JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בנינו זרימת עבודה מטבולית לא ממוקדת ששילבה את XY-Meta ו-metaX יחד. בפרוטוקול זה, הצגנו כיצד להשתמש ב- XY-Meta כדי ליצור ספרייה ספקטרלית מתוך הפניה לספקטרה בגישה פתוחה, ולאחר מכן ביצענו בקרת FDR והשתמשנו במטה-X כדי להגדיל את המטבוליטים לאחר זיהוי ספקטרום המטבולומיקה.

Abstract

טכניקות מטבוליות לא ממוקדות נמצאות בשימוש נרחב בשנים האחרונות. עם זאת, התפוקה ההולכת וגדלה במהירות ומספר הדגימות יוצרים כמות עצומה של ספקטרום, מה שמציב אתגרים לבקרת איכות של ספקטרום ספקטרומטריית המסה. כדי להפחית את התוצאות החיוביות הכוזבות, יש צורך בבקרת איכות של שיעור גילוי כוזב (FDR). לאחרונה, פיתחנו תוכנה לבקרת FDR של זיהוי מטבוליזם לא ממוקד המבוססת על אסטרטגיית Target-Decoy בשם XY-Meta. כאן הדגמנו צינור אנליזה שלם המשלב XY-Meta ו-metaX יחד. פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש ב- XY-meta כדי ליצור מסד נתונים של דמה ממסד נתונים קיים של ייחוס ולבצע בקרת FDR באמצעות אסטרטגיית Target-Decoy לזיהוי מטבוליזם בקנה מידה גדול בערכת נתונים בגישה פתוחה. הניתוח הדיפרנציאלי וביאור המטבוליטים בוצעו לאחר הרצת metaX לזיהוי וכמות שיאים של מטבוליטים. על מנת לסייע לחוקרים נוספים, פיתחנו גם פלטפורמת ניתוח מבוססת ענן ידידותית למשתמש עבור ניתוחים אלה, ללא צורך במיומנויות ביואינפורמטיקה או בשפות מחשב כלשהן.

Introduction

מטבוליטים ממלאים תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים. מטבוליטים הם לעתים קרובות מווסתים של תהליכים שונים כמו העברת אנרגיה, ויסות הורמונים, ויסות של נוירוטרנסמיטורים, תקשורת תאית ושינויים לאחר תרגום של חלבונים וכו '1,2,3,4. מטבוליזם לא ממוקד מספק מבט גלובלי על מטבוליטים רבים 5,6. עם ההתקדמות בטכנולוגיות ספקטרומטריית מסה וכרומטוגרפיה, התפוקה של ספקטרום MS/MS מטבוליום עולה במהירות בשנים האחרונות 7,8,9,10,11. כדי לזהות מטבוליטים ממערכי נתונים ענקיים אלה, פותחו תוכנות ביאור שונות11, כגון MZmine12, MS-FINDER13, CFM-ID14, MetFrag15 ו- SLAW16. עם זאת, זיהויים אלה מכילים לעתים קרובות תוצאות חיוביות כוזבות רבות. הסיבות כוללות: (1) ספקטרום MS/MS מכיל רעש אקראי, שעלול להטעות את התאמת השיא. (2) איזומרים והבדלים באנרגיות הפיצול גורמים לטביעות אצבעות ספקטרום מרובות ובכך מגדילים את נפח ספריית ההפניות. (3) איכות ספריות העיון משתנה. יש צורך בתקן מתאים לבניית ספריית ייחוס ספקטרלית טובה. לכן, בקרת קצב גילוי שגוי שיטתית (FDR) עבור מטבוליקה לא ממוקדת חיונית למחקר מטבוליזם פונקציונלי 7,8,9,17.

הן גישת ה-Empirical Bayes והן אסטרטגיית ה-Target-Decoy התמודדו עם בעיית השליטה ב-FDR באופן כללי. Kerstin Scheubert et al. הראו כי אסטרטגיית Target-Decoy על מסד נתונים של דמה שנוצרה משיטה מבוססת עץ פיצול היא השיטה הטובה ביותר לבקרת FDR9. Xusheng Wang et al. תכננו שיטה ליצירת דמה המבוססת על כלל השמינייה בכימיה ושיפרו את הדיוק של הערכת FDR17. הספרייה הספקטרלית ליצירת מסד נתונים של דמה הודגמה לביצועים טובים יותר18. כאן, שיפרנו את השיטה מבוססת הספרייה הספקטרלית ופיתחנו תוכנה בשם XY-Meta19 שיכולה לשפר עוד יותר את הדיוק של הערכת FDR. הוא משתמש בספרייה הספקטרלית הקיימת של הפניות כדי ליצור ספריית דמה עבור פקד FDR תחת ערכת Target-Decoy. XY-Meta תומך באלגוריתמי התאמת ספקטרום ודמיון קוסינוס משלו. זה מאפשר חיפוש קונבנציונלי ומצבי חיפוש איטרטיביים. בשלב של הערכת FDR, הוא תומך במצב שרשור Target-Decoy ובמצב מופרד. לגמישות טובה יותר, XY-Meta מקבלת ספריות דמה חיצוניות.

זיהוי שיא וכימות של מטבוליטים הוא גם שלב חשוב בניתוח מטבוליזם לא ממוקד. זיהוי שיא הוא השיטה העיקרית לזיהוי מטבוליזם. באופן כללי, הדיוק של גילוי שיא של מטבוליטים הושפע מגורמים רבים, כגון אותות רעש של ספקטרומטריית מסה, שפע נמוך של מטבוליטים, מזהמים ותוצרי פירוק של מטבוליטים20. כאשר מספר הדגימות של גדול מדי או שעמודת הכרומטוגרפיה הנוזלית הוחלפה בניסויים של מטבוליזם לא ממוקד, עשויים להופיע אפקטים יוצאי דופן של אצווה, המהווים אתגר גדול לכמות המטבולומים 21,22,23. נכון לעכשיו, תוכנות כמו XCMS24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 ו- metaX19 יכולות לבצע זיהוי שיא וכמות של מטבוליום לא ממוקד, אך אנו מציעים שהצינור של metaX שלם יותר וקל יותר לשימוש. כאן, אנו מדגימים את תהליך הזיהוי ובקרת ה-FDR עבור מערך נתונים זמין לציבור msv000084112 באמצעות XY-Meta, ואת שיא הזיהוי והכימות של מטבוליטים באמצעות metaX. זרימת עבודה זו דורשת רק שתי קבוצות, וכל קבוצה זקוקה לפחות לשתי דוגמאות. יש צורך בנתוני ספקטרום MS/MS, ללא קשר לפלטפורמת ספקטרומטר המסה, מצב היינון, מצב הטעינה וסוג הדגימה, ויכולים לתמוך בנורמליזציה מבוססת דגימה ובנורמליזציה מבוססת שיא. בעקבות דוגמה זו, חוקרים יכולים לבצע זיהוי וכימות של מטבוליקה בצורה קלה לטיפול. שימוש בצינור זה דורש יכולת תכנות R. כדי לסייע לחוקר ללא כל ידע בתכנות, פיתחנו גם פלטפורמת ניתוח ענן לניתוח מטבוליקה. הדגמנו את פלטפורמת ניתוח הענן הזו בחומר משלים 5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכינו מערכי נתונים של מטבוליקה לניתוח

הערה: בהדגמה זו, אנו משתמשים בערכות נתונים מטבוליות ללא דגימת QC. יש צורך בנתונים עבור מקרים וקבוצות ביקורת. לצורך הדגמה, אנו משתמשים במערך נתונים ציבורי במסד נתוניםGNPS 27.

  1. עבור אל דף האינטרנט https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp. לחץ על עיון בערכות נתונים.
  2. חפש את מילת המפתח "msv000084112" בעמודה כותרת . לחץ על מספר הזיהוי של ערכת הנתונים לקבלת פרטים והורד את ערכת הנתונים באמצעות FTP.
  3. שים את הנתונים הגולמיים בתיקיה /msv000084112.
    הערה: מערך נתונים זה נרכש באמצעות C18 RP-UHPLC בפלטפורמת Q Exactive במצב חיובי. הוא מייצג קבוצה עם מחלה לא אופיינית של חילוף החומרים של נתוני דגימות שתן, כולל 33 דגימות של אנשים בריאים, 12 דגימות ריקות, שתי דגימות ערבוב, ו -82 דגימות של חולים28 (חומר משלים 8). כדי להדגים את זרימת העבודה, בחרנו באופן אקראי שש דגימות של אנשים בריאים (NH) כקבוצת ביקורת ושש דגימות עם המחלה (NT) כקבוצת מקרה לביצוע זרימת העבודה.

2. המרת פורמט נתונים

הערה: אם ערכת הנתונים היא הנתונים הגולמיים המופקים ישירות מספקטרומטר המסה, היא בדרך כלל בתבנית .raw, .wiff או .cdf. יש להמיר אותם לפורמטים mzXML ו- mgf. כאן, אנו משתמשים בכלי msconvert בחבילת ProteoWizard29 כדי לבצע את המרת הפורמט.

  1. הורד את ProteoWizard מ- https://proteowizard.sourceforge.io/download.html והתקן אותו.
  2. המרת תבנית נתונים באמצעות msconvert.exe תחת נתיב ההתקנה ProteoWizard.
    1. המר את הנתונים הגולמיים לתבנית mzXML ואחסן אותם בתיקיית /mzXML:/msconvert.exe /raw/*.raw -o /raw/mzXML/ --filter "peakPicking true [1,2]" --מסנן "zeroSamples removeExtra" --mzML --zlib --mz64 --filter "msLevel 1-2" --filter "titleMaker ... <צ'ארג' סטייט>".
    2. המר את הנתונים הגולמיים/mzXML לפורמט mgf ואחסן אותם בתיקיית /mgf:/msconvert.exe /msv000084112/*.raw -o /msv000084112/mgf/ --מסנן "peakPicking true [1,2]" --מסנן "zeroSamples removeExtra" --mgf --mz64 --מסנן "msLevel 1-2" --מסנן "titleMaker ... <צ'ארג' סטייט>".

3. הכן את ספריית ספקטרל הייחוס למטבוליטים

הערה: XY-meta תומך בספריות הספקטרליות של הייחוס רק בפורמט mgf.

  1. עבור אל דף האינטרנט https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/libraries.jsp. חפש את מילת המפתח "NIST" כדי למצוא את הפריט. לחץ על הצג לקבלת הפרטים והורד את הספריה.
    הערה: ספריות ספקטרליות ציבוריות של GNPS אספו ספריות מטבוליטים רבות, המסודרות בסוג, מוצא, מינים ומצבי איסוף. למרות שרק חלק קטן מהספריות הללו נוצרות באמצעות חומרים סטנדרטיים, הן בדרך כלל מספיקות לרוב המחקרים הבסיסיים.
  2. שים את הספרייה שהורדת GNPS-NIST14-MATCHES.mgf לתוך התיקיה /database.

4. זיהוי מטבוליטים ובקרת FDR

  1. הורד את XY-meta (גירסת Windows). מצא את פרמטר קובץ תצורת הפרמטרים.default תחת התיקיה /XY-Meta-Win/config/. שנה את תוכנו בהתאם לחומר משלים 1.
    הערה: בתמיסה, מטבוליטים יוצרים לעתים קרובות תוסף עם אניונים או קטיונים, מה שמוביל להסטה המונית של יוני אב. לכן, יש צורך להגדיר את סוגי התוספות. סיפקנו רשימות adduct עבור עמודת חילופי יונים ועמודות אנליטיות הפוכות תחת מצב טעינה חיובי ומצב מטען שלילי בתיקיית /adduct. משתמשים יכולים גם לערוך רשימת תוספים משלהם בהתאם לפרויקט המחקר שלהם. רשימת התוספות צריכה להיות באותה תבנית כמו הרשימה שסופקה.
  2. בצע את זיהוי המטבוליטים ואת בקרת ה- FDR באמצעות XY-Meta:XY-Meta.exe -S /XY-Meta-Win/config/parameter.default -D /msv000084112/ pos_wt-1_a.mgf -R /database/GNPS-NIST14-MATCHES.mgf.
    הערה: XY-Meta אינו תומך בתווים כלליים בפרמטרים. לכן, יש להשתמש בפקודה אחת כדי לעבד כל קובץ mgf. עבור מספר רב של קבצים, מומלץ קובץ אצווה.

5. ניתוח דיפרנציאלי

הערה: metaX היא חבילת R בקוד פתוח. אנא התקן אותו על פי המדריך בכתובת https://github.com/wenbostar/metaX. זיכרון RAM של 8GB נדרש לניתוח זה.

  1. ערוך קובץ לדוגמה.txt List כדי לציין את המדגם ואת נתוני MS המתאימים לו. אנא עיין בחומר משלים 2.
    הערה: metaX תומך בניתוח כמותי עבור מערכי הנתונים עם דגימות QC. בעת שימוש בדוגמאות QC, אנא שנה את מאפיין המחלקה ל- NA עבור דגימות QC.
  2. צור תיקיית /פלט כדי לאחסן את התוצאות של ניתוח כמותי. השתמש ב-R כדי להפעיל את הסקריפט בחומר משלים 3 כדי להשתמש ב-metaX כדי לכמת את קבוצות ה-MOCK וה-WT.
    הערה: לפני הפעלת קובץ ה- Script בחומר משלים 3, שנה את הנתיבים בקובץ ה- Script לנתיבים המקומיים בפועל.

6. שילוב תוצאות איכותיות וכמותיות

  1. הפעל את סקריפט R בחומר משלים 4 כדי לבאר את השיאים בניתוח איכותי וכמותי באמצעות זיהוי מטבוליטים.
    הערה: לפני הפעלת הסקריפט בחומר משלים 4, אנא שנה את הנתיבים בקובץ ה- Script לנתיבים המקומיים שלך בפועל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הנתונים הגולמיים של msv000084112 הומרו על ידי msconvert.exe ויצרו קבצי mgf (חומר משלים S6).

XY-Meta יצר קובץ GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf תחת /תיקיית מסד נתונים. זוהי ספריית ההטעיה שנוצרה מספריית הייחוס הספקטרלית המקורית GNPS-NIST14-MATCHES.mgf. ניתן לעשות שימוש חוזר בספריית דמה זו. בעת שימוש חוזר בספריית ד?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בקרת ה- FDR של מטבוליטים לא ממוקדים הייתה אתגר גדול. כאן, הדגמנו צינור שלם של ניתוח מטבוליקה לא ממוקדת בקנה מידה גדול (איכותי וכמותי) עם בקרת FDR. זה למעשה מפחית את התוצאות החיוביות הכוזבות, הנפוצות מאוד בניתוח טרשת נפוצה.

הכנת ספריית ייחוס ספקטרלית מתאימה למחקר שלך היא נקודת מפת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית למפתחות (2018YFC0910200/2017YFA0505001) ותוכנית המו"פ של מפתח גואנגדונג (2019B020226001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
GNPSopen sourcen/ahttps://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp
XY-Metaopen sourcen/ahttps://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta
metaXopen sourcen/ahttps://github.com/wenbostar/metaX
ProteoWizardFree Download3.0.22116.18c918b-x86_64https://proteowizard.sourceforge.io/download.html
CHI.ClientFree Downloadndp48-x86-x64-allos-enuhttp://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt

References

  1. Misra, B. B., Fahrmann, J. F., Grapov, D. Review of emerging metabolomic tools and resources: 2015-2016. Electrophoresis. 38 (18), 2257-2274 (2017).
  2. Idle, J. R., Gonzalez, F. J. Metabolomics. Cell Metabolism. 6 (5), 348-351 (2007).
  3. Fiehn, O. Metabolomics — the link between genotypes and phenotypes. Functional Genomics. Town, C. , Springer. Netherlands. Dordrecht. 155-171 (2002).
  4. Functional Genomics. Town, C. , Springer. Netherlands. Dordrecht. (2002).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Vinayavekhin, N., Saghatelian, A. Untargeted metabolomics. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 30, Unit 30.1 1-24 (2010).
  7. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  8. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nature Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  9. Scheubert, K., et al. Significance estimation for large scale metabolomics annotations by spectral matching. Nature Communications. 8 (1), 1494(2017).
  10. Schrimpe-Rutledge, A. C., Codreanu, S. G., Sherrod, S. D., McLean, J. A. Untargeted metabolomics strategies-challenges and emerging directions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (12), 1897-1905 (2016).
  11. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), (2018).
  12. Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), Oxford, England. 634-636 (2006).
  13. Tsugawa, H., et al. Hydrogen rearrangement rules: computational MS/MS fragmentation and structure elucidation using MS-FINDER software. Analytical chemistry. 88 (16), 7946-7958 (2016).
  14. Wang, F., et al. CFM-ID 4.0: More accurate ESI-MS/MS spectral prediction and compound identification. Analytical Chemistry. 93 (34), 11692-11700 (2021).
  15. Ruttkies, C., Schymanski, E. L., Wolf, S., Hollender, J., Neumann, S. MetFrag relaunched: incorporating strategies beyond in silico fragmentation. Journal of Cheminformatics. 8, 3(2016).
  16. Delabriere, A., Warmer, P., Brennsteiner, V., Zamboni, N. SLAW: A scalable and self-optimizing processing workflow for untargeted LC-MS. Analytical chemistry. 93 (45), 15024-15032 (2021).
  17. Wang, X., et al. Target-decoy-based false discovery rate estimation for large-scale metabolite identification. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2328-2334 (2018).
  18. Li, D., et al. XY-Meta: a high-efficiency search engine for large-scale metabolome annotation with accurate FDR estimation. Analytical Chemistry. 92 (8), 5701-5707 (2020).
  19. Wen, B., Mei, Z., Zeng, C., Liu, S. metaX: a flexible and comprehensive software for processing metabolomics data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 183(2017).
  20. Aberg, K. M., Torgrip, R. J. O., Kolmert, J., Schuppe-Koistinen, I., Lindberg, J. Feature detection and alignment of hyphenated chromatographic-mass spectrometric data. Extraction of pure ion chromatograms using Kalman tracking. Journal of Chromatography. A. 1192 (1), 139-146 (2008).
  21. Liu, Q., et al. Addressing the batch effect issue for LC/MS metabolomics data in data preprocessing. Scientific Reports. 10 (1), 13856(2020).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Fei, F., Bowdish, D. M. E., McCarry, B. E. Comprehensive and simultaneous coverage of lipid and polar metabolites for endogenous cellular metabolomics using HILIC-TOF-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (15), 3723-3733 (2014).
  24. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  25. Giacomoni, F., et al. Workflow4Metabolomics: a collaborative research infrastructure for computational metabolomics. Bioinformatics. 31 (9), Oxford, England. 1493-1495 (2015).
  26. Chang, H. -Y., et al. iMet-Q: A user-friendly tool for label-free metabolomics quantitation using dynamic peak-width determination. PloS One. 11 (1), 0146112(2016).
  27. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  28. Schmid, R., et al. Ion identity molecular networking for mass spectrometry-based metabolomics in the GNPS environment. Nature Communications. 12 (1), 3832(2021).
  29. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), Oxford, England. 2534-2536 (2008).
  30. Johnson, S. R., Lange, B. M. Open-access metabolomics databases for natural product research: present capabilities and future potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 22(2015).
  31. Horai, H., et al. MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences. Journal of Mass Spectrometry: JMS. 45 (7), 703-714 (2010).
  32. Rawlinson, C., et al. Hierarchical clustering of MS/MS spectra from the firefly metabolome identifies new lucibufagin compounds. Scientific Reports. 10 (1), 6043(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved