JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

Abstract

חסינות תורשתית מתארת כיצד בעלי חיים מסוימים יכולים להעביר את "הזיכרון" של זיהום קודם לצאצאיהם. זה יכול להגביר את עמידות הפתוגנים בצאצאיהם ולקדם הישרדות. בעוד שחסינות תורשתית דווחה אצל חסרי חוליות רבים, המנגנונים העומדים בבסיס תופעה אפיגנטית זו אינם ידועים במידה רבה. הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הפתוגן המיקרוספורידיאני הטבעי Nematocida parisii גורם לתולעים לייצר צאצאים עמידים מאוד למיקרוספורידיה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות בין-דורית במודל ההדבקה הפשוט והניתן לגישה גנטית של N. parisii -C. elegans . המאמר הנוכחי מתאר שיטות להדבקת C. elegans ולייצור צאצאים בעלי סיכון. שיטות ניתנות גם לבדיקת עמידות לזיהום מיקרוספורידיה על ידי צביעה למיקרוספורידיה והדמיה של זיהום על ידי מיקרוסקופיה. בפרט, חסינות תורשתית מונעת פלישת תאים מארחים על ידי מיקרוספורידיה, וניתן להשתמש בהכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לכמת אירועי פלישה. ניתן לכמת את הכמות היחסית של נבגי מיקרוספורידיה המיוצרים בצאצאים בעלי קדם חיסוני על ידי צביעת הנבגים בצבע הקושר כיטין. עד כה, שיטות אלה שפכו אור על הקינטיקה ועל הספציפיות הפתוגנית של חסינות תורשתית, כמו גם על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיסה. טכניקות אלה, לצד הכלים הנרחבים העומדים לרשות המחקר של C. elegans , יאפשרו תגליות חשובות בתחום החסינות התורשתית.

Introduction

חסינות תורשתית היא תופעה אפיגנטית לפיה חשיפה הורית לפתוגנים יכולה לאפשר ייצור של צאצאים עמידים לזיהומים. סוג זה של זיכרון חיסוני הוכח אצל חסרי חוליות רבים חסרי מערכת החיסון הנרכשת ויכולים להגן מפני מחלות ויראליות, חיידקיות ופטרייתיות1. בעוד שלחסינות תורשתית יש השלכות חשובות הן על הבנת הבריאות והן על האבולוציה, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הגנה זו אינם ידועים במידה רבה. זאת, בין היתר, משום שרבים מבעלי החיים שבהם תוארה חסינות תורשתית אינם אורגניזמים מבוססים למחקר. לעומת זאת, מחקרים בנמטודה השקופה Caenorhabditis elegans נהנים מארגז כלים גנטי וביוכימי נרחב 2,3, גנום מבואר מאוד 4,5, וזמן דור קצר. ואכן, המחקר ב- C. elegans איפשר התקדמות בסיסית בתחומי האפיגנטיקה והחסינות המולדת 6,7, וכיום הוא מודל מבוסס לחקרהזיכרון החיסוני 8,9.

מיקרוספורידיה הם פתוגנים פטרייתיים שמדביקים כמעט את כל בעלי החיים וגורמים לזיהומים קטלניים בבני אדם מדוכאי חיסון10. זיהום מתחיל כאשר נבג מיקרוספורידיה מזריק או "יורה" את התוכן התאי שלו (sporoplasm) לתוך תא מארח באמצעות מבנה שנקרא צינור קוטב. שכפול תוך-תאי של הטפיל גורם להיווצרות של מרונטים, אשר בסופו של דבר מתמיינים לנבגים בוגרים שיכולים לצאת מהתא11,12. בעוד שטפילים אלה מזיקים הן לבריאות האדם והן לביטחון התזונתי, יש עדיין הרבה מה ללמוד על הביולוגיה הזיהומית שלהם12. Nematocida parisii הוא טפיל מיקרוספורידיאני טבעי המשתכפל אך ורק בתאי המעי של התולעים, וכתוצאה מכך מופחת הנקבוביות, ובסופו של דבר למוות. מודל ההדבקה של N. parisii -C. elegans שימש כדי להראות: (1) את התפקיד של אוטופגיה בפינוי פתוגנים13, (2) כיצד מיקרוספורידיה יכולה לצאת מתאים נגועים באופן לא ליטי14, (3) כיצד פתוגנים יכולים להתפשט מתא לתא על ידי יצירת סינקטיה15, (4) החלבונים שבהם N. parisii משתמש כדי להתממשק עם המארח שלה16, ו-(5) ויסות תגובת הפתוגן התוך-תאי השעתוק (IPR)17, 18.

פרוטוקולים לזיהום של C. elegans מתוארים בעבודה הנוכחית וניתן להשתמש בהם כדי לחשוף את הביולוגיה הייחודית של מיקרוספורידיה ולנתח את תגובת המארח לזיהום. המיקרוסקופיה של תולעים קבועות המוכתמות בצבע הקושר כיטין Direct Yellow 96 (DY96) מראה את התפשטות הזיהום של נבגי מיקרוספורידיה המכילים כיטין ברחבי המעי. צביעת DY96 מאפשרת גם הדמיה של עוברי תולעים המכילים כיטין לצורך הערכה סימולטנית של כוח המשיכה של התולעים (היכולת לייצר עוברים) כקריאה של כושר המארח.

עבודות אחרונות גילו כי C. elegans נגועים ב - N. parisii מייצרים צאצאים שעמידים מאוד לאותו זיהום19. חסינות תורשתית זו נמשכת דור אחד ותלויה במינון, שכן צאצאים מהורים נגועים יותר עמידים יותר בפני מיקרוספורידיה. באופן מעניין, הצאצאים בעלי הפריים של N. parisii גם עמידים יותר בפני פתוגן המעי החיידקי Pseudomonas aeruginosa, אם כי הם אינם מוגנים מפני הפתוגן הטבעי Orsay virus19. העבודה הנוכחית מראה גם כי צאצאים בעלי כוונה חיסונית מגבילים את פלישת התאים המארחים על ידי מיקרוספורידיה. השיטה מתארת גם את איסוף הצאצאים בעלי ההון החיסוני וכיצד ניתן להשתמש ב-FISH כדי לזהות N. parisii RNA בתאי מעיים כדי לבחון פלישה של תאים מארחים ולירותנבגים 20.

יחד, פרוטוקולים אלה מספקים בסיס מוצק לחקר מיקרוספורידיה וחסינות תורשתית ב- C. elegans. התקווה היא שעבודה עתידית במערכת מודלים זו תאפשר תגליות חשובות בתחום המתהווה של חסינות תורשתית. טכניקות אלה עשויות גם להיות נקודות מוצא לחקר חסינות תורשתית הנגרמת על ידי מיקרוספורידיה באורגניזמים מארחים אחרים.

Protocol

המחקר הנוכחי משתמש בזן בריסטול N2 מסוג C. elegans מסוג בר שגדל ב-21 מעלות צלזיוס.

1. הכנת מדיה

  1. הכן מדיה M9 לפי הדו"ח הקודם21,22.
  2. להכין מדיום צמיחת נמטודות (NGM) לפי הדו"ח הקודם21,22. יוצקים 12 מ"ל של NGM לכל צלחת 6 ס"מ או 30 מ"ל לכל צלחת של 10 ס"מ.
  3. הכן Escherichia coli זן OP50-1 לפי דו"ח קודם23.
  4. הכן צלחות NGM עם זרעי OP50-1 בהתאם לשלבים הבאים.
    1. Resuspend 10x מרוכז OP50-1 על ידי מערבולת.
    2. השתמשו בפיפטה מהדרת כדי לזרוע את הצלחות במרכז. עבור לוחות 6 ס"מ ו -10 ס"מ, זרע עם נפח של 200 μL או 500 μL, בהתאמה.
    3. עבור צלחות 10 ס"מ, השתמשו במפיץ זכוכית כדי להפיץ את OP50-1 וליצור מדשאה של חיידקים. אין להפיץ את החיידקים עד לקצה הצלחת.
      הערה: אתנול טובלים ומבעירים את המפזר כל חמש צלחות כדי להבטיח סטריליות. אפשרו למפיץ להתקרר למשך מספר שניות לפני התפשטותו כדי למנוע הרג של חיידקים.
    4. השאירו צלחות בטמפרטורת החדר למשך יומיים לייבוש וכדי להבטיח את צמיחת מדשאת החיידקים.
      הערה: ניתן לאחסן צלחות שנזרעו בטמפרטורת החדר למשך 2-3 שבועות או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.

2. תחזוקה של C. elegans

  1. שמור על תולעים על מקור מזון חיידקי קבוע על צלחות NGM עם זרעי OP50-1.
    הערה: הרעבה עלולה לגרום לפנוטיפים בין-דוריים, מה שעלול להשפיע על התוצאות. צלחת בעלת זרע OP50-1 בקוטר 10 ס"מ תומכת ב-2,500 L1s (שלב הזחל המוקדם ביותר של C. elegans) למשך עד 72 שעות.
  2. אם התולעים גוועות ברעב, גדלות במשך שלושה דורות על OP50-1 לפני השימוש בתולעים לניסויים.

3. סנכרון של אוכלוסיות C. elegans באמצעות נתרן היפוכלוריט (הלבנה)

הערה: שלב זה רגיש מאוד לזמן, לכן ודא שהצנטריפוגה זמינה לפני תחילת העבודה. פרוטוקולי הלבנה חלופיים ומהירים פחות זמינים בספרות וניתן להשתמש בהם במידת ההעדפה. כדי למנוע מ-6% נתרן היפוכלוריט לאבד פעילות לאורך זמן, אחסנו את המגיב בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ושמרו עליו עד שנה.

  1. הכינו 2 מ"ל של תמיסת אקונומיקה לכל דגימה על ידי ערבוב של 400 μL של 1 M NaOH, 250 μL של 6% נתרן היפוכלוריט (ראה טבלת חומרים), ו-1350 μL של מים מזוקקים.
  2. שטפו תולעים בוגרות (כ-72 שעות לאחר הבקיעה) מהצלחות לתוך צינור מיקרו-סנטריפוג' תוך שימוש ב-1 מ"ל של מדיית M9.
    הערה: אם תולעים רבות נשארות על הלוחות, גלול את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 1,400 x g במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, הסר את supernatant באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל, ולבצע שטיפות צלחות נוספות.
  3. צנטריפוגה בגודל 1,400 x גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי לכדור את התולעים, ואז לשטוף 2x עם 1 מ"ל של מדיה M9 כדי להסיר חיידקים.
  4. הסר את ה-supernatant, הוסף 1 מ"ל של תמיסת האקונומיקה המוכנה (שלב 3.1.), והגדר טיימר למשך דקה אחת. הפוך את הצינורות 3-4x.
    הערה: תחת מיקרוסקופ אור, ניתן לראות את התולעים מפסיקות לטרוף.
  5. לאחר דקה אחת, צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 30 s בטמפרטורת החדר כדי לכפות את התולעים, ולאחר מכן להסיר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של תמיסת אקונומיקה טרייה.
  6. עקוב מקרוב אחר הצינורות תחת מיקרוסקופ אור כדי לדמיין את פגרי התולעת מתפצלים ומשחררים עוברים. התקדמו מיד לשלב הבא כאשר כ-50%-80% מהפגרים התפצלו ועוברים רבים שוחררו.
    הערה: בהתאם למספר בעלי החיים ולזן התולעת, שלב זה יכול להימשך 15 שניות עד 4 דקות. מסיבות לא ידועות, לתולעים הנגועות ב-N. parisii לוקח לעתים קרובות זמן רב יותר להלבין מאשר לבעלי חיים שאינם נגועים.
  7. צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי לכפות את העוברים, ולאחר מכן לשטוף 3x ב 1 מ"ל של מדיה M9.
    הערה: שטיפות מדללות את תמיסת ההיפוסכלוריט השיורית מהצינורות ויש לבצען במהירות כדי להבטיח שתמיסת האקונומיקה לא תפגע בעוברים.
  8. הוסיפו 1 מ"ל של מדיית M9 לכדור הסופי והעבירו לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של מדיית M9. להשעות את העוברים בנפח סופי של 5 מ"ל.
  9. סובבו את הצינורות על רוטור מכני (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות כדי לבקוע את העוברים לתוך L1s.
    הערה: מכיוון ש - N. parisii מדביק את מעי התולעת ואינו פולש לחיידק, הורים נגועים אינם מעבירים את הזיהום לצאצאיהם על ידי העברה אנכית19. הלבנה של מבוגרים נגועים מסנכרנת בעלי חיים F1 ומשמידה את נבגי N. parisii , ומבטיחה שצאצאי F1 אינם נגועים בנבגים המועברים מההורים.
  10. צנטריפוגה של הצינורות במשך דקה אחת ב-1,800 x g בטמפרטורת החדר כדי להעיף את ה-L1s, ולהשליך את כל ה-L1s פרט ל-1 מ"ל של הסופרנאטנט.
  11. פיפטה 1-5 μL של תערובת L1 על לוחית NGM שלא נזרעה, ומיד סופרת את מספר ה-L1 בטיפה על ידי הדמיה תחת מיקרוסקופ אור. חזור על 3x וממוצע את הספירות כדי לקבוע את הריכוז והמספר הכולל של L1s.
    הערה: יש לבקוע את רוב העוברים, וה-L1s צריכים לנוע במהירות בטיפה הנוזלית. אם חלק גדול מהעוברים הלא מעוברים וה-L1 הרדומים (הנעים באיטיות) נשארים, הדבר מצביע על הלבנה למשך זמן רב מדי.

4. הכנת נבגי נ. פריזי

  1. הכן נבגים N. parisii בעקבות הפניות שפורסמו בעבר19,24.

5. זיהום של C. elegans עם N. parisii כדי להניב צאצאים בעלי חיסון

  1. יום אחד לפני ההדבקות המתוכננות, העבירו את המספר הנדרש של 10 ס"מ צלחות NGM בלתי מזוהמות מ-4 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר.
  2. מיד לפני ההדבקה, צנטריפוגה כ-2,500 תולעי L1 מסונכרנות ב-1,400 x גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר בצינור מיקרו-סנטריפוג' כדי להעיף את התולעים. הסר סופרנטנט עם קצה פיפטה כדי להשאיר תולעים בכ-50 μL של מדיה M9.
  3. הוסיפו 1 מ"ל של 10x OP50-1 לנבגי L1s ו-N. parisii לריכוז הרצוי (בדרך כלל כ-2.5 מיליון נבגים). כבקרה לא נגועה, הכן צינור שווה ערך של L1s ו- OP50-1 עם נפח של מדיית M9 השווה לנפח הכנת הנבגים המשמש.
    הערה: כדי להשיג צאצאים בעלי חיסון, השתמש במינון נבגים גבוה מספיק כדי >90% מבעלי החיים יידבקו ב-72 שעות (כפי שנמדד על ידי צביעת DY96, שלב 7) אך נמוך מספיק כדי >80% מבעלי החיים עדיין יהיו גרבידיים. זה מבטיח שרוב הצאצאים מגיעים מהורים נגועים ושהלבנה של ההורים מניבה מספיק עוברים לבדיקת F1. למרות שתכשירי הנבגים משתנים בריכוזם ובהדבקתם, מינון הורי מתאים הוא בדרך כלל בין 5-15 μL של הכנת נבגים (כ-2.5 מיליון נבגים) לכל צלחת של 10 ס"מ.
  4. מערבולת לזמן קצר כדי לערבב ולצלוח את 1 מ"ל הנ"ל של תולעים על צלחת NGM בלתי נזרעת 10 ס"מ. מערבלים כדי לוודא שהנוזל מתפשט על פני כל הצלחת.
  5. מייבשים את הצלחות בארון נקי עם המכסים כבויים למשך 10-20 דקות או עד לייבוש מוחלט, לפני דגירה בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
  6. בשעה 72 שעות לאחר ההדבקה (hpi), שטפו את התולעים מהצלחות לצינור מיקרו-צנטריפוג' באמצעות 1 מ"ל של מדיה M9. אם תולעים רבות נשארות על הצלחות, הוציאו את התולעים על ידי צנטריפוגה ב-1,400 x גרם במשך 30 שניות, הסירו את הסופרנאטנט ובצעו שטיפות צלחות נוספות.
  7. צנטריפוגה בגודל 1,400 x גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר לתולעי כדוריות, לשטוף 2x עם 1 מ"ל של מדיה M9 או עד שהסופרנטנט ברור. Resuspend בכרך סופי של 1 מ"ל של מדיה M9.
  8. פיפט למעלה ולמטה כדי לערבב, ואז להעביר 100 μL של התולעים התלויות לצינור טרי.
    הערה: מדגם זה של כ-250 מבוגרים יכול להיות קבוע ומוכתם מאוחר יותר כדי לקבוע את כושר התולעת ההורי ואת מצב הזיהום, כמתואר בשלב 7 ובתחילת שלב 3.
  9. כדי לפתוח את התולעים הבוגרות ולשחרר עוברי F1 לבדיקה, יש להלבין את 900 μL הנותרים של תולעים תלויות, כמתואר בשלב 3.
    הערה: שלב זה גם הורס כל נבגי N. parisii לפני מבחני ההדבקה הבאים.

6. בדיקת חסינות בירושה ל- N. parisii ב- C. elegans

  1. בצע זיהומים כמתואר בשלבים 5.1.-5.6., עם שינויים כאמור להלן.
    הערה: ניתן להקטין את מבחני הזיהום ב-F1 ולבצע אותם על לוחות NGM בגודל 6 ס"מ באמצעות כ-1,000 תולעי L1 ו-400 μL של 10x OP50-1. יש להשתמש גם במינון "גבוה" של נבגים, כך שכ-100% מה-F1 הנאיביים (כלומר, תולעים מהורים לא נגועים) נגועים, ורק כ-10% מה-F1 הנאיביים הם גרבידיים. למרות שתכשירי הנבגים משתנים בריכוזם ובהדבקתם, מינון מתאים הוא בדרך כלל בין 5-15 מיקרון ל"ל (כ-2.5 מיליון נבגים) לכל צלחת של 6 ס"מ.
  2. ב-72 hpi, לתקן ולהכתים כדי לקבוע את כושר התולעת ואת מצב הזיהום, כמתואר בשלב 7.

7. צביעת DY96 של C. elegans כדי לדמיין עוברים ונבגי מיקרוספורידיה

הערה: DY96 הוא צבע ירוק קושר כיטין פלואורסצנטי המכתים עוברי תולעים ודפנות נבגים מיקרוספורידיה 19,15,25. זה מאפשר ניטור סימולטני של הכושר ואת מצב הזיהום של התולעים.

  1. שטפו את התולעים מהצלחות לתוך צינור microcentrifuge באמצעות 1 מ"ל של מדיה M9 המכילה 0.1% Tween-20. אם תולעים רבות נשארות על הלוחות, הוציאו את התולעים על ידי צנטריפוגה במהירות של 1,400 x גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, הסירו את הסופרנאטנט באמצעות קצה פיפטה, ובצעו שטיפות צלחות נוספות.
  2. צנטריפוגה בגודל 1,400 x g במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי להעיף את התולעים, ולשטוף 2x עם 1 מ"ל של מדיה M9 המכילה 0.1% Tween-20 או עד שהסופרנאטנט ברור.
  3. הסר את ה- supernatant, הוסף 700 μL של אצטון והשאר את התולעים לתקן בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את התולעים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לעיבוד עד מספר חודשים לאחר מכן, אם תרצה בכך.
  4. צנטריפוגה ב-10,000 x g במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי להעיף את התולעים הקבועות, ולשטוף 2x עם 1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% Tween-20 (PBST).
  5. הכינו 50 מ"ל של תמיסת עבודה DY96: PBST, 0.1% (v/v) נתרן דודציל סולפט (SDS) ו-20 מיקרוגרם/מ"ל DY96 (מתוך תמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים) (ראו טבלת חומרים). עוטפים את הצינור בנייר כסף ומאחסנים אותו במגירה כדי למנוע חשיפה לאור.
    הערה: ניתן לאחסן מלאי ופתרונות עבודה של DY96 למשך > שנה אחת בטמפרטורת החדר אם הם נשמרים בחושך.
  6. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי לפוצץ את התולעים ולהסיר supernatant. הוסף 500 μL של תמיסת עבודה DY96 לכדור וסובב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי לפוצץ את התולעים. הסר את ה-supernatant והוסף 15 μL של מדיום ההרכבה עם/בלי DAPI (ראה טבלת חומרים).
  8. פיפטה 10 μL של התמיסה המכילה תולעים מוכתמות על שקופית מיקרוסקופ ומניחה כיסוי מעליה.
    הערה: ניתן לאחסן שקופיות ודוגמאות נוספות בטמפרטורה של 4 °C בחושך לאחסון לטווח ארוך.

8. הדמיה וניתוח של תולעים מוכתמות ב-DY96 כדי להעריך את כושר התולעים ואת מצב הזיהום

  1. כדי לנתח את התולעים המוכתמות ב-DY96 (המותקנות על שקופיות, כמו בשלב 7.8),בצע הדמיה באמצעות תעלת ה-GFP של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. כדי לקבוע את הכושר של אוכלוסיות התולעים, השתמש במטרה של פי 5 או 10 כדי לבחון את כוח המשיכה של >100 תולעים לכל מצב.
    הערה: תולעים הנושאות עובר ≥1 נחשבות לגראביות. מוני תאים מכניים יכולים לעזור למזער טעויות אנוש בעת הספירה. עוברי תולעים מוכתמים פחות (פחות פלואורסצנטיים) מאשר נבגי מיקרוספורידיה19. העוברים הם ביצית, ~ 50 מיקרומטר x ~ 30 מיקרומטר, ונמצאים בגוף האמצעי של מבוגרים בריאים של C. elegans . מבוגרים בריאים ולא נגועים נושאים 10-20 עוברים המאורגנים בשורות לאורך גופם26.
  3. כדי לחשוף הבדלים עדינים יותר בכושר, בצעו ספירת עוברים. לשם כך, לספור באופן ידני את מספר העוברים ב 20-30 תולעים בודדות לכל מצב.
  4. כדי לקבוע עד כמה אוכלוסיות התולעים נגועות, השתמש במטרה של פי 5-40 כדי להעריך את מצב ההדבקה של >100 תולעים לכל מצב. תולעים הכוללות מספר כלשהו של נבגי מעיים תוך תאיים נחשבות נגועות.
    הערה: נבגי מיקרוספורידיה בהירים יותר מעוברי תולעים. הנבגים בצורת שעועית של N. parisii הם ~ 2.2 μm x ~ 0.8 μm והם מיוצרים בתאי המעי של התולעת מ ~ 48 hpi15. תולעים שבהן נבגים נראים אך ורק בלומן המעיים ולא לאורך דפנות המעיים אינן נחשבות נגועות19. הסיבה לכך היא כי נבגים אלה מייצגים ככל הנראה נבגים חדשים שנבלעו שאינם נובעים מזיהום של הפרט.
  5. באמצעות תוכנה לניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים), כימות את נטל הטפילים ואת גודל התולעים בהתאם לשלבים הבאים.
    1. תמונה 20-30 תולעים המותקנות על מגלשות מיקרוסקופ באמצעות סטריאוסקופ זקוף פלואורסצנטי לכל דגימה. צלם תמונות בערוצי ברייטפילד, DAPI ו-GFP. בחר חשיפה מתאימה בערוץ GFP כך שהפלואורסצנציה בדגימות הנגועות ביותר אינה רוויה.
      הערה: עדיין ניתן לדמיין את הזיהום בדגימות הפחות נגועות. התמונות מצולמות בדרך כלל באמצעות מטרה של פי 5.
    2. פתח קבצים ב- FIJI / ImageJ. בהתאם לסוג הקובץ, ייתכן שיידרש התוסף Bio-Formats Importer כדי לפתוח תמונות ב-ImageJ.
    3. חלוקה לרמות של 20-30 תולעים בודדות בתמונות באמצעות תמונות שדה בהיר או DAPI והכלי בחירות מצולעים בסרגל הכלים. שמור כל חלוקה לרמות באמצעות ניתוח כלי > > מנהל אזורי עניין (ROI) בתפריט הנפתח על-ידי לחיצה על הוסף [t]. תאר בעלי חיים הנראים במלואם במסגרת.
      הערה: ניתן לבחון מחדש את קווי המתאר של התולעת מאוחר יותר על-ידי שמירת הקובץ עם קווי מתאר כ- Tiff.
    4. לחץ על ביטול הבחירה במנהל ההחזר על ההשקעה כדי להסיר את כל קווי המתאר מהתמונה ולחץ על תמונה > שכפול בתפריט הנפתח. הקלד את המספר המתאים לערוץ העניין בתיבה "ערוצים" כדי לשכפל את ערוץ ה- GFP עבור נטל הטפילים (לדוגמה, 2).
    5. סף ערוץ זה באמצעות תמונה > התאם את סף > לרמה שבה נלכד נטל הטפיל הבהיר אך הפלואורסצנציה העמעומה יותר מעוברי תולעים אינה, ולאחר מכן לחץ על החל. שים לב לערכי הסף שהוחלו והשתמש בהם באופן עקבי עבור כל התמונות של אותו ניסוי.
      הערה: בדוק שהסף הוא ערך מתאים הן עבור הדגימות הפחותות והן עבור הדגימות הנגועות ביותר לפני ניתוח כל התמונות.
    6. בחר נתח > הגדר מדידות וסמן את התיבה עבור שבר שטח. בחר קווי מתאר של תולעת בודדת בתורם ממנהל ההחזר על ההשקעה ולחץ על הפונקציה נתח > מדידה . חלון תוצאות יספק את המדידה עבור %Area (כלומר, % נטל טפילים).
      הערה: אם הפלואורסצנציה מהעוברים כה בהירה עד שהיא חוצה את הסף, ניתן להשתמש בכלי Paintbrush בשחור בסרגל הכלים כדי למחוק באופן ידני אזורים אלה לפני מדידת %Area.
    7. כדי לקבוע את גודל התולעת כקריאת כושר, תאר את התולעים כמתואר בשלב 8.3. בחר נתח > הגדר מדידות וסמן את התיבה עבור אזור. בחר קווי מתאר של תולעת בודדת בתורם ממנהל ההחזר על ההשקעה ולחץ על הפונקציה נתח > מדידה . חלון תוצאות יספק את המדידה עבור %Area.

9. בדיקת FISH להערכת פלישה של C. elegans על ידי מיקרוספורידיה וירי נבגים

הערה: הגשושית MicroB FISH מזהה אזור שמור של מיקרוספורידיאן 18s rRNA וניתן להשתמש בה כדי לתייג ספורופלזמות תוך תאיות (כלומר, תאים מארחים פולשים) ואת החומר הגנטי בתוך נבגים.

  1. זיהום 6,000 תולעי L1 מסונכרנות עם 4 מיליון נבגים של N. parisii ו-10 μL של 10x OP50-1 בנפח סופי של 400 μL המורכב ממדיית M9.
  2. צלחת את התערובת על צלחת NGM 6 ס"מ לא נזרעת, יבש בארון נקי במשך 10-20 דקות, ומניחים ב 21 °C (76 °F).
  3. לאחר 30 דקות, לשטוף את החיות מן הצלחות עם 1 מ"ל של M9 מדיה המכילה 0.1% Tween-20.
  4. גלול את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 1,400 x גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את הסופרנאטנט באמצעות קצה פיפטה, הוסף 700 μL של אצטון, ואפשר לו לשבת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את התולעים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לעיבוד במועד מאוחר יותר.
  6. בצע בדיקת FISH במהלך הלילה באמצעות בדיקת MicroB בעקבות דוחות שפורסמו בעבר27,19.
    הערה: כדי להעריך את ירי הנבגים, הוסיפו את 500 μL האחרונים של מאגר הכביסה עם 20 מיקרוגרם/מ"ל של DY96 לדגימות וסובבו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס לפני שתמשיכו בפרוטוקול כרגיל.
  7. אחסן את השקופיות בתיבת שקופיות בטמפרטורה של 4 °C (75 °F). לאחסון לטווח ארוך (כלומר, מספר חודשים), אחסן דגימות נוספות בצינורות microcentrifuge בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  8. כדי להעריך פלישה בתולעים מוכתמות ב-FISH, הביטו בתולעים באמצעות הערוץ האדום של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. דמיינו אירועי זיהום בהגדלה גבוהה (פי 63 אובייקטיבית) מכיוון שבעלי חיים מסוג L1 הם קטנים, וספורופלזמות יהיו בשלבים המוקדמים של השכפול. כדי להעריך ירי נבגים, השתמש במטרה פי 63 ובתעלות פלואורסצנציה אדומות וירוקות כאחד.
    הערה: נבגים שבהם GFP ו- mCherry אות קולוקליזציה נחשבים ללא פגע; מקרי נבגים ריקים של GFP נחשבים לירי.
  9. כדי לבחון פלישה או ירי נבגים, ספרו ידנית את מספר הספורופלזמות (מוקדי mCherry בתאי המעי) או את אחוז הנבגים שנורים ב-20-30 תולעים לכל מצב. התאם את המיקוד במישור z כדי ללכוד את כל אירועי ההדבקה והנבגים, אשר נמצאים לעתים קרובות במישורים שונים.
    הערה: Sporoplasms נמצאים באופן בלעדי בתוך תאי המעי. הריכוז הגבוה ביותר של sporoplasms נמצא בדרך כלל מיד לאחר הלוע. אם דגימות מוכתמות גם ב- DY96, חפש את נוכחותם של ספורופלזמות שאינן מתמזגות עם הנבג.

תוצאות

במחקר הנוכחי, אוכלוסיות הורים של C. elegans (P0) נדבקו בשלב L1 עם מינון נמוך של נבגי N. parisii . תנאי זיהום אלה משמשים בדרך כלל להשגת מספר גבוה של צאצאי F1 עמידים למיקרוספורידיה באמצעות הלבנה של ההורים. אוכלוסיות הורים נגועות ובקרות לא נגועות נקבעו ב-72 hpi והוכתמו ב-DY96 כדי לדמיין את עוברי התולעי...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את חקר המיקרוספורידיה והחסינות התורשתית במודל זיהום פשוט וניתן למתיחה גנטית של N. parisii -C. elegans .

הכנת נבגים היא פרוטוקול אינטנסיבי שבדרך כלל מניב מספיק נבגים במשך 6 חודשים של ניסויים, בהתאם לפרודוקטיביות24. חשוב לציין, יש לקבוע את הה...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לוויני ז'או וליין צ'ן וואן על מתן הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (מענק #522691522691).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2.0 mm zirconia beadsBiospec Products Inc.11079124ZX
10 mL syringeFisher Scientific1482613
5 μm filterMillipore SigmaSLSV025LS
Axio Imager 2Zeiss-Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom MicroscopeZeiss-For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean BenchBaker-
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 VGlobal IndustrialT9FB893150
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count CytometersFisher ScientificDRM600
Direct Yellow 96Sigma-AldrichS472409-1G
EverBrite Mounting Medium with DAPIBiotium23001
EverBrite Mounting Medium without DAPIBiotium23002
Fiji/ImageJ softwareImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanical rotorThermo Sceintific415110 / 1834090806873Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching
MicroB FISH probeBiosearch Technologies Inc.-Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2Wild-type, Bristol strainDefault strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-AldrichL3771-100G
Sodium hydroxide solution (5 N)Fisher ChemicalFLSS256500
Sodium hypochlorite solution (6%)Fisher ChemicalSS290-1
Stemi 508 Stereo MicroscopeZeiss-For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups
Tween-20Sigma-AldrichP1379-100ML
Vectashield + A16BiolynxVECTH1500

References

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182Caenorhabditis elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved