מודל של שיפוץ כלי דם הפוכים ביתר לחץ דם ריאתי עקב מחלת לב שמאלית על ידי התייבשות אבי העורקים בחולדות

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך כירורגי להסרת פסים עולים-אבי העורקים במודל של חולדה של יתר לחץ דם ריאתי עקב מחלת לב שמאלית. טכניקה זו חוקרת מנגנונים אנדוגניים של שיפוץ הפוך במחזור הדם הריאתי ובלב הימני, ובכך מודיעה על אסטרטגיות להיפוך יתר לחץ דם ריאתי ו/או תפקוד לקוי של החדר הימני.

Abstract

יתר לחץ דם ריאתי עקב מחלת לב שמאלית (PH-LHD) הוא הצורה הנפוצה ביותר של PH, אך הפתופיזיולוגיה שלו מאופיינת בצורה גרועה מאשר יתר לחץ דם עורקי ריאתי (PAH). כתוצאה מכך, חסרות התערבויות טיפוליות מאושרות לטיפול או מניעה של PH-LHD. תרופות המשמשות לטיפול ב- PH בחולי PAH אינן מומלצות לטיפול ב- PH-LHD, שכן עמידות מופחתת של כלי הדם הריאתיים (PVR) וזרימת דם ריאתית מוגברת בנוכחות לחצי מילוי מוגברים בצד שמאל עלולים לגרום לפירוק לב שמאל ובצקת ריאתית. יש לפתח אסטרטגיות חדשות כדי להפוך את PH בחולי LHD. בניגוד ל-PAH, PH-LHD מתפתח עקב עומס מכני מוגבר הנגרם על ידי גודש דם במחזור הדם של הריאות במהלך אי ספיקת לב שמאלית. מבחינה קלינית, פריקה מכנית של החדר השמאלי (LV) על ידי החלפת מסתם אבי העורקים בחולי היצרות אבי העורקים או על ידי השתלת מכשירי סיוע LV בחולי אי ספיקת לב סופנית מנרמלת לא רק את הלחצים העורקיים הריאתיים והחדר הימני (RV) אלא גם את PVR, ובכך מספקת ראיות עקיפות לשיפוץ הפוך בכלי הדם הריאתיים. באמצעות מודל חולדות מבוסס של PH-LHD עקב אי ספיקת לב שמאלית המופעלת על ידי עומס יתר בלחץ עם התפתחות נוספת של PH, פותח מודל לחקר המנגנונים המולקולריים והתאיים של תהליך שיפוץ הפוך פיזיולוגי זה. באופן ספציפי, בוצע ניתוח פירוק אבי העורקים, שהביא לשיפוץ הפוך של שריר הלב LV ופריקתו. במקביל, ניתן היה לזהות נורמליזציה מלאה של לחץ סיסטולי RV והיפוך משמעותי אך לא שלם של היפרטרופיה של RV. מודל זה עשוי להציג כלי רב ערך לחקר המנגנונים של שיפוץ הפוך פיזיולוגי במחזור הדם הריאתי וב- RV, במטרה לפתח אסטרטגיות טיפוליות לטיפול ב- PH-LHD וצורות אחרות של PH.

Introduction

אי ספיקת לב היא סיבת המוות המובילה במדינות המפותחות וצפויה לגדול ב-25% בעשור הקרוב. יתר לחץ דם ריאתי (PH) - עלייה פתולוגית של לחץ הדם במחזור הדם הריאתי - משפיע על כ -70% מהחולים עם אי ספיקת לב סופנית; ארגון הבריאות העולמי מסווג PH כיתר לחץ דם ריאתי עקב מחלת לב שמאלית (PH-LHD)¹. PH-LHD יזם על ידי תפקוד לקוי של החדר השמאלי הסיסטולי ו/או הדיאסטולי (LV) שמביא ללחץ מילוי גבוה וגודש פסיבי של דם למחזור הדם^{הריאתי 2}. למרות שבתחילה הוא הפיך, PH-LHD מתקבע בהדרגה עקב שיפוץ פעיל של כלי הדם הריאתיים בכל התאים של מחזור הדם הריאתי, כלומר עורקים, נימים וורידים ^3,4. גם PH הפיך וגם PH קבוע מגבירים את עומס ה-RV, ובתחילה מניעים היפרטרופיה אדפטיבית של שריר הלב, אך בסופו של דבר גורמים להתרחבות RV, היפוקינזיס, פיברוזיס ופירוק שמובילים בהדרגה לכשל RV 1,2,5,6. ככזה, PH מאיץ את התקדמות המחלה בחולי אי ספיקת לב ומגביר את התמותה, במיוחד בחולים העוברים טיפול כירורגי על ידי השתלת מכשירי סיוע לחדר שמאל (LVAD) ו/או השתלת לב ^7,8,9. נכון לעכשיו, לא קיימים טיפולים מרפאים שיכולים להפוך את התהליך של שיפוץ כלי דם ריאתיים, ולכן יש צורך במחקר מכניסטי בסיסי במערכות מודל מתאימות.

חשוב לציין כי מחקרים קליניים מראים כי PH-LHD כסיבוך שכיח בחולים עם היצרות אבי העורקים יכול להשתפר במהירות בתקופה המוקדמת שלאחר הניתוח לאחר הניתוח לאחר החלפת מסתם אבי העורקים¹⁰. באופן אנלוגי, עמידות גבוהה (>3 יחידות עץ) טרום ניתוחית לכלי דם ריאתיים (PVR) שהייתה, עם זאת, הפיכה על ניטרופוסיד מנורמלת באופן בר קיימא לאחר השתלת לב במחקר מעקב של 5 שנים¹¹. באופן דומה, הפחתה נאותה של PVR הפיך וקבוע כאחד ושיפור תפקוד ה-RV בחולי LHD יכולים להתממש תוך מספר חודשים על ידי פריקת החדר השמאלי באמצעות מכשירי עזר חדריים מושתלים ובלתי פולסים 12,13,14. נכון לעכשיו, המנגנונים התאיים והמולקולריים המניעים שיפוץ הפוך במחזור הריאתי ובבית הלב RV אינם ברורים. עם זאת, הבנתם עשויה לספק תובנה חשובה לגבי מסלולים פיזיולוגיים שעשויים להיות מנוצלים מבחינה טיפולית כדי להפוך את שיפוץ כלי הדם והקרוואנים של הריאות ב-PH-LHD ובצורות אחרות של PH.

מודל פרה-קליני מתאים המשכפל כראוי את התכונות הפתופיזיולוגיות והמולקולריות של PH-LHD יכול לשמש למחקרים תרגומיים באי ספיקת לב גודשת הנגרמת על ידי עומס יתר בלחץ עקב פסים כירורגיים של אבי העורקים (AoB) בחולדות ^4,15,16. בהשוואה לאי ספיקת לב דומה עקב עומס יתר בלחץ במודל מורין של התכווצות אבי העורקים הרוחבי (TAC)¹⁷, פסים של אבי העורקים העולה מעל שורש אבי העורקים בחולדות AoB אינם מייצרים יתר לחץ דם בעורק הצוואר השמאלי מכיוון שאתר הפסים הוא פרוקסימלי של יציאת עורק הצוואר השמאלי מאבי העורקים. כתוצאה מכך, AoB אינו גורם לפגיעה עצבית בצד שמאל בקליפת המוח כפי שהיא אופיינית ל-TAC¹⁸, ואשר עשויה להשפיע על תוצאות המחקר. בהשוואה למודלים אחרים של מכרסמים של PH-LHD המושרה בניתוח, מודלים של חולדות בכלל, ו-AoB בפרט, מוכיחים שהם חזקים יותר, ניתנים לשחזור ומשכפלים את השיפוץ של מחזור הדם הריאתי האופייני לחולי PH-LHD. יחד עם זאת, קטלניות פריאופרטיבית נמוכה¹⁹. לחצי LV מוגברים ותפקוד לקוי של LV בחולדות AoB גורמים להתפתחות PH-LHD, וכתוצאה מכך לחצי RV גבוהים ושיפוץ קרוואנים. ככזה, מודל עכברוש AoB הוכח כיעיל ביותר בסדרה של מחקרים קודמים על ידי קבוצות עצמאיות, כולל את עצמנו, כדי לזהות פתומכניזמים של שיפוץ כלי דם ריאתיים ולבחון אסטרטגיות טיפול פוטנציאליות עבור PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25.

במחקר הנוכחי, מודל חולדות AoB שימש להקמת הליך כירורגי של פירוק אבי העורקים כדי לחקור מנגנונים של שיפוץ הפוך בכלי הדם הריאתיים וב- RV. בעבר פותחו מודלים של שיפוץ הפוך שריר הלב כגון פירוק אבי העורקים בעכברים²⁶ וחולדות²⁷ כדי לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את הרגרסיה של היפרטרופיה של החדר השמאלי ולבחון אפשרויות טיפוליות פוטנציאליות לקידום שריר הלב שחזור. יתר על כן, מספר מוגבל של מחקרים קודמים בחנו את ההשפעות של פירוק אבי העורקים על PH-LHD בחולדות והראו כי פירוק אבי העורקים עשוי להפוך היפרטרופיה מדיאלית בעורקי ריאות, לנרמל את הביטוי של טרום-פרו-אנדותלין 1 ולשפר את ההמודינמיקה הריאתית^27,28, מה שמספק עדות להיפוך של PH בחולדות עם אי ספיקת לב. כאן, ההליכים הטכניים של ניתוח ההדבקה ממוטבים ומתוקננים, למשל על ידי החלת קנה הנשימה במקום אינטובציה אנדוטרכאלית או על ידי שימוש בקליעי טיטניום בקוטר פנימי מוגדר לפסים אבי העורקים במקום תפרים פוליפרופילן עם מחט קהה^26,27, ובכך לספק שליטה טובה יותר על ההליכים הכירורגיים, יכולת שכפול מוגברת של המודל ושיעור הישרדות משופר.

מנקודת מבט מדעית, המשמעות של מודל פירוק PH-LHD אינה טמונה רק בהדגמת ההיפוך של הפנוטיפ הקרדיווסקולרי והריאותי באי ספיקת לב, אלא חשוב מכך, בזיהוי מניעים מולקולריים המפעילים ו/או מקיימים שיפוץ הפוך בעורקים ריאתיים כמועמדים מבטיחים למיקוד טיפולי עתידי.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בעקבות "המדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן" (המכון למשאבי חיות מעבדה, מהדורה 8 2011) ואושרו על ידי הוועדה הממשלתית המקומית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבעלי חיים של משרד המדינה הגרמני לבריאות ולעניינים חברתיים (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), ברלין; פרוטוקול מס'. G0030/18). ראשית, אי ספיקת לב הושרה בניתוח בחולדות ספראג-דאולי צעירות כ-100 גרם משקל גוף (bw) (ראו טבלת חומרים) על ידי הנחת קליפס טיטניום בקוטר פנימי של 0.8 מ"מ על אבי העורקים העולה (פס אבי העורקים, AoB) כפי שתואר קודם לכן^29,30. בשבוע 3 לאחר AoB (איור 1), בוצע ניתוח פירוק (Deb) להסרת הקליפ מאבי העורקים. ההליכים הכירורגיים והאימות של היפוך PH בחולדות AoB שבוצעו מתוארים באופן סכמטי באיור 1.

1. תכשירים כירורגיים

1. עיקרו את כלי הניתוח הנדרשים (איור 2) על ידי אוטוקלאבינג.
2. הזריקו לחולדה קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג bw) (ראו טבלת חומרים) באופן תוך-צפקי (כלומר) לשיכוך כאבים 30 דקות לפני הניתוח.
3. מרדימים חולדה על ידי הזרקת i.p. של קטמין (87 מ"ג/ק"ג bw) וקסילזין (13 מ"ג/ק"ג bw).
4. יש להסיר את השיער מצווארה וחזהה של החיה באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
5. יש למרוח טיפה של משחה לעיניים כדי להגן על העיניים במהלך הניתוח.
6. מניחים את החולדה במצב שכיבה על שולחן כירורגי מעוקר. בזהירות לתקן את הבטן והגפיים של החיה עם סרט דבק.
   הערה: כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, הניחו מחצלת חימום של 37 מעלות צלזיוס מתחת לשולחן הניתוח. הימנע חימום של אזור הראש כדי למנוע ייבוש של העיניים.
7. יש לחטא את עור בעלי החיים בתמיסת פובידון-יוד/יודופור. שימו לב לצלקות ותפרים מניתוח ה-AoB הראשוני ועטפו את שדה הניתוח.
8. ודא עומק נאות של הרדמה על ידי צביטה בוהן.
   הערה: יש לשלוט בעומק ההרדמה באופן קבוע במהלך הניתוח.

2. טרכאוטומיה ואוורור מכני

הערה: במהלך הניתוח, החליפו כפפות לאחר טיפול בציוד שאינו סטרילי.

1. בעזרת מספריים עדינים (איור 2A), בצעו חתך בקו האמצע הצווארי באורך 7-10 מ"מ (איור 3A).
2. בעזרת זוג מלקחיים קהים (איור 2B'), נתחו את הרקמה הרכה של צוואר הרחם כדי לחשוף את שרירי האינפרהיואידים. לפצל את השרירים בקו האמצע כדי לדמיין את קנה הנשימה. חותכים ומסירים את התפר מניתוח ה-AoB הראשי.
3. בצעו חתך קנה הנשימה של כ-2 מ"מ בין שתי טבעות סחוס באמצעות מספריים קפיץ Noyes זוויתיים (איור 2C,3B). הכניסו את צינורית קנה הנשימה בקוטר חיצוני 2 מ"מ (איור 2D) לקנה הנשימה והצמידו אותה באמצעות תפר משי 4-0 (איור 2E,3C).
4. חברו את צינורית קנה הנשימה למכונת הנשמה מכנית (ראו טבלת חומרים) תוך שמירה על שטח מת למינימום (איור 3D-E). יש לשמור על אוורור ריאות פריאופרטיבי בקצב נשימתי של 90 נשימות לדקה בנפח גאות ושפל (Vt) של 8.5 מ"ל/ק"ג bw.

3. פירוק אבי העורקים

1. צרו חתך עור באורך של כ-20 מ"מ בין הצלעות השנייה והשלישית באמצעות מספריים עדינים (איור 3F).
2. בעזרת מספריים כירורגיים קטנים יותר (איור 2F), פזרו בזהירות את השרירים וחתכו אותם שכבה אחר שכבה (איור 3G). בצע חתך רוחבי של 10 מ"מ לאורך הרווח האינטרקוסטלי בין הצלע השנייה לשלישית.
   הערה: יש לגשת בזהירות לקו האמצעי כדי למנוע דימום.
3. השתמשו במפיץ צלעות (איור 2G) כדי להרחיב את המרחב האינטרקוסטלי בין הצלע השנייה לשלישית כדי ליצור חלון ניתוח (איור 3H).
4. בעזרת מלקחיים קהים (איור 2B,B'), הפרד בזהירות את התימוס מהלב ואת עורקי הצינור כדי לדמיין את אבי העורקים עם הקליפס (איור 4A).
5. החזק את הקליפ בעזרת המלקחיים והסר בזהירות את רקמת החיבור סביב הקליפ כדי לחשוף אותה.
   הערה: הימנעו מהחזקה או הרמה של אבי העורקים עם המלקחיים, שכן הדבר עלול לפגוע באבי העורקים וכתוצאה מכך לדימום ולתוצאה קטלנית.
6. בעזרת מחזיק מחט (איור 2H), פתחו את הקליפס (איור 4B) והסירו אותו מחלל בית החזה.
7. לפני סגירת החזה, פתחו את אטלקטזיס הריאה, הבטיחו גיוס ריאה הולם ללא הבחנת יתר, המשיכו בהנשמה מכנית עם Vt של 9.5 מ"ל/ק"ג bw למשך 10 דקות נוספות, וחזרו ל-Vt של 8.5 מ"ל/ק"ג bw כדי לגייס את הריאות ולפתור פנאומוטורקס אפשרי.
8. סגור את השרירים העמוקים על ידי תפר פשוט מופרע באמצעות משי 4-0. לאחר מכן חברו את השרירים העליונים ואת העור באמצעות תפר רציף פשוט (איור 5A,B).

4. התעלות קנה הנשימה

1. נתקו את צינורית קנה הנשימה ממכונת האוורור. התבוננו בתשומת לב בחולדה עד שהנשימה הספונטנית תתבסס מחדש. אם החיה לא מצליחה לנשום באופן ספונטני עם הניתוק, חברו מחדש את מכונת ההנשמה והמשיכו באוורור למשך 5 דקות נוספות. לאחר מכן חזור על ההליך.
2. לאחר שהנשימה הספונטנית נוצרת מחדש, הסירו את הצינורית מקנה הנשימה ונקו את הנוזל סביב קנה הנשימה באמצעות נקודות ספוג (איור 2I) (ראו טבלת חומרים).
3. סגור את קנה הנשימה באמצעות תפר פשוט באמצעות פרולין 6-0 (איור 2E' ואיור 5C). לאחר מכן סגרו את שרירי האינפרהיואידים בתפר פשוט שנקטע באמצעות משי 4-0 (איור 5D), וחברו את העור בתפר רציף פשוט (איור 5E). נקו וחטאו את השרירים והעור במהלך התהליך בתמיסת פובידון-יוד/יודופור.

5. טיפול לאחר הניתוח

1. לאחר השלמת ההליך הכירורגי, העבירו בזהירות את החיה לכלוב התאוששות עם תוספת חמצן ומנורה אינפרא אדומה כדי לשמור על בעלי חיים חמים ומחומצנים מספיק במהלך שלב ההתאוששות. הניחו את מסכת החמצן קרוב לחוטם של החולדה. שמור רק על בעל חיים אחד לכל כלוב התאוששות בכל עת.
2. לאחר שהחיה מתעוררת, העבירו אותה בזהירות לכלוב רגיל עם מים ומזון. במשך 12 השעות הבאות, לשלוט במצב הבריאותי של החיה המופעלת במרווחים של 2 שעות.
3. לאחר השלמת ההליך הכירורגי, יש למרוח משכך כאבים מדי יום על ידי הזרקת i.p. של קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג bw) למשך שבוע.
4. כדי למנוע זיהום חיידקי, יש לתת אמוקסיצילין (500 מ"ג/ל') במי השתייה למשך שבוע לאחר הניתוח.

תוצאות

ראשית, פירוק מוצלח של אבי העורקים אושר על ידי אקוקרדיוגרפיה טרנסתורקטית שבוצעה לפני ואחרי הליך ההארקה בחיות AoB (איור 6). לשם כך, קשת אבי העורקים הוערכה בתצוגת מצב B של ציר ארוך פארא-סטרנלי (PLAX). המיקום של הקליפ על אבי העורקים העולה בחיות AoB והיעדרו לאחר ניתוח דב הודגם (

Discussion

כאן, דווח על טכניקה כירורגית מפורטת לפירוק אבי העורקים במודל AoB של חולדה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את ההיפוך של PH-LHD ואת המנגנונים התאיים והמולקולריים המניעים שיפוץ הפוך בכלי הדם הריאתיים וב-RV. שלושה שבועות של התכווצות אבי העורקים בחולדות צעירות גורמים ל-PH-LHD הניכרים כלחצי LV מוגברים, היפרטר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxicillin	Ratiopharm	PC: 04150075615985	Antibiotic
Anti-BNP antibody	Abcam	ab239510	Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel	Parker Laboratories	BT-025-0037L	Echocardiography consumables
Bepanthen	Bayer	6029009.00.00	Eye ointment
Carprosol (Carprofen)	CP-Pharma	401808.00.00	Analgesic
Clip holder	Weck stainless USA	523140S	Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-12	Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-09	Surgical scissors
High-resolution imaging system	FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands	VeVo 3100	Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane	CP-Pharma	400806.00.00	Anesthetic
Ketamine	CP-Pharma	401650.00.00	Anesthetic
Mathieu needle holder	Fine Science Tools	12010-14	Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator)	UGO Basile S.R.L.	7025	Volume controlled respirator
Metal clip	Hemoclip	523735	Surgical consumables
Microscope	Leica	M651	Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters	ADInstruments	SPR-671	Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps	Fine Science Tools	11373-12	Surgical forceps
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15013-12	Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution	B/Braun	16332M01	Disinfection
PowerLab	ADInstruments	4_35	Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0	Ethicon	EH7830	Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″)	Austos	AE-BV010R	Surgical instruments
Serrated Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10	Surgical forceps
Silk Suture, 4-0	Ethicon	K871	Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored)	B/Braun	19412M07	Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel	Parker Laboratories	TB-250-0241H	Echocardiography consumables
Sponge points tissue	Sugi	REF 30601	Surgical consumables
Sprague-Dawley rat	Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France		Study animals
Tracheal cannula			Outer diameter 2 mm
Xylazin	CP-Pharma	401510.00.00	Anesthetic