זיהוי ולכידה בזמן אמת של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות מתרביות משותפות

Summary

אנו מתארים גישה לאיתור ולכידת תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים בזמן אמת. התכנון הניסויי משתמש באנליזה תאית בזמן אמת על ידי ניטור שינויים בעכבה החשמלית של תאים. סרטן פולשני, תאי חיסון, אנדותל או סטרומל ברקמות מורכבות יכולים להיתפס, וניתן להעריך את ההשפעה של תרביות משותפות.

Abstract

פלישה והתפשטות גרורתית של תאים סרטניים הם הגורם העיקרי למוות מסרטן. מבחנים שפותחו בשלב מוקדם כדי למדוד את הפוטנציאל הפולשני של אוכלוסיות תאים סרטניים מייצרים בדרך כלל מדידה של נקודת קצה אחת שאינה מבחינה בין תת-אוכלוסיות של תאים סרטניים עם פוטנציאל פולשני שונה. כמו כן, המיקרו-סביבה של הגידול מורכבת מתאים סטרומליים וחיסון שונים, המשנים את ההתנהגות הפולשנית של תאים סרטניים ומשתתפים בהם. פלישה לרקמות ממלאת גם תפקיד בתת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון הנלחמות במיקרואורגניזמים או בסילוק תאים חולים מתאי הפרנכימה והאנדותל במהלך שיפוץ רקמות ואנגיוגנזה. אנליזה תאית בזמן אמת (RTCA) המשתמשת בביו-סנסורים של עכבה כדי לנטר את פלישת התאים הייתה צעד גדול קדימה מעבר למדידת נקודת הקצה של הפלישה: זו מספקת מדידות רציפות לאורך זמן ובכך יכולה לחשוף הבדלים בשיעורי הפלישה שאבדו במבחן נקודות הקצה. באמצעות טכנולוגיית RTCA הנוכחית, הרחבנו מערכים דו-תאיים על ידי הוספת תא נוסף שיכול להכיל תאים סטרומליים ו/או חיסוניים ומאפשר למדוד את קצב הפלישה בהשפעת גורמים מופרשים מתאי סטרומל או מערכת החיסון בתרבית משותפת לאורך זמן. מעבר לכך, העיצוב הייחודי מאפשר ניתוק תאים בכל עת ובידוד של התא הסרטני הפולשני ביותר, או תת-אוכלוסיות תאים אחרות הנמצאות בתערובות הטרוגניות של מבודדי גידול שנבדקו. תאים סרטניים פולשניים אלה ותת-אוכלוסיות תאים אחרות מניעים התקדמות ממאירה למחלות גרורתיות, ומאפייניהן המולקולריים חשובים למחקרים מכניסטיים מעמיקים, לפיתוח בדיקות אבחון לגילוין ולהערכת פגיעויות. לפיכך, ניתן להשתמש בהכללה של תרופות בעלות מולקולות קטנות או גדולות כדי לבחון את הפוטנציאל של טיפולים המכוונים לסרטן ו/או לתת-אוכלוסיות של תאים סטרומליים במטרה לעכב (למשל, תאים סרטניים) או לשפר (למשל, תאי מערכת החיסון) התנהגות פולשנית.

Introduction

פלישת תאים היא תהליך חשוב המאפשר לתאים לחצות מחסומים של קרום מרתף בתגובה לרמזים סביבתיים המסופקים על ידי תאים סטרומליים. זהו שלב מכריע במהלך מספר שלבים של התפתחות לתגובות חיסוניות, ריפוי פצעים, תיקון רקמות וממאירויות שיכולות להתקדם מנגעים מקומיים לסרטן פולשני וגרורות¹. מבחנים שפותחו בשלב מוקדם כדי למדוד את הפוטנציאל הפולשני של אוכלוסיות תאים מייצרים בדרך כלל מדידה של נקודת קצה אחת או דורשים תיוג מראש של תאים פולשים². השילוב של מיקרו-אלקטרוניקה וטכניקות של מיקרופלואידיקה פותח כעת כדי לזהות היבטים שונים של הביולוגיה של התא, כגון כדאיות, תנועה והתקשרות באמצעות העכבה החשמלית של תאים חיים על מיקרו-אלקטרוניקה ^3,4. מדידת עכבה מאפשרת הערכה נטולת תוויות, לא פולשנית וכמותית של מצב התא³. כאן אנו מתארים מערך בעל שלושה תאים המבוסס על תכנון מערכת האנליזה התאית בזמן אמת (RTCA) שפותחה על ידי Abassi et ^al.5. המערך בעל שלושת התאים מאפשר הערכה של תאים בתרבית משותפת על פלישה תאית והתאוששות של תאים פולשים לצורך ניתוחים או התפשטות נוספים.

במערכת מנתחי התאים, תאים פולשים דרך מטריצה חוץ-תאית המצופה על ממברנה נקבובית ומגיעים למערך אלקטרודות משולב הממוקם בצד הנגדי של המחסום. כאשר התאים הפולשים ממשיכים להתחבר ולתפוס את מערך האלקטרודות הזה לאורך זמן, העכבה החשמלית משתנה במקביל. המערכת הנוכחית כוללת צלחת 16 בארות פלישה והגירה של תאים (CIM) עם שני תאים. מכשיר RTCA-DP (דו-תכליתי) (הנקרא מנתח תאים דו-תכליתי) מכיל חיישנים למדידת עכבה ותוכנה משולבת לניתוח ועיבוד נתוני העכבה. ערכי העכבה בנקודת ההתחלה תלויים בחוזק היוני של המדיה בבארות ומשתנים כאשר התאים נצמדים לאלקטרודות. שינויי העכבה תלויים במספר התאים, במורפולוגיה שלהם ובמידה שבה התאים מתחברים לאלקטרודות. מדידה של הבארות עם המדיה לפני הוספת התאים נחשבת לאות הרקע. הרקע מופחת ממדידות עכבה לאחר שהגיע לשיווי משקל כאשר תאים מתחברים ומתפשטים על האלקטרודות. פרמטר ללא יחידה של מצב התאים על אלקטרודה המכונה אינדקס תאים (CI) מחושב כדלקמן: CI = (עכבה לאחר שיווי משקל - עכבה בהיעדר תאים) / ערך עכבה^{נומינלית 6}. כאשר משווים את שיעורי ההעברה של קווי תאים שונים, ניתן להשתמש ב- Delta CI כדי להשוות את מצב התא ללא קשר להבדל בהיצמדות המיוצג במדידות הראשונות.

המערך התלת-תאי החדש שתוכנן מתבסס על העיצוב הקיים ומשתמש בתא העליון ממערכת מנתח התאים הדו-תכליתית המכילה את האלקטרודות. התאים האמצעיים והתחתונים שהשתנו מותאמים כדי להתאים את ההרכבה למנתח התאים הדו-תכליתי למדידת עכבה וניתוח באמצעות התוכנה המשולבת. שתי ההתפתחויות העיקריות שהתכנון החדש מספק על פני לוחית ה-CIM הדו-תאית הקיימת (הנקראת מעתה צלחת מנתחת תאים) הן: 1) היכולת להתאושש, ולאחר מכן לנתח תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים הנמצאים בתערובות תאים הטרוגניות, ו-ב) האפשרות להעריך את ההשפעה של גורמים מופרשים מתאים סטרומליים או חיסוניים בתרבית משותפת על פלישת תאים (איור 1).

טכנולוגיה זו יכולה להיות שימושית בחקר תת-האוכלוסיות של תאים בעלי יכולות פולשניות שונות. זה כולל (א) תאים סרטניים פולשים הפולשים לרקמות הסובבות או לדם ולכלי הלימפה או מתרבים באתרי זריעה גרורתיים באיברים מרוחקים, (ב) תאים ממערכת החיסון הפולשים לרקמות כדי להתמודד עם פתוגנים או תאים חולים, (ג) תאי אנדותל הפולשים לרקמות ויוצרים כלי דם חדשים במהלך ארגון מחדש של רקמות או ריפוי פצעים, כמו גם (ד) תאים סטרומליים מהמיקרו-סביבה של הגידול התומכים ופולשים יחד עם תאים סרטניים. הגישה מאפשרת הכללה של דיבורים צולבים סטרומליים שיכולים לווסת את תנועתיות התא ואת הפלישה. מחקרי ההיתכנות המוצגים כאן משתמשים במערך שונה זה המתמקד בפלישה לתאים סרטניים ובאינטראקציה עם הסטרומה כמערכת מודל, כולל פלישת אנדותל בתגובה לאותות דיפרנציאליים מתאי הסרטן. ניתן לבצע אקסטרפולציה של הגישה כדי לבודד תאים סרטניים וסוגי תאים אחרים כגון תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון, פיברובלסטים או תאי אנדותל. בדקנו קווי תאי סרטן שד פולשניים ולא פולשניים מבוססים כהוכחה עקרונית. השתמשנו גם בתאים מפלישה של קסנוגרפט (PDX) שמקורו בחולה בתגובה לתאי מערכת החיסון ממח העצם האנושי כדי להראות היתכנות לשימוש עתידי גם במסגרות אבחון קליניות. PDX הן רקמות גידול של מטופלים המושתלות במודל עכברים מדוכאי חיסון או הומניזציה כדי לאפשר לימוד של אפשרויות גדילה, התקדמות וטיפול בחולה המקורי ^7,8.

Protocol

המחקר נסקר ונחשב "פטור" על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ג'ורג'טאון (IRB # 2002-022). רקמות מח עצם שנקטפו זה עתה נאספו ממסנני איסוף מח עצם אנושיים בריאים שהושלכו וזוהו.

1. עיצוב תא חדש (איור 2)

1. פתח לוחית מנתח תאים דו-תאית חדשה. הניחו בצד את התא העליון עם אלקטרודות.
2. באמצעות מכונת כרסום, גילחו 2 מ"מ מהבארות התחתונות בצורת U של לוחית מנתח התאים.
3. חברו ממברנת פוליאתרסולפון (PES) בגודל 2 ס"מ על 7 ס"מ עם גודל נקבובית של 0.2 מיקרומטר לתחתית הבארות המגולחות באמצעות דבק שאוצר UV. אפשרו זמן אוצר של 30 דקות כדי לוודא שהדבק נרפא לחלוטין ואינרטי.
4. באמצעות מכונת כרסום, חותכים שני חריצים אורכיים (1.5 מ"מ x 5.6 מ"מ) לאורך הצדדים כדי להיצמד לרכסים של החדר השלישי החדש שיוצר.
5. באמצעות מכונת כרסום, צור תא פוליקרבונט שלישי המשכפל את הממדים הכוללים של לוח מנתח התאים; 72 מ"מ x 18 מ"מ (טבלת חומרים).
6. צור בארות בעומק 4.8 מ"מ ובקוטר של 4.75 מ"מ כדי לשכפל את העיצוב בן 16 הבארות של לוח מנתח התאים. זה מאפשר 90 μL של נפח לכל באר.
7. בצדדים, צור שני רכסים משולשים כך שהתא יינעל לתוך החריצים המקוריים שנוצרו בשלב 1.4. החלק האופקי של המשולש הוא 1.5 מ"מ, האנכי הוא 1.4 מ"מ, ואת hypotenuse הוא 2.052 מ"מ.
8. צור ידית בצד הקצר שקוטרה 50.8 מ"מ וגובהה 1.397 מ"מ כדי להתאים לחריץ הלוח המקורי (איור 2, אמצע).
9. השתמש במכונת כביסה מגומי בעובי 0.9 מ"מ עבור כל באר כדי לספק התאמה אטומה.

2. תרבית תאים (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-פיברובלסטים)

1. שטפו תרביות תאים דביקות (כ-70% מפגש) עם פי 1x מלוחים עם מאגר פוספט (PBS).
2. הוסף תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA כדי להרים את התאים.
3. נטרלו את תמיסת הטריפסין בעזרת מדיה של תרביות תאים המכילה סרום וספרו את התאים באמצעות אליקווט של תרחיף התא.
   הערה: ניתן למצוא את המדיה הספציפית של תרביות תאים בטבלה 1.

3. דיסוציאציה של קסנוגרפט שמקורה בחולה

1. קוצצים חתיכת גידול טרייה (1 ס"מ²) לעיסה עדינה באמצעות אזמל סטרילי.
2. מניחים בצינור חרוטי 50 מ"ל עם 20 מ"ל של מדיית DMEM F12 בתוספת 3 מ"ג/מ"ל טריפסין ו-2 מ"ג/מ"ל קולגן.
3. דגירה בשייקר תרמי (150 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
4. סובב את הצינור ב 500 x g במשך 5 דקות; להסיר את supernatant.
5. הוסף 20 μL של DMEM F12 + 2% FBS כדי לשטוף את התאים; סובב ב 300 x g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. יש לחזור על שטיפה פעמיים נוספות.
6. בצעו שימוש חוזר ב-1 מ"ל של מדיית PDX (טבלה 1) כדי לספור את התאים.

4. מיצוי תאי מח עצם

1. שטפו את מסנן איסוף מח העצם (BM) עם 25 מ"ל של 1x PBS.
   הערה: במחקר זה, PBS נוסף למסנן איסוף BM משומש מבית החולים כדי לאסוף את ה- BM הנותרים במסנן.
2. הוסיפו את ה-BM הסמוק באיטיות לצינור חרוטי של 50 מ"ל עם 25 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות, תוך הקפדה על הפרדה בין השכבות ככל האפשר.
3. סובב ב 800 x גרם במשך 20 דקות ב 18 °C (74 °F)
4. סיפון את השכבות העליונות לאחר צנטריפוגה (שומן/פלזמה) והעביר 5 מ"ל של השכבה הלבנה מעל לתווך גרדיאנט הצפיפות שיש לו את תאי ה-BM לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
   הערה: לחלופין, יש לטבול פיפטה של 5 מ"ל בשכבה העליונה עד שהיא נוגעת בשכבה האמצעית (BM) ולפטפט את השכבה האמצעית באיטיות רבה מבלי להזיז את הפיפטה.
5. מלאו את הצינור החרוטי 15 מ"ל ב-1x PBS (כ-10 מ"ל) וסובבו ב-300 x גרם למשך 15 דקות.
6. הסר את הסופרנטנט; הכדור הלבן הנותר הוא ה- BM.
7. אם תאי דם אדומים נצפים בכדור, הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת RBC lysis (טבלת חומרים) ותנו לה לשבת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). סובבו ב-300 x גרם למשך 5 דקות והסירו את ה-supernatant.
8. הוסף 10 מ"ל של 1x PBS כדי לשטוף את התאים, לסובב ב 300 x g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. חזרו על תזת RBC (שלב 4.7) עד שהכדור יהיה לבן.

5. זריעה והרכבה של תאים

1. הניחו את כל שלושת התאים הסטריליים במכסה המנוע של תרבית הרקמה.
2. אתר את הידית בצד הקצר של החדר התחתון. כוון את החדר התחתון כך שהידית תפנה אל הנסיין.
3. הוסף 30,000-50,000 תאים במדיה של 90 μL לכל באר של החדר התחתון. הימנעו מיצירת בועות. אלה הם התאים הסטרומליים שיספקו גורמים מופרשים אך לא יזוהו על ידי האלקטרודות של החדר העליון.
4. השתמשו ב-5% מדיה המועברת על ידי תוסף סרום בקר עוברי בשתי בארות של תאים תחתונים כבקרה חיובית לתנועתיות התאים. השתמשו ב-0% מדיה עם תוסף סרום כבקרה שלילית.
5. תן לתא התחתון עם התאים לשבת במשך 10-15 דקות במכסה המנוע כדי להתיישב.
   הערה: שלב זה מומלץ אם התאים דבקים או גדלים בהשעיה.
6. סובבו את התא התחתון ב-90° והניחו את החדר האמצעי למעלה כך שהידית בתא התחתון תחליק לתוך החריץ בתא האמצעי.
   הערה: הידית בתא התחתון והנקודה הכחולה בתא האמצעי נמצאים בקצוות מנוגדים של ההרכבה.
7. דחפו אנכית כלפי מטה עד שנשמע צליל לחיצה מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.
8. הוסיפו 160 μL של מדיה ללא סרום לכל הבארות של החדר האמצעי.
9. ודא שמניסקוס בצורת כיפה נראה לאחר מילוי בארות; אחרת, התאם את עוצמת הקול הסופית בהתבסס על כיול הפיפטה. הימנעו מיצירת בועות.
10. מקם את התא העליון עם אלקטרודות הפונות כלפי מטה אל החדר האמצעי תוך הקפדה ליישר את הנקודות הכחולות בתאים האמצעיים והעליון.
11. דחפו אנכית כלפי מטה עד שנשמע צליל לחיצה מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.
12. הוסיפו 25-50 μL של מדיה ללא סרום לתא העליון.
13. הרכיבו את ההרכבה על מנתח התאים הדו-תכליתי באינקובטור תרביות הרקמה והמתינו 30 דקות לפני מדידת הרקע.
    הערה: זמן זה נחוץ כדי לאזן את המערך וניתן להשתמש בו כדי להכין את קווי התאים שיתווספו לתא העליון.
14. מדוד את הרקע (ראה סעיף 6) והחזיר את ההרכבה למכסה המנוע של תרבית הרקמה.
15. הוסף 30,000-50,000 תאים ב-100 μL של מדיה ללא סרום לכל באר של החדר העליון. אלה הם התאים שהאלקטרודה תזהה ברגע שהם יעברו בהצלחה דרך הממברנה.
    הערה: כדי להשיג תגובה מקסימלית, מומלץ לגדל תאים במדיה נטולת סרום או נמוכה בסרום למשך 6-18 שעות לפני ביצוע הבדיקה.
16. תנו להרכבה לעמוד במכסה המנוע במשך 30 דקות לפני שתרכיבו על מנתח התאים הדו-תכליתי למדידת עכבה.

6. מדידת רקע ועכבה

1. מקם את המערך לתוך העריסה במכשיר מנתח התאים הדו-תכליתי.
2. פתח את תוכנת מנתח התאים ובחר את העריסה לשימוש.
3. לחץ על הכרטיסיה הודעה וודא שכתוב בה חיבורים בסדר כדי לוודא שהמערך ממוקם היטב בעריסה והאלקטרודות מיושרות היטב עם החיישנים.
4. לחץ על הכרטיסיה הערות ניסוי ומלא מידע רב ככל האפשר על הניסוי.
5. לחץ על הכרטיסיה פריסה ומלא את התיאור של פריסת המערך.
6. לחץ על הכרטיסיה תזמון והוסף שני שלבים מתפריט השלבים ; שלב רקע (טאטוא אחד) ושלב בדיקה עם 100 מטאטאים - מטאטא כל 15 דקות, בסך הכל 25 שעות.
7. לאחר שהמערך נמצא באינקובטור מנתח התאים הדו-תכליתי במשך 30 דקות, לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל במדידת הרקע. חלון המבקש לבחור את התיקיה לשמירת הנתונים יופיע.
8. לאחר סיום מדידת הרקע, הסר את המערך מהעריסה והנח אותו בחזרה במכסה המנוע של תרבית התאים.
9. הוסיפו תאים לתא העליון כמתואר בשלב 5.13, ושמרו על ההרכבה במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך 30 דקות כדי שהתאים יתיישבו.
10. מקם את המערך בחזרה למנתח התאים הדו-תכליתי ובדוק את הכרטיסיה הודעה עבור ההודעה 'חיבורים אישור '.
11. לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל במדידת עכבה.
12. לחץ על הכרטיסיה תרשים כדי לעקוב אחר התקדמות האות.
13. אם נקודת הקצה מגיעה לפני 25 שעות, לחץ על השלב ביטול מהתפריט הנפתח הפעל .
14. כדי לייצא נתונים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגרף, בחר העתק בתבנית הרשימה ולאחר מכן הדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני.
    הערה: ניתן לייצא את הנתונים כאינדקס תאים או אינדקס תאי דלתא. ניתן גם לבחור פרטי גרף ו/או פריסה לייצוא.

7. ניתוק ואיסוף תאים

1. עקוב אחר קצב ההעברה בזמן אמת על מנתח התאים הדו-תכליתי כדי לקבוע את נקודת העצירה של העניין (6-18 שעות).
   הערה: נקודת העצירה תלויה בקצב הפלישה של התא וכאשר מושג אות פלישה מובחן מהשליטה השלילית.
2. לאחר שהושגה, שחררו את ההרכבה ממנתח התאים הדו-תכליתי והניחו אותו במכסה המנוע של תרבית הרקמה.
3. הכן מספר מתאים של 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge כדי לאסוף את התאים מבארות העניין.
4. מניחים את ההרכבה בצלחת של 10 ס"מ כדי להכיל נוזלים כאשר התאים מתנתקים.
5. דחפו את קצוות ההצמדה הגמישים בצד הארוך של החדר האמצעי פנימה עד שנשמע צליל לחיצה.
6. פרקו את החדר העליון והפכו אותו למנה חדשה של 10 ס"מ.
7. השתמשו במרים תא עם להב של 13 מ"מ כדי לאסוף את התאים מכל הבארות הנושאות את אותו מצב ניסיוני (כלומר, סוג תא, טיפול תרופתי וכו').
   הערה: תכנן את ההגדרה כך שיהיו לפחות שתי בארות עבור כל מצב ניסיוני כדי להשיג שינוי מובהק סטטיסטית מפקדים שליליים.
8. יש לשטוף או לטבול את הלהב בתמיסת מלח 1x 1x דחוסה בפוספט כדי לאסוף את התאים בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
9. סובבו את התאים ב-500 x גרם למשך 5 דקות.
10. להפיץ את התאים שנאספו (ראה סעיף 8) או לבצע ניתוח נקודות קצה כגון RNA-seq חד-תאי.
    הערה: עבור RNA-seq בתפזורת, השתמש בערכת מיצוי RNA של מספר תאים נמוך.

8.3D ריבוי ואחזור תאים

הערה: בשל המספר הקטן של תאים שנאספו, זרעו את התאים בתלת-ממד באמצעות מטריצה חוץ-תאית (ECM) כדי לשפר את הכדאיות. עם זאת, תרבית דו-ממדית היא גם אופציה בשלב זה, במיוחד אם התאים שבהם נעשה שימוש הם מקווי תאים מבוססים.

1. להפשיר אליקוט של מטריצת קרום המרתף ב 4 מעלות צלזיוס בלילה. שמור את מטריצת קרום המרתף על קרח עד שיהיה מוכן לשימוש.
2. מוסיפים 25 μL של מטריצת קרום מרתף קר לכדור של תאים חיים שנאספו ומקטרים בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב. הימנעו מיצירת בועות.
3. הוסיפו את תערובת המטריצה של קרום מרתף התאים לתחתית של באר תרבית רקמה קטנה (כלומר, בצלחת של 96 בארות), ויצרו כיפה. נסו לא לגעת בקירות הבאר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני שתוסיפו בעדינות 100 μL של מדיה טיפה.
4. כדי לאחזר תאים, שאפו למדיה והוסיפו 100 μL של dispase לכל באר.
5. דגירה ב- RT במשך 10 דקות, מקטרת למעלה ולמטה מדי פעם.
6. העבירו את התאים ואת מטריצת קרום המרתף המומסת לצינור מיקרו-צנטריפוג' של 1.5 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של 1x PBS, סובב ב 300 x g במשך 5 דקות והסר את supernatant. חזור על הכביסה פעם אחת.
7. לשאוף את הסופרנאטנט. לפצל את התאים בכדור או לבצע ניתוח נקודות קצה.

תוצאות

באמצעות מערך שלושת התאים שתוכנן לאחרונה, פלישה של התאים נבדקה בנוכחות או בהיעדר תאים סטרומליים כגון פיברובלסטים. פלישת תאי MDA-MB-231 שופרה כאשר פיברובלסטים שוויצריים מוקרנים 3T3 (זן J2) נזרעו בתא התחתון, מה שאפשר חילופי גורמים בין שני קווי התאים. באופן מעניין, הפלישה ל-MDA-MB-231 גדלה כאשר מספרם של תא...

Discussion

שינינו את העיצוב של מערך דו-תאי כך שיכלול תא שלישי לניטור פלישת תאים בזמן אמת בנוכחות תאים סטרומליים. ראינו השפעות ברורות של פיברובלסטים בתרבית משותפת על תאים סרטניים פולשניים ולא פולשניים, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש במערך כדי להבחין בין תת-אוכלוסיות של תאים סרטניים המגיבים באופן שונה ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25300-054
Adhesive	Norland Optical Adhesive	NOA63
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9418
Cell lifter	Sarstedt	83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Thermofisher	12585-014
CIM-plate	Agilent	5665817001	Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	Thermofisher	11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
HEPES	Thermofisher	15630106
Horse serum (HS)	Gibco	16050-122
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)	Thermofisher	51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution	Sigma	C8052
J2 Fibroblasts	Stemcell (RRID:CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel	Corning	354230	Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells	RRID:CVCL_0062
Milling machine			Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x)	Thermofisher	10010049
Polyethersulfone (PES) membrane	Sterlitech	PCTF029030
RBC lysis solution	Stemcell	7800
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
RTCA DP analyzer	Agilent	3X16	Dual purpose cell analyzer
Trypsin	Sigma	T4799