חקירת ההשפעות המקלות של מתן Bacillus cereus על קוליטיס באמצעות אפנון מיקרוביוטה של המעיים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל עכברי קוליטיס המושרה על ידי פסאודו-חיידקים נטולי חיידקים דקסטרן סולפט נתרן כדי לחקור את תפקידה של מיקרוביוטת המעיים בוויסות ההשפעות החיוביות של Bacillus cereus על קוליטיס.

Abstract

מאמינים כי לדיסביוזה של חיידקי המעיים יש תפקיד בהתקדמות קוליטיס. עם זאת, הסטנדרטים המדויקים למתן פרוביוטיקה להקלה על קוליטיס נותרו לא מוגדרים. רוב שיטות הניתוח מסתמכות על מגוון ושפע מוגבלים של מיקרואורגניזמים במעיים. לכן, מחקרים תצפיתיים אינם יכולים לבסס סיבתיות. במחקר זה, יישמנו עכברים נטולי חיידקים המושרים על ידי אנטיביוטיקה כדי לחקור את תפקידה של מיקרוביוטת המעיים בוויסות ההשפעות הפרוביוטיות של Bacillus cereus (B. cereus) על קוליטיס הנגרמת על ידי דקסטרן סולפט נתרן (DSS) בעכברים. תהליך זה מאפשר להעריך את ההשפעה הדו-כיוונית של תוסף B. cereus על הבריאות ומספק תוצאות יציבות וניתנות לשחזור. כאן מסופקים הפרוטוקולים המפורטים לגידול B. cereus , ניתוח גבאז', איסוף צואה וטיפול בפינוי אנטיביוטיקה בעכברי קוליטיס. שיטות האופטימיזציה ישימות גם להפרעות דלקתיות כרוניות אחרות. התוצאות הראו כי מתן B. cereus הפחית את הירידה במשקל הגוף, קיצור אורך המעי הגס, מדד פעילות המחלה והציונים ההיסטופתולוגיים. עם זאת, טיפול באנטיביוטיקה דיכא את ההשפעה החיובית של B. cereus על קוליטיס. תוצאות אלה מצביעות על כך שמיקרוביוטת המעיים נחוצה להקלה על ההשפעות של B. cereus על קוליטיס. לכן, חקירת ההשפעות המועילות של פרוביוטיקה במחקר זה היא גישה מבטיחה לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות להקלה על הסימפטומים של הפרעות דלקתיות כרוניות.

Introduction

מחלות מעי דלקתיות (IBDs) הן הפרעות דלקתיות כרוניות שכיחות במערכת העיכול, כולל מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית (UC)¹. הדרכים הטיפוליות הנוכחיות לקוליטיס דלקתית הן 5-אמינוסליצילטים, קורטיקוסטרואידים, אזתיופרין ואנטיביוטיקה². יתר על כן, לתרופות אלו יש תופעות לוואי ניכרות³. לכן, עלינו לשים לב יותר להשפעת הפרוביוטיקה על הטיפול בקוליטיס.

גישות טיפוליות חלופיות כוללות מתן פרוביוטיקה, ששימש במודלים של בעלי חיים ובניסויים קליניים. מחקרים קודמים הצביעו על כך שמתן פרוביוטיקה שונה, כגון Bacillus cereus או Bifidobacterium infantis, יכול להקל על קוליטיס ^4,5. במחקרים פרה-קליניים יש לחקור את היעילות והבטיחות של פרוביוטיקה במודלים של בעלי חיים.

מודלים של עכברי קוליטיס נתרן דקסטרן סולפט (DSS) יכולים לעזור לחקור את המנגנונים של קוליטיס ולהעריך את ההשפעות החיוביות של פרוביוטיקה. השראת ה-DSS גורמת לשחיקה של רירית המעי, תפקוד לקוי של מחסום המעי ועלייה בחדירות האפיתל של המעי⁶. רוב דגמי העכברים לפרוביוטיקה הדגישו בעיקר את ההשפעות הביולוגיות. עם זאת, המנגנון מאחורי מתן פרוביוטיקה זו מאתגר לחקירה, בהתחשב במגבלה באימות נוסף של הקשר הסיבתי בין פרוביוטיקה להקלה על קוליטיס. לפיכך, יש צורך לפתח שיטה סטנדרטית לחקר המנגנון של חיידקים פרוביוטיים.

באופן מסורתי, מחקרים אלה דורשים חיסון פרוביוטיקה מסוימת בעכברים נטולי חיידקים⁷. עם זאת, ישנן כמה מגבלות מעבדה בשימוש בעכברים נטולי חיידקים כקולטנים לפרוביוטיקה, כגון יכולת חיסונית נמוכה ומתקנים יקרים ללא חיידקים⁸. על מנת להימנע ממגבלות אלה, הוקם מודל קוליטיס חלופי המושרה על ידי DSS באמצעות עכברים נטולי חיידקים מדומים. מודל העכבר הפסאודו-נטול חיידקים הוקם על ידי יישום אנטיביוטיקה כפי שתואר קודם לכן ^9,10.

במאמר זה, אנו מקימים עכברים נטולי חיידקים עם קוקטייל אנטיביוטי. אנו גם מתארים בפירוט את המתודולוגיה לביסוס והערכה של מודלים של קוליטיס בעכברים וחוקרים את ההשפעות של פרוביוטיקה על הקלה על תסמיני קוליטיס. הפרוטוקול שלהלן מספק גם את השיטות למתן פרוביוטיקה על ידי גבאג'.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של אוניברסיטת אנהוי, סין, וכל הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת אנהוי, סין (No. IACUC (AHU)-2020-014).

1. מתן אנטיביוטיקה

1. הכינו קוקטייל של אנטיביוטיקה על ידי המסת אמפיצילין (1 גרם/ליטר), ניאומיצין סולפט (1 גרם/ליטר), מטרונידזול (0.5 גרם/ליטר) וונקומיצין (0.5 גרם/ליטר) ב-1 ליטר מי שתייה⁵.
2. לאחר פירוק מוחלט, יש לאחסן את התמיסות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. הכניסו את תמיסות הקוקטייל האנטיביוטי לבקבוק מים. הנח את הבקבוק על גבי כלוב העכבר.
   הערה: הקפד להשתמש בבקבוקים חומים או לעטוף את הבקבוקים בנייר אלומיניום כדי להגן על תמיסות האנטיביוטיקה מפני אור.
4. החלף את קוקטייל האנטיביוטיקה בתמיסות טריות פעמיים בשבוע.
5. אפשר לעכברים לשתות את תמיסות הקוקטייל האנטיביוטיות בחופשיות למשך 4 שבועות.

2. הכנת מי שתייה DSS והשראת קוליטיס

1. כדי ליצור תמיסת נתרן דקסטרן סולפט (DSS) של 2.5%, ממיסים 2.5 גרם DSS ב-100 מ"ל מים מזוקקים¹¹.
2. החלף את מי השתייה בתמיסת DSS של 2.5% בקבוצת העכברים מדגם קוליטיס. ודא שלעכברים בקבוצת הקוליטיס אין גישה למי שתייה אחרים. בינתיים, טפלו בעכברי הביקורת במים מזוקקים ללא DSS.
3. עכברי בית זכרים C57BL/6J (משקל גוף ממוצע, 20 גרם ± 2 גרם; בני 7 שבועות) בתנאים נטולי פתוגנים עם גישה חופשית למזון ומים סטנדרטיים.
   הערה: מאכלסים בסך הכל חמישה עכברים בכל כלוב בתנאים נטולי פתוגנים.
4. תכנון ניסיוני
   הערה: הניסויים בבעלי חיים תוכננו בשני שלבים. חמישה עכברים נכללו בכל קבוצה.
   1. שלב ראשון: כדי להעריך את ההשפעה החיובית של B. cereus על הקלה על קוליטיס, יש לחלק את העכברים באופן אקראי לשלוש הקבוצות הבאות: קבוצת ביקורת (ביקורת), מודל קוליטיס הנגרמת על ידי DSS (DSS), תוסף פרוביוטי של B. cereus לעכברים המושרים על ידי DSS (B. cereus).
   2. שלב שני: כדי לחקור את תפקידה של מיקרוביוטת המעיים בוויסות ההשפעות הפרוביוטיות של B. cereus על קוליטיס הנגרמת על ידי DSS, הקצו את העכברים באופן אקראי לשלוש הקבוצות הבאות: ABX (ביקורת), ABX (DSS) ו-ABX (B. cereus + DSS).
      1. טפל בעכברים בקבוצת ABX (ביקורת) במי מלח פיזיולוגיים.
      2. לאחר טיפול בתמיסות קוקטייל אנטיביוטיות במשך 4 שבועות, תנו לעכברים בקבוצת ABX (DSS) לקבל מים המכילים 2.5% DSS למשך שבוע אחד ותמיסת מלח פיזיולוגית רגילה למשך שבועיים.
      3. לאחר טיפול בתמיסות קוקטייל אנטיביוטיות ומי DSS, יש לטפל בעכברים מקבוצת ABX (B. cereus + DSS) מדי יום עם B. cereus (2 x 10⁸ תאים) ב-200 מיקרוליטר של מי מלח פיזיולוגיים באמצעות צינורית תוך קיבה למשך שבועיים.
5. לאחר מתן הקוקטייל האנטיביוטי, יש לטפל מיד בעכברי C57BL/6 הזכרים בתמיסת DSS 2.5% במי שתייה למשך 7 ימים.
6. רשום את משקל הגוף של העכברים לפני התערבות ה-DSS כמשקל הבסיס.

3. כימות של B. cereus

1. הכן שמונה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל מלאים ב-900 מיקרוליטר של מי מלח רגילים סטריליים.
2. פיפטה 100 מיקרוליטר של גידול לוגריתמי B. cereus ומתמוססת ב-900 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים רגילים.
3. יש לדלל באופן סדרתי את B. cereus באמצעות צינורות.
4. צלחת 40 מיקרוליטר מכל דילול על צלחת אגר LB המתאימה המסומנת ביחס הדילול. חזור על הפעולה פי 3 עבור כל יחס דילול.
5. תרבית את הצלחות בחממה בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
6. בחר את הצלחות עם ~20-70 מושבות לספירה. חשב את ריכוז החיידקים הממוצע לפי מכפיל הדילול של הלוחות שנבחרו.

4. הכנת B. cereus לגבאז'

1. לאחר הכימות של B. cereus, אספו 1 מ"ל של מדיום B. cereus המכיל 1 x 10⁹ CFU וצנטריפוגה ב-8,000 x גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את תאי החיידקים פי 2 במים סטריליים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 8,000 x גרם למשך 10 דקות והסירו את הסופרנטנט.
2. יש לדלל את ה-B. cereus המרוכז בתמיסת מלח סטרילית רגילה לריכוז סופי של 2 x 10⁸ CFU/200 μL⁴.
3. פיפטה את הדילול למעלה ולמטה שוב ושוב כדי להשיג תרחיף B. cereus מפוזר.
4. בצע את הכימות של ריכוז B. cereus בטכניקת ספירת הלוחות לפני השלמת שיטת הגבאג'.

5. יישום תוספי B. cereus על ידי gavage

1. יש לתת את ההתערבויות (2 x 10⁸ CFU פרוביוטיקה ב-200 מיקרוליטר של מי מלח רגילים) לעכברים דרך הפה בזמן קבוע.
2. כדי לתת B. cereus, חבר מחט גבג' (גודל מחט הזנה: 20 גרם, 38 מ"מ) למזרק של 1 מ"ל. נגב את החלק החיצוני של מחט הגאווג' עם 70% אתנול בין עכברים ושמור על יישום מינון נכון.
3. כדי לרסן את העכברים, הרימו אותם בזנבם, ותפסו בחוזקה את העור הרפוי של הגב כשקצה הזנב קבוע בין שתי האצבעות האחרונות של המטפל.
4. שמור את העכברים במצב אנכי. לאחר מכן, הכנס את מחט הגאווג' בזהירות ובעדינות דרך הפה לוושט. אם לא נתקלת בהתנגדות בשלב זה, דחף בעדינות את המחט לתוך הקיבה.
   הערה: יש לאשר נשימה סדירה וללא הפרעה של העכברים לפני מתן התרופה.
5. התקדם לאט את המחט והטיל את תמיסת B. cereus . משוך את המחט בעדינות לאחר השלמת הגוואג. שחרר את העכבר והחזר אותו לכלוב שלו.

6. קביעת מדד פעילות המחלה

הערה: מדד פעילות המחלה (DAI) חושב מדי יום על ידי הירידה במשקל הגוף של העכברים, דם סמוי בצואה וסמיכות הצואה.

1. מדוד את משקל הגוף של העכברים מדי יום. הקצה ציון של 0-4 לכל עכבר על סמך אחוז הירידה במשקל הגוף (0: 0%, 1: 1%-5%, 2: 6%-10%, 3: 11%-18% ו-4: >18%).
2. אסוף דגימות צואה טריות מכל עכבר. השתמש בצמר גפן כדי לעורר את התכווצות פי הטבעת כדי לקדם את עשיית הצרכים. לאחר מכן, אסוף את דגימות הצואה מיד לאחר עשיית הצרכים בצינור צנטריפוגה מעוקר.
3. קבע את הדם הסמוי בצואה על ידי נייר בדיקת דם סמוי בצואה. יש לאסוף 10 מ"ג של דגימת צואה על מקל אפליקטור.
4. הניחו את הדגימה על כרטיס הבדיקה ומרחו מריחה דקה על הכרטיס. פתח את הדש האחורי והחל מפתח על המריחה.
5. לאחר מכן, ציון לדם סמוי באמצעות נייר בדיקת דם סמוי בצואה תוך 120 שניות.
   הערה: כל זכר של כחול על או בקצה המריחה חיובי לדם סמוי. ציוני הנסתר בצואה היו כדלקמן: 0: אין, 1: המוקולט חיובי, 2: קל, 3: עקבות דם בצואה ו-4: דימום גס.
6. זהה את עקביות הצואה על ידי זיהוי דגימת הצואה¹¹. הקצה ציון של 0-4 (0: רגיל, 1: צואה רכה, 2: צואה חצי מעוצבת, 3: צואה נוזלית ו-4: שלשול).

7. איסוף רקמות

1. להרדים את העכברים על ידי הזרקת 10% כלורל הידרט (10 מ"ג/ק"ג) בתום השלב הראשון והשני של הניסוי. העריכו את עומק ההרדמה בעכברים על ידי רפלקס נסיגת הצביטה.
2. לאחר מכן, המתת חסד של העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם.
3. תקן את העכברים שוכב על שולחן הניתוחים, ופתח את חלל הצפק.
4. הפרד את כל המעי הגס בניתוח ומדוד את האורך בעזרת סרגל.
5. לאחר מכן, שטפו בעדינות את המעי הגס עם מזרק של 5 מ"ל מלא ב-PBS מקורר מראש.

8. הערכת נזק היסטולוגי

1. חותכים את רקמת המעי הגס לשברים קטנים, מקבעים אותם ב-4% פרפורמלדהיד ומטמיעים אותם בפרפין באמצעות מכונת הטמעת רקמות.
2. לאחר מכן, חתכו את הרקמות המוטבעות בפרפין עם מיקרוטום להכנת קטעי רקמת המעי הגס בעובי 4 מיקרומטר. מסירים שעווה ומייבשים את חלקי המעי הגס. לאחר מכן, צבעו את חלקי המעי הגס בהמטוקסילין ואאוזין (H&E).
   הערה: דגימות המעי הגס המוכתמות מוערכות על ידי החוקר באמצעות מערכת למדדים הבאים: דרגת חדירת תאים דלקתיים (אין: 0, קל: 1, בינוני: 2, חמור: 3), נזק לרירית (אין: 0, שכבה רירית: 1, תת-רירית: 2, שרירים וסרוזה: 3), נזק לקריפטה (אין: 0, 1/3: 1, 2/3: 2, שלם: 3, שלם + אובדן אפיתל: 4), טווח הנגעים (%) (0%: 0, 1%-25%: 1, 26%-50%: 2, 51%-75%: 3, 76%-100%: 4). ציון הנזק ההיסטולוגי הכולל מחושב עבור כל ציון בודד של המדדים לעיל⁵.
3. תנו לשני נסיינים עצמאיים להעריך (עיוורו) את הציונים ההיסטולוגיים של הדגימה תחת מיקרוסקופ אור.

תוצאות

תוספי ב. צראוס וקוליטיס
מודל הקוליטיס הניסיוני החריף הושרה על ידי התערבות DSS במי שתייה. איור 1A מראה את הפרוטוקול הניסיוני למתן B. cereus למודל העכבר של קוליטיס. השראת DSS כמובן הפחיתה את משקל הגוף (איור 1B) ואת אורך המעי הגס. ה?...

Discussion

על מנת להשתמש בפרוביוטיקה במחקרים קליניים, יש צורך להעריך את היעילות והבטיחות של פרוביוטיקה במודלים של בעלי חיים. הפרוטוקולים שסופקו עברו אופטימיזציה בעבר להערכת חומרת הקוליטיס. עכברים שטופלו ב-DSS הם מודל לדלקת מעיים, המחקה את המאפיינים הקליניים וההיסטולוגיים האופייני...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M PBS (powder, pH7.2–7.4)	Solarbio	P1010-2L
Absolute ethyl alcohol	Hushi	64-17-5
Acid alcohol fsat differentiation solution	Beyotime	No.C0163S
Agar	Sangon Biotech	9002-18-0
Ampicillin	Solarbio	69-53-4	Store at 2–8 °C
Anaerobic incubator	Long Yue	LA1-3T
Dextran sulfate sodium salt colitis grade	MP Biomedicals	160110
Electrothermal incubator	SANFA	HP-050A
General purpose tissue fixator	biosharp	BL539A
Glycerinum	Hushi	56-81-5
Hematoxylin and eosin staining kit	Beyotime	No.C0105
Kisser's Mounting Medium	Beyotime	No.C0181
Metronidazole	Solarbio	443-48-1	Store at 2–8 °C
Neomyein sulfate	Solarbio	1405-10-3	Store at 2–8 °C
Oscillating incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180S
Sodium chloride	Sangon Biotech	7647-14-5
Stool occult blood test paper	Baso	BA2020B
Tryptone	OXOID	2285856
Vancomycin	Solarbio	1404-93-9	Store at 2–8 °C
Xylene	Hushi	1330-20-7
Yeast extract	Sangon Biotech	8013-01-2