הדמיה ביומולקולרית של קליטת תאים של ננו-חלקיקים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית רב-מודאלית לא ליניארית

Summary

מאמר זה מציג את השילוב של מודול מיקוד ספקטרלי ולייזר פולסים בעל פלט כפול, המאפשר הדמיה היפרספקטרלית מהירה של ננו-חלקיקי זהב ותאים סרטניים. עבודה זו נועדה להדגים את הפרטים של טכניקות אופטיות רב-מודאליות לא ליניאריות במיקרוסקופ סריקת לייזר סטנדרטי.

Abstract

חקירת ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) במערכות חיות חיונית כדי לחשוף את האינטראקציה בין AuNPs לרקמות ביולוגיות. יתר על כן, על ידי שילוב אותות אופטיים לא ליניאריים כגון פיזור ראמאן מגורה (SRS), פלואורסצנציה מעוררת שני פוטונים (TPEF) ובליעה חולפת (TA) לפלטפורמת הדמיה, ניתן להשתמש בו כדי לחשוף ניגודיות ביומולקולרית של מבנים תאיים ו- AuNPs באופן רב-מודאלי. מאמר זה מציג מיקרוסקופיה אופטית רב-מודאלית לא ליניארית ומיישם אותה לביצוע הדמיה כימית ספציפית של AuNPs בתאים סרטניים. פלטפורמת הדמיה זו מספקת גישה חדשנית לפיתוח AuNPs פונקציונליים יעילים יותר ולקביעה אם הם נמצאים בתוך כלי הדם המקיפים את מרחבי הגידול, הציוד ההיקפי או התאי.

Introduction

ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) הראו פוטנציאל גדול כבדיקות הדמיה תואמות ביולוגית, לדוגמה, כמצעי ספקטרוסקופיית ראמאן (SERS) יעילים משופרים על פני השטח ביישומים ביו-רפואיים שונים. יישומים עיקריים כוללים תחומים כגון ביוסנסינג, הדמיה ביולוגית, ספקטרוסקופיות משופרות פני השטח וטיפול פוטותרמי לטיפול בסרטן¹. יתר על כן, בדיקת AuNPs במערכות חיות היא חיונית להערכה ולהבנה של יחסי הגומלין בין AuNPs למערכות ביולוגיות. ישנן טכניקות אנליטיות שונות, כולל ספקטרוסקופיית אינפרה-אדום התמרת פורייה (FTIR)², ספקטרומטריית מסה מצומדת אינדוקטיבית בלייזר (LA-ICP-MS⁾³, והדמיית תהודה מגנטית (MRI)⁴ ששימשו בהצלחה לחקר התפלגות AuNPs ברקמות. עם זאת, שיטות אלה סובלות ממספר חסרונות כגון היותן גוזלות זמן וכרוכות בהכנת דגימות מורכבות³, הדורשות זמני רכישה ארוכים, או היעדר רזולוציה מרחבית תת-מיקרונית ^2,4.

בהשוואה לטכניקות הדמיה קונבנציונליות, מיקרוסקופיה אופטית לא ליניארית מציעה מספר יתרונות לחקירת תאים חיים ו- AuNPs: המיקרוסקופיה האופטית הלא ליניארית משיגה עומק הדמיה עמוק יותר ומספקת יכולת חיתוך אופטית תלת-ממדית פנימית עם שימוש בלייזרים אולטרה-מהירים כמעט IR. עם השיפור המשמעותי במהירות ההדמיה וברגישות הגילוי, הודגמו כיצור פלואורסצנטי של שני פוטונים (TPEF)^5,6,7 ומיקרוסקופיה של דור הרמוני שני (SHG)8,9,10 כדי לשפר עוד יותר את ההדמיה הלא פולשנית של ביומולקולות אנדוגניות בתאים ורקמות חיים. יתר על כן, באמצעות טכניקות אופטיות לא ליניאריות חדשניות של משאבה-בדיקה כגון ספיגה חולפת (TA)11,12,13,14 ופיזור ראמאן מגורה (SRS)^15,16,17,18, ניתן לגזור ניגודיות ביוכימית נטולת תוויות של מבנים תאיים ו- AuNPs. להדמיה של AuNPs ללא שימוש בתוויות חיצוניות יש חשיבות רבה מכיוון שהפרעות כימיות של הננו-חלקיקים ישנו את תכונותיהם הפיזיקליות ומכאן את קליטתם בתאים.

פרוטוקול זה מציג את היישום של מודול יחידת תזמון ורקומבינציה של מיקוד ספקטרלי (SF-TRU) עבור לייזר פולסים באורך גל כפול, המאפשר הדמיה רב-מודאלית מהירה של AuNPs ותאים סרטניים. עבודה זו נועדה להדגים את הפרטים של טכניקות משולבות TPEF, TA ו- SRS במיקרוסקופ סריקת לייזר.

Protocol

1. הפעלת מערכת הלייזר

1. הפעל את מערכת האינטרלוק ובחר לייזר זרוע לפני הפעלת המערכת.
2. הפעל את המחשב עם התוכנה כדי לשלוט בלייזר femtosecond בעל הפלט הכפול.
3. טען את התוכנה עבור לייזר femtosecond בעל פלט כפול; תוכנה זו מאפשרת להפעיל ולכבות את הלייזר ושולטת ישירות באורך הגל של קרן המשאבה.
4. הפעל את פליטת הלייזר על-ידי לחיצה ממושכת על סמל ההפעלה לספירה של 3.
5. המתן עד שהלייזר יתחמם והנורית המוכנה ללייזר תידלק בירוק בתוכנה.
6. אורך הגל של קרן המשאבה נשלט ישירות באמצעות התוכנה; זה יכול לנוע בין 680-1,300 ננומטר. להדמיה תאית באזור הרטט C-H Raman, בחר 802 ננומטר.
7. פתח את התריסים של קרן המשאבה הניתנת לכוונון וקרן סטוקס בגודל 1,045 ננומטר על ידי החזקת תמונות הצמצם למשך 3 שניות.
   התראה: הנחיית בטיחות לייזר לייזר הפמטו-שניות בעל הפלט הכפול הוא לייזר בפולסים אינפרא-אדומים מדרגה IV ועלול לגרום נזק בלתי הפיך לראייה. לכן, יש לעקוב אחר כל הכללים המקומיים של בטיחות לייזר בעת ביצוע הליך זה: (i) רק משתמשים מורשים שקיבלו הדרכת בטיחות לייזר יכולים לבצע את ההליך. (2) הכניסה למעבדה היא באמצעות כרטיס החלקה עם אינטרלוק על דלת החדר. (3) במשך רוב הפעולה, קרני הלייזר סגורות במלואן. (iv) כאשר קרן הלייזר נחשפת, יש להרכיב משקפי בטיחות לייזר (השתמש במשקפי הבטיחות של לייזר LG9, המעניקים חסימת OD 7+ הן של המשאבה והן של קרני סטוקס).

2. הפעלת יחידת התזמון והרקומבינציה של המיקוד הספקטרלי (SF-TRU)

1. טען את תוכנת הכספומט על אותו מחשב עם תוכנת הלייזר, השולטת בשלבי ההשהיה ובמנחתי הלייזר ביחידת SF-TRU.
   הערה: יחידה זו אחראית לוודא שהמשאבה ואלומות סטוקס חופפות מרחבית, לשלוט בפיזור במשאבה ובאלומות סטוקס, ולשלוט בהשהיית הזמן בין המשאבה לקורות סטוקס. הקיטוב הן של המשאבה והן של קורות סטוקס הוא אנכי. שימו לב שכל קרן מצוידת בצלחת חצי גל כדי לשלוט באופן עצמאי בקיטובים לפני היציאה מה-SF-TRU.
2. ודא שגם המשאבה וגם לייזרי סטוקס מוחלשים ל-<10% (משאבה) ו-<15% (אלומות סטוקס). אם האלומות אינן מוחלשות, כוח הלייזר עלול לגרום נזק למערכת ולשרוף דגימות ביולוגיות.
3. עבור הדמיה תאית, הגדר את הגדרות הלייזר האופטימליות ל- 6% (משאבה) ו- 10% (סטוקס), המתאימות ל- 12 mW ו- 30 mW בדגימה.
4. ל-SF-TRU יש שתי הגדרות: מצב femtosecond (fs) ומצב picosecond (ps).
5. במצב fs, לחצו פנימה את הידיות משני צדי הקופסה (פעולה זו מסירה את סורגי הפיזור מנתיב הקורה).
6. במצב ps, משכו את הידיות משני צדי הקופסה (פעולה זו ממקמת את סורגי הפיזור בנתיב הקורה).
7. עבור הדמיה היפרספקטרלית, בחרו במצב ps.
8. ודא ששלב ההשהיה נמצא במיקום הנכון עבור המשאבה ואלומות סטוקס לחפיפה זמנית להדמיית C-H במערכת זו.
9. ודא שהגדרות הפיזור של המשאבה וקרן סטוקס נכונות; עבור משאבת 802 ננומטר, זה 5 מ"מ עבור קרן המשאבה ו -30 מ"מ עבור קרן סטוקס.

3. אפנון קרן סטוקס להדמיית SRS

1. לזיהוי SRS, לווסת את עוצמת קרן סטוקס.
2. הפעל את מחולל האותות לאפנון הקרן.
3. זכור הגדרות קודמות, שהן כדלקמן:
   פלט 1: גל מרובע: תדר = 19.5 מגה-הרץ, משרעת = 1.4 V.
   פלט 2: גל מרובע: תדר = 19.5 מגה-הרץ, משרעת = 300 mV.
4. הפעל את יציאות 1 ו-2.
5. חבר את פלט 1 למגבר עבור EOM בתיבת SF-TRU באמצעות כבל BNC.
6. חבר את פלט 2 למגבר הנעילה המשמש לזיהוי SRS באמצעות כבל BNC.
7. הפעל את ספק הכוח למגבר שעל הגנטר.

4. הפעלת מגבר הנעילה

1. להדמיית SRS, השתמש במודול זיהוי SRS הכולל פוטודיודה בשטח גדול ומגבר נעילה ייעודי.
2. הפעל את ספק הכוח למגבר הנעילה בגנטרי.
3. טען את התוכנה עבור מגבר הנעילה "מודול זיהוי SRS" במחשב.
4. בתוכנה, בחר את ההגדרות הבאות: שלב = 0°, היסט = -80 mW, רווח = 58 dB.
5. בחר את קבוע הזמן של שילוב מגבר הנעילה בתוכנה: עבור הדמיית תאים, קבוע הזמן של 2 μs נותן תמונות באיכות טובה.

5. הפעלה במיקרוסקופ סריקת לייזר

1. הפעל תקעים של כל הציוד למעט תיבת השלט הרחוק. המתן עד להארת מצב המתנה בתיבת הבקרה הממוקמת בחלק העליון של הגנטרי.
2. הפעל את תיבת השלט הרחוק על הגנטרי והפעל את גב הקופסה. המתן עד שהנורית המרוחקת תהפוך לכחולה (על תיבת הבקרה) ולחץ על התחל פעולה.
3. הפעל את המחשב של מיקרוסקופ סריקת הלייזר.
4. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי.
5. בדוק את נתיב האור של המיקרוסקופ באמצעות תוכנת המחשב.
   הערה: כמה שינויים נעשו במיקרוסקופ כדי להפוך אותו מתאים להדמיית SRS: (i) בנתיב הקרן, מעבר קצר של 775 ננומטר נוסף לגלגל המסנן שבו קרני הלייזר נכנסות ליחידת הסריקה, ניתן לבחור זאת בכרטיסייה Lightpath בתוכנת המחשב. (ii) במקום להשתמש ב-PMTs המובנים של המיקרוסקופ הקונפוקלי לצורך גילוי, נוסף גלאי מותאם אישית לנתיב האור המועבר, המאפשר גם זיהוי SRS וגם CARS. (3) היציאות מגלאים אלה מחוברות לתיבה האנלוגית שעל הגאנטרי. אות מכוניות מה-PMT מחובר באמצעות כבל BNC ל-CD1 ואות SRS ממגבר הנעילה מחובר באמצעות כבל BNC ל-CD2.
6. שלוט במיקוד באמצעות מסך המגע או ידיות השלט-רחוק או תוכנת המחשב.
7. בחר את הגדרות התמונה הרצויות בתוכנה; זה כולל זום, גודל התמונה בפיקסלים וזמן השהייה בפיקסלים.
8. ודא שמהירות ההדמיה (זמן השהייה בפיקסלים) גדולה מזמן האינטגרציה שנקבע בתוכנת מגבר הנעילה.
   הערה: מטרת טבילה במים של NA 1.2 שימשה להדמיה.

6. הרכבת דגימה בשלב המיקרוסקופ

1. הכן את דגימות התאים להדמיה באופן הבא.
   1. תרבית 4T1 תאי קרצינומה של עכבר יונק ב-RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). משנים את המדיום כל יומיים ומעבירים את התאים במפגש של 70%-80%.
      הערה: קטעים 8-10 שימשו לאורך כל הניסויים המתוארים כאן.
   2. עבור ניסויי הדמיה, דגירה של 1 x 10 5 תאים על כיסויים מרובעים במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס,⁵ % CO₂. לאחר מכן, שטפו את התאים בתמיסת מלח (PBS) שחוממה מראש ודגרו בננו-חלקיקי זהב (דילול של 1:100 בתווך תרבית תאים, ריכוז מלאי: 2.3 x 10 10 חלקיקים/מ"ל, קוטר:⁶⁰ ננומטר) למשך 4 שעות.
   3. לפני ההדמיה, שטפו את התאים ב-PBS קר כקרח וקבעו אותם עם 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את התאים עם PBS 3x, ולאחר מכן הרכיבו בין שני כיסויים להדמיה.
2. הניחו טיפת מים מזוקקים על גבי מטרת טבילת המים שממקדת את קרני הלייזר אל הדגימה שבין המטרה לדגימה. לאחר מכן, הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ.
3. מעבה עם NA 1.4 אוסף את האור המתפשט קדימה. יש למרוח טיפת מים בין המעבה לדגימה לצורך הדמיה. כוונן את גובה המעבה לכ-1 מ"מ מעל הדגימה כדי לאסוף את כמות האור המרבית.
4. גלאי ה-SRS נמצא על תושבת ניתנת להזזה, המאפשרת להחליק פנימה והחוצה מהמסלול האופטי של האיסוף. על מנת להתמקד בדגימה באמצעות אור לבן, הזיזו את גלאי ה-SRS מנתיב הקרן.
5. החזירו את הגלאי לנתיב הקרן, מוכן להדמיית SRS.

7. שינוי משמרת ראמאן ואיסוף ערימת נתונים היפרספקטרלית

הערה: הסטת ראמאן שבה מתבצעת ההדמיה תלויה במיקום שלב ההשהיה בתיבת SF-TRU ובאורך הגל של קרן המשאבה ממערכת הלייזר.

1. עבור שינויים גדולים בהזזת ראמאן, שנה את אורך גל הלייזר. לדוגמה, להדמיית תנודות CH בין 2,800-3,100 ס"מ-1, בחר 802 ננומטר, ואילו עבור הדמיה של כ-1,600 ס"^מ-1 עבור שיא אמיד I, בחר את קרן המשאבה ב-898 ננומטר. התאם זאת באמצעות התוכנה.
2. כדי להשיג התאמות קטנות במשמרת ראמאן, סרוק את שלב ההשהיה ביחידת SF-TRU.
3. ה- SF-TRU נותן מיקומי שלב השהיה במילימטרים (מ"מ). כדי להמיר את מיקום שלב ההשהיה ממ"מ לסמ^"מ-1, בצע את סריקת הכיול ההיפרספקטרלית באמצעות דגימה של חרוזי פוליסטירן והשווה את מיקומי השיא שנמצאו בסריקת הכיול לאלה שצולמו במערך ראמאן ספונטני. פעולה זו תספק משוואה ליניארית, הממירה את מיקום שלב ההשהיה במ"מ להזזת ראמאן בס"^מ-1.
4. כדי ליצור סריקה היפרספקטרלית, צלם סדרת זמן של תמונות במיקומים שונים בשלב ההשהיה.
5. כדי לסנכרן רכישת תמונה ותנועה של שלב ההשהיה, השתמש ביחידה האנלוגית כדי לשלוח ולקבל אותות TTL אל מערכת SF-TRU וממנה.
   הערה: לשם כך, התיבה האנלוגית כוללת את החיבורים הבאים: (i) TRIG OUT VD1 - זו מחוברת ל- SF-TRU באמצעות BNC ושולחת אות TTL כדי להורות לשלב ההשהיה לנוע בדרגה +1. (ii) TRIG ב-1 - כאן, אות נקלט באמצעות BNC כאשר שלב ההשהיה סיים את תנועתו, וזה משמש להפעלת התמונה הבאה בסדרת הזמן.
6. עבור ערכת הנתונים ההיפרספקטרלית, בחר את ההגדרות הבאות בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי:
   1. בכרטיסיה גורם מפעיל , בחר התחל על-ידי מפעיל TTL (מופעל) והפעל (כל מסגרת).
   2. בכרטיסיה סדרה, הגדר את סדרת הזמן ON ואת סדרת z OFF.
   3. הגדר את מספר המסגרות בסדרת הזמן כך שתתאים למספר הצעדים בתוכנת הכספומט (101 צעדים משמש כאן).
7. בתוכנת הכספומט, עבור אל הכרטיסייה הפעלה .
   1. הגדר את מיקומי שלב ההשהיה במילימטרים עבור ההתחלה והעצירה של הסריקה ההיפרספקטרלית. עבור אזור מספר גל גבוה CH, השתמש בעמדת ההתחלה = 90.25 מ"מ ובמיקום העצירה = 92.25 מ"מ.
   2. ודא שמספר הצעדים תואם את מספר המסגרות בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי.
8. לאחר בדיקת ההגדרות הנכונות, הפעל תחילה את הערימה ההיפרספקטרלית בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי. עבור אל רכוש ולחץ על התחל סריקה. לאחר מכן, בתוכנת הכספומט, לחץ על התחל. פעולה זו יוזמת איסוף של סדרת תמונות, עם עליות מצטברות במיקום שלב ההשהיה בין עמדות ההתחלה והעצירה שנבחרו
9. ייצא את סדרת התמונות ההיפרספקטרליות כקובץ .tif מרובה מסגרות והשתמש בחבילת תוכנה מתאימה לביצוע הכיול.
10. לאחר השלמת הכיול, השתמש במשוואת הכיול הליניארי כדי להמיר את מיקום שלב ההשהיה להסטות ראמאן.
11. למעבר בין הדמיה באזור רטט CH (2,800-3,100 ס"מ-1) לאזור הרטט של אמיד I 1,500-1,700 ס"^מ-1), בצע את הפעולות הבאות.
    1. שנה את אורך הגל של המשאבה בתוכנת הלייזר מ-802 ננומטר ל-898 ננומטר.
    2. שנה את הגדרת הפיזור של סטוקס בתוכנת הכספומט מ-30 מ"מ ל-5 מ"מ.
    3. בצע התאמה קטנה למראה במסלול הפיזור של קרן המשאבה בתוך תיבת SF-TRU. זה נעשה על ידי התאמת הידית התחתונה על תושבת המראה, אשר משנה את זווית המראה על ידי כמות מצטברת.
    4. בעת ביצוע סריקה היפרספקטרלית מעל אזור אמיד I, הגדר את עמדות ההתחלה והעצירה בתוכנת הכספומט ל- 89 ו- 91 מ"מ, בהתאמה
       התראה: יש להרכיב משקפי מגן לייזר לשלב זה מכיוון שקרן הלייזר תהיה חשופה.

תוצאות

מודול התזמון ויחידת הרקומבינציה של מיקוד ספקטרלי (SF-TRU) מוצג בין לייזר הפמטו-שניות בעל הפלט הכפול לבין מיקרוסקופ סריקת הלייזר המותאם. מערכת הלייזר המהירה במיוחד המשמשת במחקר זה כוללת שתי יציאות יציאה המספקות קרן אחת באורך גל קבוע של 1,045 ננומטר והקרן השנייה ניתנת לכוונון בטווח של 680-1,300 ננומ?...

Discussion

מחקר זה הציג את השילוב של מודול SF-TRU ומערכת לייזר מהירה במיוחד עם פלט כפול המדגים את יישומיו למיקרוספקטרוסקופיה רב-מודאלית. עם יכולתה לחקור ספיגת ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) על ידי תאים סרטניים, פלטפורמת ההדמיה הרב-מודאלית יכולה לדמיין את תגובות התאים לטיפולים בסרטן היפרתרמי כאשר קרני לייזר נספגו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APE SRS Detection Unit	APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)	APE Lock-in Module	Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning Unit	Olympus	FV 3000	Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm	Invitrogen	C37483	Polystyrene microspheres
Coverslips	Thorlabs	CG15CH2	22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBS	Gibco	10500-064	Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
Flouview	Olympus	FV31S-SW	Laser scanning microscope control software
Function Generator	BX precision	40543	Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
Gold Nanoparticles	Nanopartz	A11-60	Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output Interface	Olympus	FV30 ANALOG	This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3	Newport	Spectra-Physics	Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope Frame	Olympus	IX83	Inverted microscope
Mouse 4T1 cells	ATCC	CRL-2539	Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion Objective	Olympus	UPLSAPO60XW/IR	The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 Condenser	Nikon	CSC1003	Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMT	Hamamatsu	R3896	PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT Connector	Hamamatsu	C13654-01-Y002	Connector for PMT
Power Supply	RS	RSPD-3303 C	Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640	Gibco	A10491-01	Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRU	Newport Spectra Physics	SF-TRU	System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS