב חיוביים של חלבון קינאז II התלויים ב-Ca2+/calmodulin (CaMKIIα::ChR2 mouse). אלקטרודות רישום שימשו לתיעוד הפעילויות העצביות של נוירונים בודדים במהלך גירוי אופטי של הנוירונים.

Protocol

הטיפול בבעלי חיים וההליכים הכירורגיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת Ewha Womens (מס ' 20-029).

1. הכנת מערך אופטרודה (איור 1 ואיור 2)

  1. חברו סיבים אופטיים למערך המיקרולנים.
    1. הסר את ציפוי הפאסיביציה של הסיב האופטי וחתך אותו לחתיכות באורך 5 מ"מ באמצעות קליבר סיבים אופטיים מדויק.
    2. טבלו את הסיבים האופטיים בשרף ה-UV הצלול והניחו את הסיבים האופטיים על מערך המיקרולנים.
    3. לרפא את השרף באמצעות מנורת UV.
    4. חברו את מערך המיקרולנים למארז המודפס בתלת-ממד באמצעות אפוקסי.
  2. יישור חוטי טונגסטן מצופים פרפלואורואלקוקסי (PFA).
    1. הלחימו את 4 החלקים של חוטי טונגסטן PFA באורך 30 מ"מ וחוט כסף אחד למחבר הנקבה בעל 5 פינים, 1.27 מ"מ. השתמש בחוט כסף כאלקטרודת ייחוס.
    2. חברו את המחבר הנקבי בקוטר 1.27 מ"מ לקדם-משענת הראש.
    3. הנח בזהירות חוטי טונגסטן דרך הסיליקון דרך החורים (איור 1B) כדי לסייע ביישור העדין של אלקטרודות הטונגסטן.
    4. חתכו את חוטי הטונגסטן המיושרים ב-1 מ"מ קצרים יותר מאורך הסיבים האופטיים.
    5. חבר את המחבר למארז המודפס בתלת-ממד באמצעות אפוקסי.
  3. מיקום לד
    1. מקם את נורית ה- LED במארז המודפס בתלת-ממד.
    2. חבר את הנורית למעגל המניע שמייצר אפנון רוחב פולסים (PWM).
      הערה: פולס ה-PWM נוצר על-ידי המיקרו-בקר.
    3. בהתחשב ברעש המושרה על ידי מעגל הנהיגה LED, ודא שאלקטרודות ההקלטה רחוקות ב-50 מ"מ ממעגל הנהיגה LED.
    4. מדוד את עוצמת האור בקצה קצה הסיב האופטי באמצעות פוטודיודה.
  4. יש לטבול את אלקטרודות הטונגסטן והסיבים האופטיים באלכוהול למשך 15 דקות. לאחר מכן לטבול את המערכת במים D.I סטריליים ולעקר עם גז אתילן אוקסיד.

2. ניתוח השתלה (איור 3 ואיור 4)

הערה: יש לעקוב אחר טכניקה סטרילית במהלך הניתוח.

  1. הכן את בעלי החיים המהונדסים, אשר מהונדסים גנטית כדי לבטא חלבוני אופסין רגישים לאור בסוג הספציפי של תאי העצב.
    הערה: זכר, עכבר מהונדס בן חודשיים, מבטא channelrhodopsin-2 (ChR2) בתאי עצב חיוביים לחלבון קינאז II התלויים ב-Ca2+/calmodulin (CaMKIIα::ChR2 mouse) שימש במחקר זה41.
  2. הרדימו את העכבר בקוקטייל קטמין-קסילאזין - תערובת של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) - על ידי מתן תוך-צפק.
    1. בדוק את החיה המורדמת כל 30 דקות על ידי ניטור תנועת השפם והתגובה לצביטת הכפה.
    2. הזריקו את קוקטייל הקטמין-קסילאזין במחצית מהמינון הראשוני אם יש צורך בהרדמה נוספת.
  3. גילחו את עור הראש והניחו את העכבר המרומם במסגרת הסטריאוטקטית.
    הערה: בצע הכנה כירורגית לעור ועטוף חיה. הכנת העור כוללת הסרת שיער ולאחר מכן ניקוי העור עם חומרים אנטי מיקרוביאליים.
    1. מקמו את הראש בתוך המסגרת הסטריאוטקטית והכניסו מוטות אוזניים לתוך הבשר.
    2. מרכז את ראש העכבר במסגרת הסטריאוטקטית על ידי התרופפות והידוק חוזרים ונשנים של מוטות האוזניים למיקום מדויק.
    3. מקם את המוט החותך כך שהחותכות העליונות יתכוו מעל הקצה הפנימי הקדמי.
    4. התאימו את מוט החותך לקביעת גובה מוט החותך והידקו את מהדק האף כנגד החוטם.
    5. הפעילו את משטח החימום התרמי המוטמע במסגרת הסטריאוטקטית מראש כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב-37 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליכים הכירורגיים.
    6. הכניסו את הגשושית התרמית לפי הטבעת של העכבר לוויסות ביתי.
      הערה: יש לבדוק את מיקום מוט האוזן על ידי אחיזה עדינה והתנדנדות של החוטם. יש להתאים מחדש את מוט האוזן אם ניתן להזיז את החוטם ביותר מ~4 מ"מ לרוחב.
  4. כסו את העיניים בג'לי נפט (ראו טבלת החומרים) כדי למנוע יובש.
  5. הזריקו 1% לידוקאין לקרקפת. הרימו את עור הראש עם מלקחיים, הבטיחו מקום הזרקה והזריקו את הלידוקאין מתחת לקרקפת.
  6. בצע חתך sagittal באמצעות אזמל ומספריים עדינים. החזיקו את העור המעוגל במיקרו-רמה כדי להרחיב את הנראות של האזור הכירורגי.
    הערה: אורך החתך הוא <1 ס"מ מעל ברגמה וקצה קאודלי של העצם הבין-פריאלית.
  7. מסירים את הפריוסטאום באמצעות צמר גפן. אם יש דימום, לצבוט את הגולגולת באמצעות bovie כדי לאטום את כלי הדם.
  8. נקה את הגולגולת עם מלח וסמן את אתרי הגולגולת באמצעות זרוע מניפולטור: היפוקמפוס קדמי-אחורי (AP) −1.8 עד −2.8 מ"מ, מדיאלי-לרוחבי (ML) 0.5-2.5 מ"מ, ודורסל-גחון (DV) −1 עד −2 מ"מ.
    הערה: בהתחשב בעובי גולגולת העכבר, הכנס את מערך optrode -1.2 עד -2.2 מ"מ מאזור המוח החשוף. בהינתן מסלול ההיפוקמפוס, תאים פירמידליים של CA3 שולחים את האקסונים שלהם ל-CA1. לכן, סיבים אופטיים הם 1 מ"מ ארוך יותר מאשר אלקטרודות הקלטה, כך הסיבים האופטיים ממוקמים CA3 ואת אלקטרודות ההקלטה ב CA1.
  9. קודחים חור מעל המוח הקטן ומחדירים בורג לקרקע. שים את בורג הקרקע בעומק 0.5 מ"מ עם בורג מדויק עד שהוא מגיע לחלק העליון של המוח הקטן.
    הערה: יש לוודא הכנסה הדוקה של הבורג, אשר ישמש כאלקטרודה קרקעית ומבנה תומך כדי למקסם את היציבות ארוכת הטווח של ההשתלה, שכן הוא מגדיל את המשטח התלת-ממדי להדבקת המלט הדנטלי.
  10. קודחים את האזור המסומן ומוציאים חתיכה מהגולגולת עם מלקחיים.
  11. כופפו קצה מחט של 26 גרם ל-120 מעלות בכיוון השעון, וחשפו את אזור המוח על ידי החדרת הצד המשופע של המחט הפונה כלפי מעלה. היזהרו שלא לפגוע במוח ובכלי הדם.
  12. נקו את המוח החשוף עם מלוחים כדי לשטוף אבק עצמות וחומר זר.
  13. תקן את מערך האופטרודה בזרוע המניפולטור והתקרב לאזור החשוף.
    הערה: בעת הצבת ההתקן, חישוב מחדש של אזור היעד שוב מהברגמה יכול להגדיל את דיוק המיקום.
  14. הכניסו באיטיות את מערך האופטרוד וחברו את בורג ההארקה לחוט הכסף המחובר למערכת42.
    הערה: בתהליך זה, יש לקבע את המערך בחוזקה לזרוע המניפולטור כדי למזער את ההתנדנדות כדי למנוע נזק מוחי ממיקרו-תנועה במהלך ההחדרה. ההחדרה חייבת להתבצע באיטיות, עם מנוחה למשך 10 דקות כדי להסביר את הנפיחות במוח שאולי נלחצה לאחר ההחדרה. מהירות החדרה מתחת ל-1 מיקרומטר לשנייה לתוך רקמת המוח מומלצת לאיכות הגבוהה של יחס האות לרעש ולמספר היחידות הבודדות הניתנות להפרדה42.
  15. אם יש דימום, להפעיל לחץ ישיר על דימומים עם צמר גפן יבשה ספוגית או להשתמש cautery. אל תעברו לשלבים הבאים עד שהדימום ייעצר לחלוטין.
  16. החדירו קצף ג'ל בין המוח החשוף לבין המכשיר כדי להגן על כימיקלים מפני מגע ישיר עם המוח.
    הערה: קצף ג'ל גם עוזר להמוסטאזיס ושומר על לחות המוח.
  17. נגבו את הגולגולת במטושים מכותנה כדי להסיר לחות ככל האפשר, והמשיכו לשלב הקיבוע הבא.
  18. יש למרוח בזהירות מלט דנטלי על הגולגולת כדי לתקן את המכשיר ולכסות את קצף הג'ל. לפני שהמלט הדנטלי מוקשה לחלוטין, הפרד את הקרקפת אם הוא מחובר למלט דנטלי. משכו את העור המעוגל במלקחיים כדי לכסות את המלט הדנטלי הקשוח ותפרו את הקרקפת. לאחר מכן, שחרר את המכשיר מזרוע המניפולטור.
    הערה: ודא שהמלט הדנטלי אינו נדבק לעור ומכסה רק את אזור הגולגולת. כאשר העור גדל, הוא יכול לדחוף את המלט משם, ובסופו של דבר, המכשיר ייפול. זה יגרום לבעיה קריטית עבור ניסויי in vivo ארוכי טווח.

3. החלמה וטיפול בשתלים

  1. הוציאו את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקטית.
  2. נהלו את תמיסת קרפרופן באמצעות מחט 26 גרם. יש להזריק פעם אחת לפני הניתוח ו-12 שעות (למחרת בבוקר במקרה של ניתוח אחר הצהריים) ו-24 שעות לאחר הניתוח כדי להפחית את הכאב.
    הערה: ריכוז התרופה בבקבוק הוא 50 מ"ג / מ"ל, והוא מאוחסן ב -4 מעלות צלזיוס. קרפרופן הוא צמיג וצריך לדלל אותו במים סטריליים 1:10. אם הסטריליות נשמרת, ניתן לאחסן את התמיסה עד 4 שבועות. כדי לשמור על משך הזמן האפקטיבי של התרופה, להזריק את הפתרון Carprofen במרווחים של 12 שעות.
  3. הניחו את העכבר על משטח החימום ובדקו אם הוא מתאושש היטב מההרדמה.
    הערה: החיה אינה נשארת ללא השגחה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת.
  4. הסר את חוטי התפר 7 - 10 ימים לאחר הניתוח.
  5. אפשרו לבעל החיים להתאושש במשך שבוע אחד. עקוב אחר צריכת המזון והמים בזמן ההתאוששות. לנהל את משכך הכאבים ולבדוק את הסימנים של אי נוחות או כאב.
    הערה: בעלי החיים שעברו ניתוח אינם יכולים להישאר עם בעלי החיים האחרים עד שהם מתאוששים לחלוטין.
    1. במהלך תקופת ההחלמה, שקלו את העכבר מדי יום כדי לבדוק אם יש שינויים במשקל. הקרב את העכבר (ראה סעיף 6) אם יש ירידה של 20% במשקל בהשוואה לבעלי חיים תואמי גיל ומין.

4. גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי

  1. מרדימים את העכבר ומניחים את העכבר המרדים במסגרת הסטריאוטקטית.
  2. הגדר את פרמטרי הגירוי.
    1. הגדר את מתכון פולס האור למחזור עבודה של 4% ותדר 10 הרץ43. הגדר את גירוי האור למשך 2 שניות (20 פולסים) במהלך הקלטה עצבית.
    2. השתמש בזרם של 50 mA כדי להניע עוצמת אור של 3 mW/mm2 בקצה הסיבים האופטיים. מדוד את עוצמת האור באמצעות פוטודיודה ומד הספק וחלוק את עוצמת האור באזור פן הסיבים האופטיים.
  3. הורידו את כיסוי הפלסטיק והצמידו את החלק העליון המכיל את מערכת אספקת האור עם הנורית והמעגלים הרב-פעמיים.
  4. חברו את המקדם-מהאמפיפייר של עמוד הראש למחבר 5 הפינים המושתל.
  5. פתח את התוכנה כדי להקליט אותות עצביים.
  6. הגדר את מסנני התוכנה. השתמש במסנן bandpass ב- 0.1-20 kHz ובמסנן חריץ ב- 60 Hz. הגדר את קצב הדגימה של המגבר ל- 20 kHz.
  7. לפני ההקלטה, בדוק אם אותות הספייק העצביים מזוהים.
    הערה: ביטול רעשים חשוב מכיוון שאותות עצביים קטנים מדי. אם רמת הרעש גבוהה מדי, אותות עצביים עלולים להיות מוסתרים על ידי רעש ולהפוך לבלתי נראים. השתמש בהארקה מתאימה ובהגנה על גלים אלקטרומגנטיים כדי להפחית רעש.
  8. לאחר בדיקת האותות, הקלט אותות עצביים ללא גירוי אור להקלטה בסיסית.
  9. ספקו אור LED ותעדו בו-זמנית תגובות עצביות (איור 5 ואיור 6).
    הערה: לאחר גירוי, ניסוי הגירוי הבא חייב להתבצע לאחר מרווח של לפחות 5 דקות, כך שהפעילות העצבית שהתעוררה על ידי הגירוי הקודם לא תשפיע על הניסוי הבא.

5. ניתוח נתונים

  1. טען את הנתונים שנרכשו באמצעות תוכנית MATLAB.
  2. קבל פעילויות עצביות בודדות באמצעות אלגוריתם מיון ספייק "Wave-Clus"44,45. זהה את הקוצים בכל ערוץ על ידי סף משרעת כמו ב- Eq (1)45.
    סף = 5 × חציון figure-protocol-9869 (1)
    כאשר x הוא האות המסונן בפס פס.
    1. כדי להתקין "Wave-Clus", עיין בקישור ההורדה בטבלת החומרים.
    2. כדי לפתוח את ממשק המשתמש הגרפי (GUI), הקלד wave_clus בשורת הפקודה של MATLAB.
    3. הקלד את הפונקציה Get_spikes('filename.ext') עבור סיומת קובץ המוכנה לזיהוי ספייק. לאחר מכן, הפעל Do_clustering ('filename_spikes.mat') למיון ספייק.
  3. ספרו את הקוצים הממוינים לפני, במהלך ואחרי גירוי האור בעזרת סלים ספציפיים. השתמש בפסלי זמן של 0.2 שניות ו-2 שניות לניתוח.
  4. תרשים את מספר העליות מכל ערוץ הקלטה.
    הערה: ממוצע עם שגיאת תקן של האמצעים (SEM) של הנתונים מתוצאות 8 ניסויים חוזרים חושב והתווה.

6. המתת חסד

  1. לאחר כל הניסויים, להקריב את העכבר על ידי שאיפת פחמן דו חמצני (CO2).
  2. מבלי לטעון מראש את התא, הניחו את העכבר בתא המתת החסד השקוף, ללא אספקת CO2 ו/או דליפות.
  3. הפעל את גז CO2 , והעקר את האוויר בקצב של 30 - 50% מנפח האוויר של תא המתת חסד לדקה.
    הערה: יש לחבר מד זרימה לבלון הגז CO2 כדי להבטיח שקצב תזוזת האוויר יהיה 30-50% מנפח תא המתת החסד לדקה.
  4. עקוב אחר העכבר שהוקרב מחוסר נשימה ושינה את צבע העיניים.
    הערה: הזמן הצפוי להמתת חסד הוא בדרך כלל בתוך 10 עד 15 דקות.
  5. לאחר התבוננות בסימני המוות, הסר את העכבר מתא המתת החסד.
  6. כדי להשלים את הליך המתת החסד, לאמת את המוות על ידי אישור דום נשימה ודום לב.

תוצאות

מערכת optrode מיוצרת בהצלחה כדי לספק מספיק כוח אור כדי להפעיל את נוירוני המטרה. היישור העדין של אלקטרודות הטונגסטן מושג באמצעות הסיליקון המיקרו-פבריקטי דרך החורים. עוצמת האור הנמדדת היא 3.6 mW/mm2 בקצה הסיב האופטי כאשר מופעל זרם של 50 mA. המיקרולנים הגדילו את יעילות האור ב-3.13 dB. בשל מערך המיקרו...

Discussion

ההיתכנות של המערכת לגירוי אופטוגנטי סימולטני ולרישום אלקטרופיזיולוגי אומתה (איור 6). הקוצים הגדולים במהלך גירוי האור הם ממצאים פוטואלקטריים המתרחשים במקביל לגירוי האור (איור 6A). זה ברור בתצוגה המוגדלת של צורת הגל במלבן המקווקו האדום (איור 6A...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המו"פ הטכנולוגית המתכנסת להגדלת האדם באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), במימון משרד המדע וה-ICT (NRF-2019M3C1B8090805), ונתמך על ידי מענק של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (מס ' 2019R1A2C1088909). אנו מודים למעבדה של סונג-הי לי במחלקה למדעי הביולוגיה, KAIST, טג'און, קוריאה, על שסיפקה בחביבות את העכברים המהונדסים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-pin ConnectorNW3HD127K1.27 mm (.050") pitch
BovieFine Science Tools(F.S.T)18010-00High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition SoftwareIntan Technologies, LLCUSB Interface Board softwareWork with the RHD USB Interface Board
Dental CementLang Dental Manufacturing Company, Inc.1223CLRUse Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator ArmStoelting Co.51904/51906Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel FoamCutanplastStandard (70*50*10 mm)Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage PreamplifierIntan Technologies, LLC#C3314RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating PadStoelting Co.53800RStoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LEDOSLONGB CS8PM1.13λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLABMathWorks, Inc.R2019a
Micro ClampSURGIWAY12-1002-04Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical FiberThorlabs, Inc.FT200UMT0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm
PFA-Coated Tungsten WireA-M SystemCustom orderedRod type, Ø 101.6 μm (.004")
PhotodiodeThorlabsS121C
power meterThorlabs Inc.PM100D
Precision cleaverFITELS326Fiber slicer tool
PrismGraphPad5.01 version
ScalpelFeather™#20Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screwNasa Koreastainless steeldiameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver WireThe Nilaco CorporationAG-401265Ø 200 µm
Stereotaxic FxrameStoelting Co.51500DDigital new standard stereotaxic, rat and mouse
sutureETHICONW9106suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
VaselineUnilever PLCOriginal100% pure petroleum jelly
Wave_ClusN/AN/Ahttps://github.com/csn-le/wave_clus

References

  1. Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86 (2016).
  2. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54024 (2016).
  3. Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
  4. Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23 (2015).
  5. Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
  6. Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
  7. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  8. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
  9. Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
  10. Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
  13. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  14. Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
  15. Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
  16. Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
  17. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  18. Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001 (2012).
  19. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007 (2009).
  21. Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
  22. Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  24. Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
  25. Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027 (2020).
  26. Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024 (2020).
  27. Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777 (2019).
  28. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10 (2018).
  29. Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004 (2017).
  30. Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466 (2015).
  31. Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503 (2020).
  32. Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063 (2020).
  33. Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
  34. Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381 (2016).
  35. Oh, K., Sonsi, Y. -. A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
  36. McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010 (2019).
  37. Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69 (2015).
  38. Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , (2015).
  39. Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
  40. Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), 725 (2021).
  41. Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
  42. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111 (2019).
  43. Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
  44. Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
  45. Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
  46. Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919 (2014).
  47. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
  48. Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007 (2016).
  49. Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343 (2019).
  50. Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -. W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved