JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כלים חדשים למבחני קשירת SPR כדי לבחון קשירת CV-N ל-HA, גליקופרוטאין S, גליקנים היברידיים קשורים ואוליגוסכרידים עתירי מנוז. SPR משמש לקביעתK D לקשירת CV-N דימרי או מונומרי לגליקנים אלה.

Abstract

תהודת פלסמון פני השטח (SPR) משמשת למדידת קשירת המגלוטינין (HA) לדמיר ציאנובירין-N (CV-N) שהוחלף בתחום ולניטור אינטראקציות בין פפטידים מנוזילטים לבין אתר הקשירה בעל הזיקה הגבוהה של CV-N. דווח כי קוצים במעטפת הנגיף gp120, ha וגליקופרוטאין אבולה (GP) 1,2 קושרים אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה ונמוכה ב-CVN2 דימרי. פפטיד HA דימנוזילי קשור גם בשני אתרי הקישור בעלי הזיקה הנמוכה למולקולה מהונדסת של CVN2, הנושאת אתר זיקה גבוהה עבור הליגנד המתאים ועוברת מוטציה כדי להחליף קשר דיסולפיד מייצב בכיס קשירת הפחמימות, ובכך לאשר קשירה רב-ערכית. קשירת HA מוצגת לאתר קשירה אחד בעל זיקה גבוהה של פסאודו-נוגדנים CVN2 בקבוע דיסוציאציה (KD) של 275 ננומטר המנטרל עוד יותר את נגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) באמצעות אוליגומריזציה. קורלציה בין מספר הגשרים הדיסולפידים ב-CVN2 שהוחלפו בתחום, אשר מופחתים מ-4 ל-2 על-ידי החלפת ציסטינים בזוגות שאריות קוטביות של חומצה גלוטמית וארגינין, מביאה לירידה בזיקה ל-HA. בין האינטראקציות החזקות ביותר, אבולה GP1,2 קשורה על ידי CVN2 עם שני אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה בתחום הננומולרי התחתון באמצעות גליקן המעטפת ללא תחום טרנסממברנה. במחקר הנוכחי, קשירת CV-N מונומרי רב-ספציפי לתסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) גליקופרוטאין (S) נמדדת ב- K D = 18.6 μM בהשוואה לננומולאר KD לאותם קוצים אחרים בנגיף, ובאמצעות תחום קשירת הקולטן שלו בטווח הטוחנות האמצעיות μ.

Introduction

פעילות אנטי-ויראלית הקשורה לטתרין מושרית על ידי אינטרפרון-α, והיא מורכבת מקשירה מבוססת חלבון, מה שמוביל לשמירה של וירוסים שנוצרו במלואם על משטחי תאים נגועים1. הצורך בגליקוזילציה של טטרין בעיכוב שחרור הנגיף עדיין אינו ודאי, מה שמרמז על החשיבות של דפוסי גליקוזילציה על גליקנים המבוטאים באופן רקומביננטי עבור מחקרים במבחנה 1,2, אשר תלוי בקונפורמציה של (במקרה של נגיף שפעת) השפעת המגלוטינין HA 3,4 . צוין כי שינוי של אוליגוסכריד הקשור לגליקוזילציה הקשורה ל-N מספיק להגבלה בתיווך תרין של שחרור HIV מסוג 12, בעוד שדמריזציה ממלאת תפקיד חיוני במניעת שחרור הנגיף, ובכך מערבת את תחום הטרנס-ממברנה או גליקוזיל-פוספטידיל-אינוזיטול (GPI)-עוגן לקשירת הוויריונים הניצנים5 . תכונות ייחודיות מתוארות עבור טתרין אנושי ומורין כדי לחסום וירוסים עטופים מרובים, רטרו-וירוסים, ופילו-וירוסים. BST-2/tetherin הוא חלבון אנטי-ויראלי הניתן לאינטרפרון של מערכת החיסון המולדת1,6, הפועל עם פעילות אנטי-ויראלית רחבת טווח ונוגד אנטגוניזם על ידי גליקופרוטאינים מעטפת5 כדי לבצע טרנסלוקציה של טטרין או לשבש את המבנה של ת'רין 6. לדוגמה, גליקופרוטאין HA של מעטפת המבוטא על פני השטח ונוירמינידאז על נגיף שפעת A ידועים באנטגוניזם של טטרין באופן ספציפי לזן7, מה שמקל על זיהוי אתרי קשירת קולטן מארח8. נוגדנים המכוונים לגליקן נחקרים בסטויכיומטריה של יחסי הגומלין שלהם עם מגני הגליקן המותאמים אישית במהירות ב-HA, וכתוצאה מכך נוצרת זיקה לתת-סוגים שפעת A H3N2 ו-H1N14.

כדי להבהיר את מנגנוני הקשירה בין חומרים אנטי-ויראליים לבין קוצים במעטפת הנגיף, כלומר ליגנדות פחמימות, ושיטות אימונולוגיות וספקטרוסקופיות משלימות, מסונתזים כימית מונו, די-די-מנוז ותלת-מנוז. הפפטידים המנוזילים נוצרים באמצעות אזידו גליקוזילציה של גליקוזיל {בטא}-פראצטטים לטרנספורמציה של 1,2-טרנס גליקוזיל אזידים9, המחקה את ה-N-אצטיל גלוקוזאמין ואוליגוסכרידים עתירי מנוז על פני השטח של וירוסים מסכני חיים. ביואיזוסטרים של טריאזול משמשים לחיקויים של קישורים היוצרים את השאריות המנוזיליות של פפטיד HA10 ומאפשרים אינטראקציות ספציפיות לאתר עם נגזרות CV-N אנטי-ויראליות סביב נקודת הגליקוזילציה השנייה הקשורה ל-N בתחום ראש ה-HA (HA למעלה עם 4 גליקנים מקושרים N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . אינטראקציות בין חומצה גלוטמית (Glu) וארגינין (Arg) לבין דיפול הסליל שנוצר ביטאו יציבות טובה של פפטידי המודל ושל חלבונים, אך הן מוצגות באמצעות SPR. אם משווים אותו לזיהוי אתר גליקוזילציה מסונתז כימית יחיד ב-HA10 על ידי עיכוב ישיר של קשירת קולטן על הגליקן, הוכחה זיקה גבוהה יותר של מבנה Fc בעל מוטציה של ארבעה אתרים לקולטן שלו כמעוררת פונקציות אפקטים in vivo, וחושפת את ההרכב הלא קשור של גליקנים מקושרים N המחוברים למוטציה של Fc כדי לקבוע באופן מכניסטי13.

CV-N מציג פעילות אנטי-ויראלית נגד HIV 14,15, שפעת16 ונגיף האבולה, המתווך על ידי קשירת ננומולר לשינויים אוליגוסכרידיים עתירי מנוז על חלבוני ספייק מעטפת12,17,18,19. קשירת שפעת HA לאתר קשירת פחמימות אחד בעל זיקה גבוהה (H) ב-CV-N או בשני Hs ב-CVN2 דימרי מקושר קוולנטית נקבעת כבעלת קבועי דיסוציאציה של שיווי משקל (K D) = 5.7 ננומטר (איור 1A) ו-KD = 2.7 ננומטר, בהתאמה. גם CV-N וגם CVN2 מכילים עוד אתר אחד או שניים של קשירת פחמימות בעלות זיקה נמוכה (L)s 12,17,20,21. אבולה GP1,2 נקשר ל-2H של CVN2 עם זיקות בתחום הננומולרי התחתון (KD = 26 ננומטר). CV-N WT מחייב לאבולה GP1,2 ו- HA מציג זיקות מ- K D = 34 nM ל- KD = 5.7 nM (A / New York / 55/04)12. לקטינים, כגון CV-N, המכוונים באופן ספציפי לגליקנים עתירי מנוז על מעטפות הנגיף, מעכבים עוד יותר את השכפול של נגיף הפטיטיס C, SARS-CoV, נגיף ההרפס, נגיף מרבורג ונגיף החצבת22.

מולקולת CV-N הקטנה נחקרה ביסודיות במשך יותר מ-20 שנה, שכן היא מתפקדת כדי לקשור מגוון רחב של נגיפים כדי לעכב את כניסת הנגיף16,18. ניתוחים מבניים ומבחני זיקה מקשרים מצביעים על קישור צולב של שני Ls בדימר CVN2 שהוחלף על ידי קשירה דו-ערכית בטווח המיקרומולרי כדי להגביר את ההתלהבות לגליקופרוטאינים של מעטפת נגיפית10,19. קשירה סלקטיבית של Manα1-2Manα על זרועות Man(8) D1D3 ו-Man(9) כוללת שני אתרי קשירה בעלי זיקות שונות הממוקמים על פרוטומרים של חלבונים מנוגדים20, ובכך מגיעים לזיקות קשירה ננומולריות (איור 1B). לפיכך, CVN2 נחשב לנוגדן פסאודו בנוגע ליישומו לקשירת אפיטופים על HIV gp120, בדומה לנוגדנים מנטרלי וירוסים17. כאן, המחבר מעוניין לחקור את הקשירה הפוטנציאלית של CVN2 לספייק SARS-CoV-2 באמצעות תחום קשירת הקולטן שלו (RBD). עקומות קשירה של אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי משותק (ACE)-2 עם SARS-CoV-2 RBD התוצאה KD = 4.7 nM עבור אינטראקציה מחייבת רלוונטית ביולוגית זו23.

לעומת זאת, מחלקות אימונוגלובולינים נבחרות מזהות תבניות חלבונים מבניות ספציפיות ועקביות, המקנים מצע להבשלת זיקה באזורי HA24 המעוגנים בממברנה. CV-N מראה פעילות חזקה מאוד כמעט בכל נגיפי שפעת A ו-B16, והוא חומר אנטי-ויראלי המנטרל באופן נרחב. הידע שלנו אינו שלם על מיקומם של אפיטופים ממוקדים על הגבעול של HA1 ו-HA2 שעשויים לערב מבנים אפיטופיים למיקוד גליקן על ידי נוגדנים מנטרלים מאוד ובהשוואה לקשירת לקטין25.

figure-introduction-6121
איור 1: ייצוג סכמטי של בדיקת קשירת SPR עבור CV-N לקפיצות מעטפת הנגיף. (A) בדיקת SPR לקשירת CV-N לליגנד: חלבון HA באורך מלא (90 kDa). ערכת נתונים קינטית (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) המציגה כריכה כפולה בזמן אמת לשפעת HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 גרסה V2 נקשרת לליגנד DM משותק בטווח ריכוז של 500 ננומטר עד 16 מיקרומטר. רצף: שאריות L מודגשות בצהוב. שאריות H מודגשות באפור. E58 ו-R73 הם תחליף לציסטאינים בחלבון ה-wildtype והופכים את V2 לקפל חלבון יציב עם שלושה במקום ארבעה קשרים דיסולפידיים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בעוד שמגן הגליקן בחלק העליון של HA הדיסטלי של הממברנה גורם לקשירת זיקה גבוהה ל-CV-N 12, קשירת CVN2 ל-HA הסמוכה לגשר דיסולפיד של החלק העליון של HA נצפתה גם באתרי הזיקה הנמוכה שלו10,12. אינטראקציות קוטביות שונות ואתרי אינטראקציה מזוהים בקשירת פחמימות על ידי CV-N. אינטראקציות אלה מאומתות על ידי יצירת וריאנטים נוק-אאוט באתר הקשירה כדי לתאם זיקות קשירה לגליקוזילציה חזויה בסיליקו 12. לפיכך, הפרויקט שואף להשוות פפטידי HA שעברו מנוזילציה כימית שנבדקו בעבר בזיקה ובספציפיות מחייבת עם רצפי פפטידים קצרים מקוצים הקשורים לסארס 2019-nCoV ו- SARS-CoV-2, המתרחשים באופן טבעי על ידי מספר קטן של אתרי גליקוזילציה שונים המקושרים ל- N וגליקוזילציה מקושרת O. באמצעות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים ומבחני קשירה, פינטו ועמיתיו מדווחים על נוגדן חד-שבטי, S309, שעשוי לזהות אפיטופ על חלבון ספייק SARS-CoV-2 המכיל גליקן שמור בתוך תת-הסוג Sarbecovirus, מבלי להתחרות בחיבור הקולטן26. הפרוטוקול של מחקר זה מתאר כיצד תכנון, הבעה ואפיון של וריאנטים של CV-N חשובים כדי לחקור כיצד CV-N ו-CVN2 נקשרים לחלבונים מסוכררים ולפפטידים מאנוסילטים סינתטיים באמצעות טכנולוגיית SPR10,12.

דימר CVN2L027 וגרסאות של אתר קשירה (V2-V5) מבוטאים באופן רקומביננטי וריאנטים הם עם תחליפי קשרים דיסולפידיים (C58E ו-C73R) (איור 2A). כמו כן, מוטציה עם מוטציה חד-נקודתית E41A מוכנה מכיוון שתנוחה זו נתפסה כשאריות של מגע צולב בין-מולקולרי. מוטציה זו היא מולקולה מעניינת נוספת למדידות קשירת SPR בין הלקטין לאוליגוסכרידים בעלי מנוז גבוה המפענחת תחומי קשירה ומאפשרת השוואה לצורה הדימרית. המבנה הגבישי המוחלף בתחום של CVN2 מראה מקשר גמיש, המשתרע בין 49 ל-54 שאריות. שני התחומים יכולים להמשיך לנוע סביב הציר כגופים קשיחים, ולפתח מונומר באמצעות אינטראקציות תחום תוך-מולקולריות (תחום A -שאריות 1-39;90-101- עם תחום B -שאריות 40-89) או דימר על ידי החלפת תחום בין-מולקולרי [תחום A (של המונומר הראשון) עם תחום B (של השני), ותחום B (של המונומר הראשון) עם תחום A (של העותק השני)]. אין אינטראקציות קרובות בין תחומי A ו-B של שני הפרוטומרים, למעט Glu4128. ניתן לפתח את הגן עבור CV-N בשיטת PCR חוזרת עם אוליגוס מסונתז 40-mer29 ולאחר מכן הוא משויך לאתרים NdeI ו- BamHI של pET11a לטרנספורמציה (אלקטרופורציה) לתאים אלקטרו-מוכשרים כפי שתואר על ידי Keeffe, J.R.27. החלבון, המשמש להשגת המבנה הגבישי המתאים (PDB ID 3S3Y), כולל תג טיהור N-terminal 6-histidine ואחריו אתר ביקוע פרוטאז פקטור Xa. מוטגנזה מכוונת אתר משמשת ליצירת מוטציות נקודתיות, להחלפת קודונים ולהוספה או מחיקה של בסיסים או קודונים בודדים או מרובים להחלפת חומצות אמינו. טרנספורמציות אלה מספקות תובנה שלא תסולא בפז לגבי תפקוד ומבנה החלבון. CV-N, CVN2 ו-CVN3 עם ביטוי רקומביננטי וטיהור רקומביננטי נחקרו היטב מבחינה ביופיזית20,21,27, הם זולים לייצור, ולכן משמשים לאפיון מבחני קשירה לגליקנים המשותקים על שבבי חיישן SPR. בדיקה חיסונית קונבנציונלית הקשורה לאנזים (ELISA) מספקת פחות יכולת שכפול בנוגע לטכניקת האימוביליזציה של ליגנדות גליקן והופכת קשירה בזמן אמת של גרסאות שונות של אתרי קשירה, המוצגת עבור SPR, למבחני נקודות קצה.

וריאנט זיקה מחייבת CVN2L0-V2 (קפל שלם של CV-N הומודימרי עם החלפת גשר דיסולפידית10) מבוטא בתג שלו ב-Escherichia coli (E. coli), מטוהר מעל עמודת Ni-NTA תוך שימוש בכרומטוגרפיית זיקה ונבדק לקשירת HA (H3N2), פפטיד HA-פפטיד מונומנוזילי ופפטיד דימנוזילי באמצעות SPR. פפטידים מנוזיליים כימית, או חלבון HA ו-S, כולם ליגנדים ואמינים המוצמד למשטח השבב ההידרופילי באמצעות אסטרים תגובתיים או הנדסת חלבונים ביוטין-סטרפטאווידין. אותו הליך של ריצות עוקבות מוחל על ליגנדות אלה, המזריקות דילולים שונים של CV-N וריאנטים של CV-N (ו- CVN2) כדי לקבל מידע קינטי עבור ניתוחי האינטראקציה המולקולרית כמתואר להלן30. שבב חיישן SPR משותק RBD משמש לקשירת מחקרים על פפטידי CV-N ל-S, והזיקות מושוות לקשירת SARS-CoV-2 עם ACE2 האנושי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

עבור המחקר הנוכחי, חלבון היתוך דמוי יוביקוויטין קטן (SUMO) של CVN שימש בבדיקות אימונוסורבנט הקשורות לאנזימים במקום CV-N והוא מתאים לבדיקות מבוססות תאים. שפעת רקומביננטית באורך מלא חלבון HA H3 מתקבל באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) או מבוטא בקווי תאים HEK293 של יונקים ובתאי חרקים נגועים ב-baculovirus על פי פרוטוקולים סטנדרטיים12. חלבון הספייק של ווהאן-1 מתבטא בתאי HEK293 של יונקים. הסינתזה של פפטיד מונומנוזילי (MM) ופפטיד דימנוזילי (DM) מאפשרת זיהוי של ליגנדות הומוגניות ל-CVN2 ולמולקולה קטנה מונומנוזילית10.

1. יצירת מבני CV-N

  1. עבור כל אחת מגרסאות CVN2 וחלבון CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), קבל את מבנה הגן עם רצף מוביל pelB מסוף N ואת התג שלו בווקטור pET27b(+) ממקורות מסחריים (ראה טבלת חומרים, קובץ משלים 1).
  2. השג CVN2L0 וגרסאותיו (V2, V3, V4 ו- V5; איור 2A,C) ברקע של גן בתבנית CVN2L0 המורכב משני רצפי דנ"א נפרדים עבור כל CV-N חוזר.
  3. ממיסים את הדנ"א הפלסמיד הליופילי במים מזוקקים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (ddH2O) לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מיקרול.

2. הכנת צלחות LB-agar עם תאים מותמרים של DNA פלסמיד

  1. הכינו את מדיום התרבית LB-Lennox על ידי המסת 10 גרם/ליטר של פפטון, 5 גרם/ליטר של תמצית שמרים ו-5 גרם/ליטר של NaCl ב-ddH2O (ראו טבלת חומרים), והתאימו את ה-pH ל-7.4. בצע את הטרנספורמציה ל- E. coli BL21 (DE3) מוכשר עבור כל גרסה (V2-V5) בשיטה כימית בעקבות דוח10 שפורסם בעבר.
  2. לפצל את התמיסה (900 μL ו- 100 μL), להעביר 100 μL על לוחות LB-agar (50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin), ולהשתמש בעדינות מפזר תאים סטריליים. לדגום את צלחות אגר לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

3. שיבוט

  1. החלף את הגן עבור CV-N לאתרי NdeI ו- BamHI של pET11a (ראה טבלת חומרים) לצורך טרנספורמציה (אלקטרופורציה) לתאים אלקטרו-מוכשרים לאחר הפניה27.

4. מוטגנזה מכוונת אתר

  1. כדי ליצור CVN2L029 ומוטציה CVN-E41A ברקע של גן תבנית CVN2L0 המכיל שני רצפי DNA מובחנים עבור כל CV-N חוזר27.
  2. צור מוטציות באמצעות ערכת מוטגנזה מכוונת אתר (ראה טבלת חומרים) ופריימרים מוטגניים ספציפיים 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' ו-5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' להפעלת PCR31.
    1. התחל סדרה של תגובות דגימה באמצעות ריכוזים מרובים של תבנית דנ"א דו-גדילי (dsDNA) הנעה בין 5-50 ng (לדוגמה, 5, 10, 20 ו-50 ng של תבנית dsDNA). שמור על ריכוז פריימר קבוע.
      הערה: תערובת ה-PCR ופרוטוקול המחזור התרמי משמשים בדרך כלל כמתואר במדריך ההוראות של ערכת המוטגנזההמכוונת לאתר 32.
  3. הוסף את אנזים ההגבלה Dpn I (1 μL, 10 U/μL, ראה טבלת חומרים) מתחת לשכבת העל של השמן המינרלי. ערבבו תגובות ביסודיות ובעדינות, סובבו כלפי מטה במיקרוצנטריפוגה שולחנית למשך דקה אחת, ודגרו מיד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לעיכול ה-dsDNA המוגף-על ההורי.

5. טרנספורמציה של תאי חיידקים

  1. הפשירו בעדינות את התאים הסופר-מוכשרים של XL1-Blue (ראו טבלת חומרים) על קרח. כדי להפוך כל תגובת בקרה ודגימה, aliquot את התאים supercompetent (50 μL) לצינור פוליפרופילן תחתון עגול מראש (14 מ"ל).
    1. העבר 1 μL של הדנ"א החד-גדילי שטופל ב- Dpn I (ssDNA) מכל תגובת בקרה ודגימה (ssDNA שעבר מוטציה) כדי להפריד בין אליקוטים של התאים העל-טבעיים, אשר מסנתזים את הגדיל המשלים. סובבו בזהירות את תגובות הטרנספורמציה כדי לערבב ולדגור את התגובות על הקרח במשך 30 דקות.
      הערה: לפני העברת הדנ"א המטופל ב-Dpn I לתגובת הטרנספורמציה, מומלץ להסיר את כל השמן המינרלי שנותר בזהירות מקצה הפיפטה. כבקרה אופציונלית, יש לבדוק את יעילות הטרנספורמציה של התאים הסופר-מוכשרים XL1-Blue על ידי ערבוב 0.1 ng/μL של פלסמיד הבקרה pUC18 (1 μL) עם aliquot של 50 μL של התאים העל-מוכשרים.
  2. יש למרוח את פעימת החום על תגובות הטרנספורמציה בטמפרטורה של 42°C למשך 45 שניות, ולאחר מכן להניח את התגובות על הקרח למשך 2 דקות.
    הערה: פולס החום המיושם כבר עבר אופטימיזציה לתנאים שהוזכרו בצינורות פוליפרופילן עם תחתית עגולה (14 מ"ל).
  3. הוסיפו 0.5 מ"ל של ציר NZY+ (המכיל לליטר: 10 גרם של אמין NZ (קזאין הידרוליזט), 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של NaCl, 12.5 מ"ל של 1 M MgCl 2, 12.5 מ"ל של 1 M MgSO4, 10 מ"ל של2 M גלוקוז, pH 7.5, וחומם מראש ל-42 °C) ודגרו את תגובות הטרנספורמציה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-225-250 סל"ד למשך שעה אחת. צלחת את הנפח הנכון של כל תגובת טרנספורמציה (5 μL מטרנספורמציית פלסמיד בקרה; 250 μL מטרנספורמציית דגימה) על לוחות אגר LB-אמפיצילין.
    הערה: עבור בקרות הטרנספורמציה והמוטגנזה, יש לפזר תאים על לוחות אגר LB-אמפיצילין בעלי 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטופירנוזיד (X-gal, 80 מיקרוגרם/מ"ל) ואיזופרופיל-1-תיו-β-D-גלקטופירנוזיד (IPTG, 20 mM) (ראו טבלת חומרים). לחסן 50 מ"ל של תרביות התאים עם מושבה אחת של E מותמר. תאי קולי לטיהור דנ"א פלסמיד שעבר מוטציה לצורך ניתוחים. מוטגנזה מאושרת על ידי ריצוף DNA במתקן חיצוני.

6. ביטוי וטיהור חלבונים

  1. עבור תרבית בקנה מידה גדול, לחסן כמות קטנה של LB (המכיל אמפיצילין) עם מושבה אחת מן הלוח מותמר.
  2. באמצעות תרבית הלילה, לחסן את תרבות הביטוי עם תוספים, כגון 10 mM של MgCl2, 10 mM של MgSO 4, ו 20 mM של גלוקוז, דילול תרבות הזרעים ל 1/100.
    1. לגדל תאים עם רעידות נמרצות ב 37 מעלות צלזיוס. לגדל תאים ל-Abs 600 ננומטר בין 0.4-0.6 (שלב אמצע הלוג) לפני קירור התאים ל-20 מעלות צלזיוס. השרה עם 1 mM IPTG ולגדול בן לילה.
    2. לאחר מכן, קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהשליך את supernatant עם פיפטה.
  3. יש להשעות את כדור התא במאגר מי מלח עם אגירת פוספטים (PBS) ולבצע צנטריפוגה מחדש ב-4,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להשליך את supernatant עם פיפטה. יש להשעות את הגלולה הנותרת ב-10 מ"ל של חיץ ליזה ולדגירה של המתלים למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: הרכב של מאגר ליזה: (50 mM של NaH 2 PO4, 300 mM של NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/mL של ליזוזים, 1 mM של פנילמתיל-סולפונילפלואוריד (PMSF), 1 mM של dithiothreitol, 1 mM של MgCl2, pH 8, ראה טבלת חומרים).
    1. מעבירים את התערובת לשני מחזורי הפשרה בהקפאה (-80°C). הפרד שברים מסיסים ובלתי מסיסים על-ידי צנטריפוגה ב-4,000 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ונתח אותם באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE), בפרט, נתרן דודציל סולפט (SDS)-PAGE33 (איור 2B,C).
      הערה: תאים יכולים להיות lysed במספר דרכים, כגון הפשרה הקפאה, סוניקציה, הומוגניזציה, תזה אנזימטית, או שילוב של שיטות אלה. טיהור מגופי הכללה מומלץ לאיסוף תפוקות חלבון גבוהות26.
  4. טהרו חלבונים באמצעות כרומטוגרפיית עמודה Ni-NTA (ראו טבלת חומרים). טען את החלק המסיס על עמודת חרוזים Ni-NTA מתחדשת (1 מ"ל/דקה). שטפו את המערכת עם חיץ TBS (50 מ"מ של טריס, 150 מ"מ של נתרן כלורי, pH 7.5) לפני תחילת שיפוע (0-100% 500 mM imidazole ב- TBS מעל 60 דקות) ואיסוף שברים (1 מ"ל לדקה). דיאליזה של החלבונים המטוהרים לאפיון ביוכימי כנגד PBS של 100 mM (איור 2C,D).
  5. לחלופין, השתמש בג'ל זיקה His-Select Ni 2+ (ראה טבלת חומרים) בצינורות של 14 מ"ל כדי לקשור ולהשעות מחדש את CV-N המתויג שלו באופן רקומביננטי בתמיסות חיץ עם 20 mM imidazole ו-250 mM imidazole, בהתאמה. דגירה באצווה במשך 30 דקות לפחות.
    הערה: החל חלבונים מטוהרים למחצה אלה על עמודה חד-פעמית ארוזה מראש להחלפת חיץ וניקוי של דגימות ביולוגיות, לדוגמה, פחמימות וחלבונים, שיכולים לטעון 1-1.5 מ"ל מ-eluate מכרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת.
  6. העבירו את תמיסות החלבון לצינורות צנטריפוגה באמצעות מסנן חיתוך של 10 kDa (ראו טבלת חומרים) ורכזו אותן על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4,500 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס. למדידות SPR, החלף את תמיסות האנליטים ל- 10 mM HEPES, 150 mM נתרן כלורי, 3 mM חומצה אתילנדיאמינטטראאצטית (EDTA), ו- 0.05% Tween20, pH 7.4 (HBS-EP(+), ראה טבלת חומרים).
    1. הוסף את מאגר הריצה SPR זה למקדם דילול של 1:10 וצנטריפוגה ארבע פעמים לנפח ההתחלתי למשך 10 דקות ב- 4,500 x g ו- 4 °C.
  7. קבע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop UV-Vis (ראו טבלת חומרים) בהתבסס על מקדם ההכחדה המחושב (20,440 M-1 cm-1) עבור החלבון העיקרי CVN2L0 המציג גודל של 23,474 Da34. השתמש ב-PBS (100 mM, pH 7.0) או במאגר SPR כריק, ומדוד את ריכוז החלבון בשלושה שלבי דילול (1:1, 1:10 ו-1:100).

figure-protocol-8817
איור 2: רצפי CV-N והבעה . (A) CVN2 ללא קישור בין כל חזרה של CV-N (101 חומצות אמינו כל אחת) וארבעה גשרים דיסולפידיים מבוטא בווקטור pET11a ב-E. קולי. (B) ביטויים של שתי מושבות עצמאיות עבור CV-N (מונומר) ו-CVN2 (דימר). (C) גרסאות הקשר הדיסולפידיות מטוהרות ומנותחות ב-SDS-PAGE. סמן משקל מולקולרי נמוך (6 μL) משמש כהפניה. WT = CVN2L0 הנושא ארבעה גשרים דיסולפידיים כפי שמסומנים ב-(A). V2 הוא גרסה עם החלפת קשר דיסולפידית על ידי שאריות קוטביות בעמדות 58 ו-73. V3-V5 הן גרסאות עם שני קשרי S-S שנותרו וקוטביות (C58E-C73R) או לא-קוטביות (C58W-C73M) המחליפות חומצות אמינו או שילוב של תחליפי זוגות שאריות אלה. (D) כרומטוגרמות HPLC של CVN2L0 מטוהרות מלוטות בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה עם שיפוע ליניארי מ-5%-65% מאגר B במאגר A מעל 30 דקות. חיץ A הוא: 0.1% (v/v) חומצה טריפלואורואצטית ב-ddH2O, חיץ B הוא: 0.08% (v/v) חומצה טריפלואורואצטית באצטוניטריל. חלבון מנותח על עמוד ג'ל סיליקה בעל ביצועים גבוהים 300-5-C4 (150 x 4.6 מ"מ) ב-214 ננומטר ו-280 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

7. ספקטרוסקופיית SPR

  1. השתמש במערכת SPR דו-ערוצית (ראה טבלת חומרים) עם מאגר פועל HBS-EP(+) ו-10 mM גליצין HCl pH 1.5-1.6 כמאגר ההתחדשות. הפעל את המכשיר, degasser, דוגם אוטומטי, משאבה ולשטוף את המערכת כולה עם ddH20 במשך 1 שעות. יש להניח את מאגר ההפעלה המוכן לשימוש בבקבוק נפרד.
  2. יש להפיל שמן אמרסיה על הגלאי ולהרכיב שבב חיישן זכוכית (ראו טבלת חומרים) המצופה בסרט זהב דק ובצדו העליון מתפקד עם הידרוג'ל קרבוקסימתילדקסטרן ישירות על הגלאי שמתחת לתא הזרימה בעל שלוש היציאות. תקן את ההגדרה על-ידי משיכת הטיפול כלפי מטה.
    הערה: C19RBDHC30M 200 ננומטר סטרפטווידין נגזר קרבוקסימתילדקסטרן הידרוג'ל עם צפיפות בינונית של ביוטינילציה תסמונת נשימתית חריפה חמורה coronavirus-2 חלבון RBD, הוא שבב חיישן מוכן לשימוש עם ליגנד משותק מראש.

8. בדיקת קשירת SPR לקשירת CV-N ל-HA, חלבון S ו-RBD

  1. שיתקו את הליגנדות החלבוניות לשבבי חיישנים לפי השלבים הבאים.
    1. פתח טבלת הפעלה על ידי לחיצה על טופס בשורת התפריטים והפעל עורך טבלאות בתוכנת SPRAutoLink המשולבת (ראה טבלת חומרים). בחר ולחץ על BASIC_Immobilization מרשימת טבלאות ההפעלה הזמינות ובצע את השלבים של ההליך הניסויי על מסך המחשב. עורך הדוגמאות המתאים שבו נעשה שימוש מוצג בפינה השמאלית העליונה.
    2. לחץ על עורך ערכת דוגמאות במקטע טופס כדי למלא את רשימת הריאגנטים עבור שני ארונות תקשורת הממוקמים בדוגם האוטומטי לניתוחים נוספים. לחץ על Autosampler Direct Control כ"כלי" בשורת התפריטים כדי להחזיר את המדפים קדימה או אחורה. בחר 4 °C כטמפרטורת ההפעלה.
      הערה: תוכנת SPR מאפשרת "שליטה ישירה במכשיר SPR" ו"שליטה ישירה במשאבה " באמצעות בחירת הכלים המתאימים, כמו גם טיפול בדגימה אוטומטית, ועל ידי לחיצה על טופס; ניתן גם להפעיל את עורך הטבלה, מתווה הנתונים או לאחר העיבוד כדי לבצע ניתוח נתונים. הקבצים נשמרים ישירות בספריית ברירת המחדל ומיוצאים כ- scrubber.files מהחלון שלאחר העיבוד.
  2. הפעל את המשאבה כדי להחדיר ddH20 על ידי לחיצה על כלים ושליטה ישירה משאבה ולהקליט נתונים על ידי לחיצה על SPR מכשיר שליטה ישירה, ובכל פעם התחל בחלונות החדשים שהופיעו. שים את ריאגנטים צימוד (שלב 8.3) בבקבוקונים 300 μL, לשים אותם לתוך מדפי autosampler ולהתחיל את שולחן ההפעלה על ידי לחיצה על הפעלה.
    הערה: משטחי השבב מותנים ב-pH 9.0 של חיץ גליצין של 10 mM או שהם נשטפים ב-1 M נתרן כלורי, 0.1 M נתרן בוראט בופר pH 9.0 כדי למצב משטח שבב שמקורו בקרבוקסיל עבור תערובת הפעלה EDC/NHS30.
  3. עבור אינטראקציה פשוטה זו בין חלבון לחלבון, השתמש בשבב CMD500D (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור יחידות אינדקס מיקרו-שבירה (μRIU) = 2500 - 3000 תא זרימה עם HA משותק ו- μRIU = 400 תא זרימה עם חלבון ספייק. בקצב זרימה של 15 μL/min, להזריק תערובת מימית ושווה של 0.4 M N-אתיל-N'-(דימתילאמינופרופיל) קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC*HCl) ו-0.1 M N-הידרוקסיוקסינימיד (NHS) על ידי יישום הצעדים הרציפים הבאים.
    1. מילוי מחדש של משאבת המילוי ב-25,000 μL/min, בצע התאמה בסיסית למשך 30 שניות, הזרקת 90 μL של תמיסת הפעלת דגימה (EDC/NHS) במשך 6 דקות זמן מגע, ולאחר מכן החזק למשך 5 דקות נוספות.
    2. חזור על מחזור זה לאחר שקו הבסיס פועל במשך דקה אחת ב-10 μL/min רק על תא הזרימה השמאלי (כחול) כדי להזריק ולשתק פפטידים מסונתזים כימית10, HA וחלבון ספייק ב-20 מיקרוגרם/מ"ל, ולאפשר את התאמת הבסיס הבאה עם ddH2O למשך 1.5 דקות לפני המרווה את משטח השבב המופעל עם 1 M אתנולמין HCl pH 8.5.
  4. החלף את הצינורות מהדוגם הנוזלי לדגה מ- ddH20 לבקבוק עם HBS-EP(+) (איור משלים 1).
  5. נתחו את חיישני ה-SPR.
    1. כדי לבצע מחקרים קינטיים, השתמש בריכוזי אנאליטים שונים (10-5-10-8 M), עם שלב התחדשות לאחר כל זריקה ומדידות ריקות לאחר אנליזות שונות. שנה את קצב הזרימה ל-10 μL/min והתחל בזריקות למשך 4 דקות זמן מגע, לאחר מכן 5 דקות ייצור בסיסי, ושני שלבי התחדשות של 2 דקות כל אחד עם מרווח של 30 שניות.
    2. הזריקו את תמיסת המאגר למדידות ריקות שהחיישנים שלהן מופחתים מריצות דגימה כדי לנרמל ריכוזי חלבונים שונים.
  6. לחץ על טופס, גלול מטה ושנה ל"לאחר עיבוד "על ידי לחיצה על מצב פעולה זה. לחץ על הוסף כדי לבחור עקומות איגוד שנוצרו לאורך זמן בטופס התוויית הנתונים עבור כל תא זרימה, וייצא את שכבת העל כקובץ scrubber ( .ovr). לחץ על קובץ כדי לפתוח את אפשרויות שמירת הקבצים. השג עקומות תגובה על-ידי יישור עקומות לשמאל ולימין והפחתת אותות של ערוץ הייחוס השני מאלו של ערוץ הליגנד.
    הערה: הנתונים מופעלים ב"לאחר עיבוד" על ידי הגדרת חיישנים באופן חישובי. הוא מוכנס לתוך שכבה של חיישנים מתאי זרימה שמאליים וימניים, או מיוצג כסנסוגרמות מההפרש של שני הערוצים.
  7. נקו את כל הנוזלים עם pH 9.5 של מאגר גליצין של 50-100 mM, מים ו-20% אתנול לפני ואחרי מדידות קשירה כדי להסיר עקבות של מלח או כל זיהום חלבוני, או מחמיר יותר, עם 0.5% SDS וגליצין.
    הערה: כדי למנוע נזק למכשיר, מומלץ לבדוק את היציבות המכנית של שבב הזכוכית לפני הכנסה מחדש של מחסנית השבב למכשיר אם השבבים אוחסנו מתחת למאגר או בלחות של 100%.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מולקולת CVN2L0 שהוחלפה על-ידי תחום דימרי נבדקת להיקשרות לאזור העליון של HA בשלושה ניסויי SPR נפרדים, וזיקת הקישור מוצגת בערכיK D. ההנחה היא שתחום B כולל אתרי קשירה H, המושפעים מהחלפת קשר דיסולפיד בשאריות יוניות, ותחום A יוצר L10,18. הזרקות בודדות של CVN2L0 וגרסאות V2 (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

זיקת הקשירה של CV-N מתואמת עם מספר אתרי הקישור הפונקציונליים [2H על דומיינים B, ו-2L על דומיינים A כאשר הם מהונדסים כדימר מוחלף דומיין]. גרסה עם זיקה מחייבת משתנה (CVN2L0-V2, קפל יציב הומודימרי של CV-N הכולל נוק-אאוט של גשר דיסולפיד) מתבטאת ב- E. coli, מטוהרת, ונבדקת חיובית לקשירת חלבון HA (H3N2) באמצעות SPR

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחבר אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחבר מודה לד"ר כריסטיאן דרנטל מהמחלקה לביוטכנולוגיה ומיקרוביולוגיה ב- TU Wien והמחלקה לרפואה III, המחלקה לנפרולוגיה ודיאליזה באוניברסיטה הרפואית של וינה, במיוחד ד"ר מרקוס ורמן על תמיכה טכנית ומדעית. ביטוי חלבונים בתאי יונקים נתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה באוניברסיטה למשאבי טבע ומדעי החיים (BOKU) וינה. המחברת רוצה להביע את התודה העמוקה שלה לד"ר ניקו דנקבר מ- XanTec bioanalytics בדיסלדורף, גרמניה, על דיונים מדעיים מועילים על ביצוע מבחני הכריכה של SPR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Äkta primeplusCytiva
Amicon tubesMerckC7715
AmpillicinSigma-AldrichA5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifugeBeckman CoulterB06320
Cell spreaderSigma-AldrichHS86655silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA OligosSigma-AldrichOLIGO
Custom GensynthesisGenScript#1390661 cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mLThermo Scientific50-105-5354
Dionex UlitMate 3000Thermo ScientificIQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) Fisher ScientificER1701
DTTMerckDTT-RO
EDCMerck39391
EDTAMerckE9884
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120086
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifugeSigma-AldrichZ606235
EthanolMerck51976
Ethanolamine HClMerckE6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/PackCorning352057
GlucoseMerckG8270
Glycine HClMerck55097
HA H3 proteinAbcamab69751
HEPESMerckH3375
His-select Ni2+MerckH0537
ImidazoleMerckI2399
IPTGMerckI6758
Kanamycin ASigma-AldrichK1377
Kromasil 300-5-C4Nouryon
LB agarMerck52062
LB agarMerck19344
LB LennoxMerckL3022
LysozymeMerck10837059001
Magnesium chlorideMerckM8266
Magnesium sulfateMerckM7506
NaH2P04MerckS0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometerThermo ScientificND2000CLAPTOP
NaOHMerckS5881
NHSMerck130672
NZ amine (casein hydrolysate)MerckC0626
PBSMerck806552
PD MidiTrap G-10Sigma-AldrichGE28-9180-11
PeptoneMerck70171
pET11aMerck Millipore (Novagen)69436 
PMSFMerckPMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)Qiagen27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel SystemReichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysisReichert
SDSMerck11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmidStratagene#200518
Sodim chlorideMerckS9888
Sodium acetate.TrihydrateMerck236500
SPR sensor chip C19RBDHC30MXanTec bioanalyticsSCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500DXanTec bioanalyticsSCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri DishesThermo Scientific101R20
TBSMerckT591210x, solution
Triton-X100MerckT8787
TryptoneMerck93657
Tween20MerckP1379
Vortex-Genie 2 MixerMerckZ258423
X-galMerckXGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent CellsStratagene#200236
Yeast extractMerckY1625

References

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26(2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621(2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184NNMR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved