הדמיה כימית מולטיפלקס מבוססת על מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה בפס רחב

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לרכישת תמונות כימיות עם מיקרוסקופיית פיזור ראמאן (SRS) בפס רחב. בהתבסס על מיקרוסקופ SRS הפועל עם זיהוי דיפרנציאלי רב-ערוצי-נעילה, הפרוטוקול מתאר את הכנת הדגימה, התאמת מנגנון ה-SRS והכימומטריקה כדי לנטרל מרכיבים שונים של דגימות הטרוגניות מבחינה כימית.

Abstract

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכניקה אופטית לא ליניארית להדמיה כימית ללא תוויות. כלי אנליטי זה מספק מפות כימיות במהירות גבוהה, וברזולוציה מרחבית גבוהה של דגימות דקות על ידי חקירה ישירה של התנודות המולקולריות שלהן. ביישום הסטנדרטי שלה, מיקרוסקופיית SRS היא פס צר ויוצרת תמונות עם תדר רטט יחיד בלבד בכל פעם. עם זאת, גישה זו לא רק מעכבת את הספציפיות הכימית של SRS, אלא גם מזניחה את עושר המידע המקודד בספקטרום רטט.

ניתן להתגבר על מגבלות אלה על ידי SRS בפס רחב, יישום המסוגל לחלץ ספקטרום רטט לכל פיקסל של התמונה במקביל. זה מספק נתונים היפרספקטרליים, שכאשר הם משולבים עם ניתוח כימומטרי, ממקסמים את כמות המידע שנשלף מהדגימה. לפיכך, פס רחב SRS משפר את הספציפיות הכימית של המערכת, ומאפשר את הקביעה הכמותית של ריכוז המרכיבים השונים של דגימה. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול להדמיה כימית עם מיקרוסקופ SRS בפס רחב, המבוסס על מיקרוסקופ SRS שנבנה בבית ופועל עם זיהוי מגבר נעילה רב-ערוצי דיפרנציאלי מותאם אישית. הוא דן בהכנת המדגם, יישור מנגנון SRS וניתוח כימומטרי. על ידי רכישת ספקטרום ראמאן רטטי, הפרוטוקול ממחיש כיצד לזהות מינים כימיים שונים בתוך תערובת, ולקבוע את הריכוזים היחסיים שלהם.

Introduction

מיקרוסקופיית ראמאן היא טכניקת הדמיה רבת עוצמה המספקת מפות כימיות עשירות על ידי מדידת פיזור ראמאן¹, תהליך רדיאטיבי לא אלסטי שמקורו במולקולות הרוטטות בתגובה לאור^{תקרית 2,3}. כל פיקסל של מפת ראמאן מכיל ספקטרום הנושא מידע ישיר על ההרכב הכימי והמבנה של הדגימה, וכתוצאה מכך תמונות עם ניגודיות רטט פנימית. נכון להיום, מיקרוסקופיית ראמאן היא נקודת הייחוס למחקרי מיקרוספקטרוסקופיה של תנודות מולקולריות, שכן אף טכניקת הדמיה אחרת אינה יכולה לייצר תמונות בעלות ספציפיות כימית גבוהה ורזולוציה מרחבית גבוהה⁴. למרות הספציפיות הכימית יוצאת הדופן שלו, יעילות הייצור של פיזור ראמאן נמוכה, מה שמחייב זמני השהייה ארוכים יותר של פיקסלים או עירור בהספק גבוה, מה שמוביל, בהתאמה, לשיעורי רכישה נמוכים ולאי-תאימות עם דגימות רגישות.

מחסור יחיד זה במיקרוסקופיית ראמאן הוביל חוקרים ליישם פיזור רמאן קוהרנטי^של 5,6,7,8,9 כמקור ניגודיות למיקרוסקופיה. זהו תהליך אופטי לא ליניארי המגביר את התגובה הוויברציונית בכמה (עד שבעה) סדרי גודל, ובכך מאפשר הדמיה כימית במהירות גבוהה 10,11,12,13. בפרט, שתי טכניקות פיזור הראמן הקוהרנטיות הנפוצות ביותר הן פיזור רמאן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS)¹⁴ ופיזור ראמאן מגורה (SRS)¹⁵. בניגוד ל-CARS, SRS מראה תלות ליניארית בריכוז של מולקולות תהודה. הוא חסין מפני הרקע הלא-רסוננטי, אפקט לא ליניארי שאינו קשור לשום מעבר רטטי אך מעוות לצורות הלורנציאניות האופייניות לספקטרום ראמאן של התנודות המולקולריות^16,17. לפיכך, מיקרוסקופיית SRS מניבה מידע ראמאן אותנטי המאפשר ניתוח תמונה כמותי ישיר.

SRS הוא תהליך אופטי מסדר שלישי, לא ליניארי, המספק מידע ישיר על הקשרים הכימיים של דגימה. מקורו בסופרפוזיציה הספטיוטמפוראלית של שני שדות אופטיים בדרך כלל באזור הספקטרלי הקרוב-אינפרה-אדום, כלומר המשאבה והסטוקס בתדר ω_pu ו-ω_S, בהתאמה 10,11,18. סופרפוזיציה זו יוצרת מכות בתדר המשאבה-סטוקס תוך ניתוק כוונון Ω = ω_{pu-ω S}. כאשר Ω תואם רטט מולקולרי Ω_R, המולקולה מהדהדת, וגורמת להעברת אנרגיה קוהרנטית בין שדות האור למולקולה. כתוצאה מכך, המולקולה מגיעה למצב של התרגשות רטט. ניתן לנטר תהליך זה על ידי מדידת השמדתם של פוטוני משאבה (אות המכונה אובדן ראמאן מגורה [SRL]) או הגברה מקבילה של פוטונים של סטוקס (תהליך המכונה רווח ראמאן מגורה [SRG]). SRG ו-SRL הם אותות קטנים (ΔI) שיושבים על גבי רקע אינטנסיבי ותנודתי (I). מכיוון שערכים טיפוסיים של אות ה-SRS (ΔI/I) נמצאים בטווח של ^10-6-10-4, רעש הלייזר יכול בקלות לטשטש אותו. כדי למתן את ההשפעות המזיקות של רעש הלייזר על יחס האות לרעש (SNR) וכתוצאה מכך על מהירות ההדמיה, זיהוי SRS מסתמך על טכניקות העברת אפנון (למשל, מגברי נעילה, מעגלי תהודה או ממוצעים של מכוניות תיבה) בתדרי אפנון גבוהים (>1 מגה-הרץ), כאשר רעש הלייזר מגיע לערכיו המינימליים 15,19,20.

מיקרוסקופיית SRS קונבנציונלית משתמשת במשאבת פס צר (≈10 ס"מ⁻¹) ובפולסים של סטוקס כדי להפיק תמונות כימיות בתדר רטט יחיד, ומאפשרת הדמיה בקצב וידאו עם זמני השהיית פיקסלים נמוכים עד ≈100 ns^21,22. עם זאת, מכיוון שמיקרוסקופיית SRS בפס צר יוצרת מפות כימיות על ידי סריקה רציפה של הדגימה בתדרי רטט בודדים בלבד, המידע שלה מוגבל^ל-23. תמונות SRS עם ניגוד רטט אחד או שניים עשויות שלא להספיק כדי להבדיל בין מינים כימיים לבין רצועות ראמאן חופפות, במיוחד בתוך מערכות הטרוגניות. לכן, מיקרוסקופ SRS הצר הפרדיגמטי אינו מנצל את מלוא הפוטנציאל של SRS, מכיוון שחקירת קומץ תדרי רטט מעכבת את הספציפיות הכימית שלו ומזניחה את עושר המידע המקודד בספקטרום רטט. יתר על כן, סריקה רציפה של הדגימה בתדרים שונים גורמת לזמני השהייה ארוכים יותר של פיקסלים שיכולים להפעיל את ה-photodamage ולמנוע תזוזה מרחבית קפדנית בין תמונות עוקבות, מה שמוביל לממצאי תנועה.

בניגוד למקבילה שלה בפס צר, מיקרוסקופיית SRS בפס רחב מאחזרת ספקטרום רטט לפיקסל בכל סריקת דגימה 10,12,24. לפיכך, SRS בפס רחב מספק הדמיה היפרספקטרלית עם ליבה מרחבית קפדנית של ניגודים רטטיים שונים, ומאפשר ניתוח נתונים קפדני. זה לא רק חושף את המרכיבים הכימיים של הדגימה באמצעות ספקטרום ראמאן, אלא גם עוזר לקבוע את הריכוזים היחסיים שלהם. בהתאם לאופן שבו הספקטרום נרכש, מיקרוסקופיית SRS בפס רחב מסווגת כ- SRS היפרספקטרלי או מולטיפלקס SRS. ב-SRS היפרספקטרלי, ספקטרום ה-SRS לכל נקודה סרוקה של הדגימה נרכש ברצף (כלומר, הוא מוחזר על ידי טאטוא כוונון התדרים Ω), ובונה ספקטרום SRS על ידי ערימה של אותות ה-SRS בהזזות ראמאן עוקבות. ספקטרום הראמן נמדד בו זמנית במספר מצבי רטט במולטיפלקס SRS. לפיכך, גישת המולטיפלקס SRS משלבת פולס פס צר מאופנן עם פולס פס רחב כדי להניע את אות ה-SRS בתדרים שונים, ומשתמשת בגלאי רב-ערוצי עם רגישות דומה לזו של SRS בפס צר כדי לזהות את ספקטרום ה-SRS.

מאמר זה מציג פרוטוקול להפקת מפות כימיות של דגימות הטרוגניות באמצעות מיקרוסקופיית SRS מולטיפלקס. סכימה של מיקרוסקופ SRS המשמשת בפרוטוקול זה מתוארת באיור 1 ומתוארת בפירוט במקום אחר 25,26,27. בקצרה, לייזר סיבי Yb נעול במצב מסחרי, המפיק פולסים של 140 fs שבמרכזם 1040 ננומטר, עם הספק ממוצע של 10 ואט וקצב חזרות של 80 מגה-הרץ, מניע את מיקרוסקופ ה-SRS בפס רחב. מפצל קרן מקטב (PBS) מפריד את הקורה הבסיסית לשני ענפים. כדי לייצר את הפולסים של סטוקס בפס הצר, ענף אחד עם 4 W של הקרן הבסיסית נשלח לאטאלון שמייצר קרן פס צר (≈15 ס"^מ-1), אשר מווסתת לאחר מכן ב-1.6 מגה-הרץ עם אפנן אופטי אקוסטי (AOM). החלק הנותר עם 6 W של הקרן הבסיסית מוכפל בתדר עם גביש ליתיום טריבוראט (LBO) בעובי 2.8 מ"מ, שנחתך להתאמת פאזה מסוג I (θ = 90°, φ = 13.8°). הדור ההרמוני השני שנוצר ב-520 ננומטר עובר לחלל מקופל X כדי לשאוב מתנד פרמטרי אופטי (OPO), התקן המשתמש בגביש LBO בעובי 3.0 מ"מ (התאמת פאזה מסוג I, θ = 90°, φ = 9.8°) כמדיום פעיל כדי לספק קרינה אופטית בפס רחב הניתנת לכוונון בתוך האזור הספקטרלי של 680-910 ננומטר (איור 2). פולסים אלה בפס רחב משמשים כמשאבה בניסויי SRS ומתפשטים למדחס מנסרה כדי לפצות מראש על השפעות הפיזור המושרות על ידי מטרת המיקרוסקופ.

לאחר שלב הדחיסה, לוחית גל λ/2, בשילוב עם לוחית דו-פרצופית YVO₄ , מייצרת שני העתקים מקוטבים אורתוגונליים שהחיסור האלקטרוני שלהם במישור הגילוי מבטל את הרעש של משאבת הפס הרחב. מראה דיכרואית משלבת את המשאבה ואת קורות סטוקס ושולחת אותן למיקרוסקופ זקוף. מטרת טבילה במים עם מפתח צמצם מספרי (NA) של 1.27 ממקדת את האור על הדגימה, בעוד שמטרת טבילת שמן עם NA של 1.4 אוספת אותה. לפני שלב הגילוי, מסנן מעבר קצר (SPF) מסיר את הסטוקסים המאופננים, בעוד שסורג עקיפה הפועל בתצורת ליטרו מפזר את משאבת הפס הרחב המועברת. PBS₂ שני מפריד בין העתקי המשאבה, ועדשה ממקדת אותם בשני מערכי פוטודיודה. האותות ממערכי פוטודיודה אלה מופחתים באופן אלקטרוני ונשלחים למגבר נעילה רב-ערוצי (M-LIA) שנבנה בבית. האות המופחת מנורמל לאחר מכן על ידי קריאות הזרם הישיר (DC) של אחד ממערכי הפוטודיודה, ובכך מייצר את ספקטרום ה-SRL.

כניסוי למופת, אנו מדמיינים תערובות של כמה מפזרי רמאן ידועים, שלכל אחד מהם ספקטרום רמאן ייחודי. לפיכך, הפרוטוקול מתחיל בתיאור כיצד להכין את דגימות הייחוס. כאשר אנו מזהים SRL, אנו ממשיכים להסביר כיצד להשיג פולסים של סטוקס בפס צר ולהגדיר את המקור האופטי המספק את פולסים של משאבת הפס הרחב (≈250 ס"^מ-1), כלומר, OPO שנבנה בבית. הפרוטוקול מציג את היישור והאופטימיזציה של האלומות האופטיות, ומתאר פרמטרים קריטיים כגון העוצמה והספקטרום של סטוקס בפס הצר ומשאבת הפס הרחב. הפרוטוקול מתאר בפירוט את הנתיב האופטי של משאבת הפס הרחב מכיוון שהוא דורש אלמנטים אופטיים מיוחדים. זה גם מסביר כיצד למצוא את החפיפה המרחבית-טמפורלית בין פולסים של משאבה-סטוקס ומראה דרך מעשית לקבוע את רעש העוצמה היחסית (RIN), אשר בתורו עוזר להגדיר את תדירות המודולציה הטובה ביותר עבור ניסויי SRS. לאחר מכן, אנו מסבירים את עקרון העבודה והכיול של שרשרת האיתור. לבסוף, הפרוטוקול מציג את תהליך איסוף הנתונים, הכימומטריה וצינור עיבוד התמונה.

Protocol

1. הכנה לדוגמה

הערה: פרוטוקול זה מתאר את אחזור מפות הריכוזים ואת ספקטרום SRS האופייני של תערובות הטרוגניות מבחינה כימית.

1. כדי להכין את הדגימה, יש לחלץ 2 μL מתרחיף מימי של מיקרובים מפולימתיל מתקרילט (PMMA) (ראו טבלת החומרים) ולשפוך את השבר של 2 μL על מכסה מיקרוסקופ.
   1. בעזרת קצה פיפטה נקי, יש לחלץ 2 μL מתרחיף מימי של חיידקי פוליסטירן (PS) ולשלב אותו עם תרחיף ה-PMMA על הכיסוי. בעזרת קצה פיפטה, ערבבו בעדינות את המתלים ותנו לו להתייבש במשך 24 שעות.
      הערה: חשוב להתאים בזהירות את הריכוז של תרחיפי המיקרובדה כדי למנוע כמויות לא פרופורציונליות של המיקרובים על פני השטח של הדגימה. הקוטר של חרוזי PS ו- PMMA הוא 10 ו - 6 מיקרומטר, בהתאמה. ממדים אלה מאפשרים להדגים את הרזולוציה המרחבית הגבוהה של המיקרוסקופ מבלי להתפשר על יעילות הדור של SRS.
2. על גבי השכבה הלבנה והשטוחה של חרוזים שיופיעו כאשר המים יתייבשו, הוסיפו 20 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ולאחר מכן 20 μL של שמן זית טהור.
3. יש למרוח לק על קצוות של כיסוי מיקרוסקופ שני. מניחים את הכיסוי על התערובת, כאשר הלק פונה כלפי מטה, ומפעילים מספיק לחץ כדי לאטום אותו. תנו לו להתייבש.
   הערה: איור 3 מציג תוצאות מופתיות שהתקבלו בשלבים אלה. אם אטום כראוי, דגימה זו צריכה להימשך עד שלושה חודשים.

2. אופטימיזציה של משאבות וקורות סטוקס

1. הפעילו את הלייזר ותנו לו להגיע לשיווי משקל תרמי. החל פיזור השהיה קבוצתי שלילי (GDD) של GDD = -6,000 fs² על הקרן הבסיסית.
   הערה: ערך GDD זה הוא קריטי להנעה מוצלחת של ה- OPO והוא אופטימלי עבור הגדרה זו, אך סביר להניח שישתנה במערכות שונות. ניתן להציג GDD שלילי באמצעות זוגות סורגים, מדחסי מנסרה או מעצבי פולסים המבוססים על מודולטורים של אור מרחבי²⁸.
2. לפצל את הלייזר היסודי עם קרן מקטבת (PBS₁) לשני ענפים. כדי לקבל את הפולסים של סטוקס בפס הצר, הדריך ענף אחד עם 4 W לאטלון. סובבו מעט את האטאלון עד שמתקבל קו ספקטרלי צר ומרוכז בשיא ספקטרום הפולסים (ראו את העקומה האדומה באיור 2).
   הערה: לאטלון זה יש עדינות אפקטיבית של 29 וטווח ספקטרלי חופשי של 29.8 ננומטר ב-1,040 ננומטר.
3. כדי להשיג פולסים מאופננים של סטוקס, שלחו את קרן הפס הצר לאפנון אופטי acousto.
   הערה: כפי שמוצג באיור 4A, הקרן המפוזרת מסדר ראשון חווה אפנון של 100%, בעוד שהקרן מסדר האפס רק 50%. לכן, עדיף להשתמש בסדר ראשון כדי להימנע מהארת הדגימה עם קרן חזקה ללא שינוי שעלולה לגרום לפוטו-דמה של דגימה מבלי לייצר שום אות SRS.
   1. כדי למטב את יעילות האפנון, שנו את המרחק בין העדשות f₁ ו-f₂ (איור 4B). מדוד את הקרן המאופננת באמצעות פוטודיודה ותעד את הפרופיל שלה באמצעות אוסצילוסקופ.
   2. שנה את המרחק בין f₁ ל- f₂ עד שתושג ניגודיות מרבית בין המשרעת לבין קו הבסיס של קריאות האוסצילוסקופ.
      הערה: זוג עדשות זה אינו פועל כקולימטור, אלא יוצר נקודת מוקד יעילה בגביש של ה-AOM.
   3. הצב עדשה שלישית f₃ כדי לכוונן את המותניים של קרן סטוקס, ולאפשר לשנות את נפח האינטראקציה במישור המוקד של המיקרוסקופ, וכתוצאה מכך, לייעל את אות ה- SRS.
      הערה: קרן סטוקס הייתה מווסתת ב-1.6 מגה-הרץ בפרוטוקול זה.
4. מקד את 6 ה- W הנותרים של ההספק האופטי של הקרן הבסיסית על גביש ליתיום טריבוראט (LBO_1, θ = 90°, φ = 13.8°) כדי להכפיל את התדר של הקרן הבסיסית באמצעות דור הרמוני שני (SHG) (איור 5A).
   1. כדי למקסם את יעילות ה-SHG, סובבו מעט את הגביש, תוך שינוי זווית φ (איור 5B). מטב את LBO₁ כדי לקבל לפחות 2.5 W של SHG.
5. התאם את זווית φ של LBO₂ כדי למקסם את יעילות הייצור של קרן האות.
   הערה: אורכי המוקד של העדשות f₁, f₂ ו- f₃ נבחרו בקפידה כדי להתאים את קרן SHG לחלל OPO. לפיכך, אורכי המוקד של עדשות אלה ישתנו בתצורות שונות. בגלל הפיזור השיורי בחלל OPO, שינוי קל באורך החלל גורם להסטה של הספקטרום של קרן האות.
   1. התאימו את אורך החלל כדי לקבל ספקטרום משאבה שיחד עם הפס הצר סטוקס ב-1,040 ננומטר, יכולים לייצר כוונון תדרים בטווח של 1,373-5,090 ס"^מ-1. טווח זה מכסה את התנודות באזור הספקטרלי המתוח CH (2,800-3,050 ס"^מ-1). ראו את הספקטרום הכחול באיור 2.
6. כדי לפצות על השפעות הפיזור המושרות על ידי מטרת מיקרוסקופ העירור, שלח את משאבת הפס הרחב למדחס מנסרה. הזן את המשאבה לתוך מנסרה A דרך הפסגה שלה והנחה את המשאבה המפוזרת לעבר פסגת המנסרה B. הגדר את כמות הפיזור השלילי הדרושה, ולאחר מכן קבע את המרחק בין האפיקים של המנסרות L בהתאם.
   הערה: איור 6 מראה את הסידור של המנסרות²⁹. במקרה זה, הפיצוי נקבע עבור GDD ≈ -12,800 fs²; ומכאן L = 1.26 מ '.
   1. השתמש במנסרות חתוכות של ברוסטר.
      1. ודא שהקיטוב של קרן המשאבה נמצא בתוך המישורים המשולשים של המנסרות (פרצופים לא מלוטשים מלמעלה/תחתונים).
      2. ודא שזווית ההיארעות θ_בקרן המשאבה תואמת את זווית הברוסטר.
      3. ודא שפני היציאה של מנסרה א' מקבילים לפני הכניסה של מנסרה ב'.
   2. כדי להעריך את ה-GDD של פולס הפס הרחב שיש לפצות עליו, מדוד את אות ה-SRS באורך גל יחיד λ_{1, ורשם} את השהיית הזמן τ₁ בין המשאבה-סטוקס שבה מתקבל ה-SRS(λ₁) המרבי. חזור על הליך זה עבור אורך גל שני λ_{2, ורשם} שוב את עיכוב הזמן τ₂ שבו ה- SRS(λ₂) היה מקסימלי.
      הערה: מכיוון שה-GDD מוגדר כנגזרת של השהיית הקבוצה ביחס לתדר הזוויתי, המדידות הנ"ל מאפשרות הערכה של ה-GDD של קרן הפס הרחב (Eq [1]).
      (1)
7. באמצעות לוחית גל λ/2, הגדר את הקיטוב של קרן המשאבה ל-45°. הנחה את המשאבה המקוטבת לצלחת YVO₄ באורך של 13.3 מ"מ, וקבע את הציר המהיר של אנכי גביש דו-פרצופי זה.
   הערה: בעת נסיעה דרך לוחית YVO₄ , פולסים של המשאבה יפוצלו לשני העתקים מקוטבים אורתוגונליים המתפשטים באופן קולינארי אך שומרים על השהיה Δt ≈ 10 ps ביניהם. עיכוב זה הוא פונקציה של העובי ושל מדדי השבירה של הגביש הדו-פרצופי. מכאן ואילך, המשאבה משתכפלת עם אותו מצב קיטוב של פולסים של סטוקס תיקרא "אות" ואילו אלה עם מצב אורתוגונלי כ"ייחוס ". הפרטים של טכניקה זו, הנקראת זיהוי מאוזן מוטבע, תוארו בעבר³⁰.
8. שלבו את המשאבה ואת קורות סטוקס עם מראה דיכרואית ויישרו אותן בזהירות באמצעות זוג חורי פינים פלואורסצנטיים, מה שמבטיח ששניהם יתפשטו באופן קולינארי. החלישו את האלומות והשתמשו בעדשה כדי למקד אותן בפוטודיודה מהירה (לפחות 100 מגה-הרץ).
   1. חסום את המשאבה ומדוד פולסים בודדים של סטוקס באמצעות אוסצילוסקופ דיגיטלי ברוחב פס גבוה. השתמש באות ההדק של הלייזר כמקור השעון למדידות של האוסצילוסקופ. קבע את הערך הממוצע שבו מתח הפוטודיודה מגיע למקסימום שלו.
   2. חסום את קרן סטוקס וחזור על הליך זה עבור פולסים של המשאבה. הגדל או הקטן את הנתיב האופטי של קרן המשאבה (סטוקס) עד שהפולסים שלה יגיעו בערך באותו זמן כמו פולסים של סטוקס (משאבה).
      הערה: זה אמור להבטיח דיוק של כמה מילימטרים לכל היותר בהתאמת הפרש הנתיב האופטי בין שתי הזרועות.
   3. הסר את הפוטודיודה והנח גביש לא ליניארי עם זווית חיתוך מתאימה ליצירת תדר סכום (SFG) בין פוטונים משאבה-סטוקס.
      הערה: הגביש הלא ליניארי המשמש כאן נחתך להתאמת פאזה מסוג I, θ = 90°, φ = 9.8°. הציר האופטי של הגביש הלא ליניארי צריך להיות מקביל לקיטוב של הסטוקס ולפולסים האותות.
   4. הפוך את קורות המשאבה/סטוקס למעט לא קולינאריות והזז את קו ההשהיה עד ה-SFG, אות שבשל התאמת פאזה נמצא בין ה-SHGs של המשאבה לבין אלומות סטוקס. אם האות לא נמצא, ודא את החפיפה המרחבית של שתי האלומות על הגביש.
      הערה: ה- SFG הוא בעל תזוזה כחולה ואמור להיות גלוי בקלות לעין בלתי.
   5. במקרה של קשיים בלתי צפויים, הניחו מסנן מעבר נמוך כדי להסיר את המשאבה ואת סטוקס ואת ה-SHGs המתאימים להם ולמדוד את ה-SFG באמצעות ספקטרומטר (איור 7A). מצא את השהיית הזמן שבה ה-SFG מגיע לעוצמה המרבית שלו, ערך שקובע את החפיפה המרחבית-טמפורלית האידיאלית הנדרשת ליצירת אותות לא ליניאריים, ותקן את קו ההשהיה שם (איור 7B).
9. מדוד את פרופילי הקרן באמצעות מצלמה מכוילת. לחלופין, השתמש בכרטיס אינפרא אדום והערך את הקטרים לפי עיניים. השתמש בשני טלסקופים, אחד עבור המשאבה ואחד עבור קרן סטוקס. באמצעות טלסקופים אלה, נסו להתאים את קוטרי הקרן לפתח האחורי של מטרת העירור.
   הערה: הליך זה יבטיח את הרזולוציה המרחבית המרבית של ההתקנה.
   1. לאחר קבלת אות ה-SRS, השתמשו בטלסקופ שעל קרן המשאבה כדי לשנות את קוטרו, תוך שינוי טווח הריילי שלו, וכתוצאה מכך, נפח האינטראקציה במוקד המיקרוסקופ. עצור כאשר ה- SRS המרבי מושג.
10. השתמש בפוטודיודה כדי למדוד את עוצמת קרן המשאבה (סטוקס) ועם תגובתיות הפוטודיודה, חשב את ההספק הממוצע הפוגע בשטח הפעיל של הגלאי.
    1. אם אתה משתמש בפוטודיודה ברוחב פס גבוה, חבר מסנן אלקטרוני עם מעבר נמוך כדי לקבל רק את הקבוע או את רכיב DC. כדי למדוד δP(f), חבר את הפלט של פוטודיודה ברוחב פס גבוה (נתק את מסנן המעבר הנמוך) לקלט של מגבר נעילה. אחסן את פלט הנעילה בתדרי הדגמה שונים, והשתמש באחריות של הפוטודיודה כדי להמיר מ-V ל-W.
       הערה: למגברי נעילה מסחריים יש כלים מובנים למדידת δP(f) (לדוגמה, מכשירי ציריך המשולבים ב- LabOne a Frequency Sweeper³¹).
    2. לאחר מדידת ה-RIN של האלומות, כבו את הלייזר ומדדו את הרעש האלקטרוני (כלומר, ה-RIN חישב ללא כל אור על גלאים).
       הערה: בהנחה שה-RIN מוגבל על ידי תנודות הלייזר ולא על ידי רעש הזריקה, מדידה כהה זו תסייע לאבחן את המכשור המשמש למדידות; אם הרעש האלקטרוני גבוה כמו ה- RIN של הלייזר, לא ניתן להשתמש בו כדי למדוד את ה- RIN של הלייזר; ייתכן שיהיה צורך להשתמש במגברי רעש אולטרה-נמוכים כדי להפחית את הרעש האלקטרוני.
    3. אם ה-RIN מוגבל על ידי רעש הזריקה ולא על ידי תנודות הלייזר, הבהירו יותר כוח אופטי על הגלאי. ראו איור 8.

3. הגדרת הזיהוי הספקטרלי להדמיית SRS

1. הנח את המשאבה ואת קרני סטוקס למיקרוסקופ.
2. מקם את הדגימה הנדונה בסעיף 1, ומצא אזור ללא חרוזים כדי לסייע ביישור קרן המשאבה. באמצעות מצלמה, מדוד את הפרופיל המשתקף של קרן סטוקס (משאבה) תוך חסימת המשאבה (סטוקס). התאימו את מיקומי כתמי הלייזר עם המראות ממש לפני המיקרוסקופ.
   הערה: כדי לקבל את דור ה- SRS הגבוה ביותר, הם צריכים לחפוף באופן מושלם. איור 9 מראה (A) את המשאבה, (B) סטוקס ו-(C) את שתי הקורות חופפות באופן מושלם במישור המוקד של המיקרוסקופ.
3. הפוך את עירור ואיסוף מטרות קונפוקליות.
   הערה: השימוש במטרות מתוקנות אינסוף פירושו שמיקוד המשאבה במישור הדגימה יגרום לקרן מתנגשת בפתח האחורי של מטרת האיסוף.
   1. שים מסנן מעבר קצר כדי להסיר את הסטוקסים המאופננים ולהנחות את קרן המשאבה לסורג. הניחו עדשה לאחר הסורג כדי למקד את הקרן המפוזרת על הגלאים.
      הערה: משוואת הסורגים תסייע לקבוע את הפיזור הליניארי (כלומר, כמה ננומטר למ"מ במישור הגלאי עם עדשה באורך מוקד נתון f³²). משוואת הסורגים מתייחסת למחזוריות החריץ d של הסורג, זווית ההיארעות α, זווית הדיפרקציה β, אורך הגל המפוזר λ וסדר עקיפה m (Eq [2]).
      (2)
4. לצורך זיהוי מאוזן, מדוד את ספקטרום הייחוס ואת העתקי האות המתפשטים לאורך קרן המשאבה.
   הערה: הפרופיל המרחבי של קרן המשאבה לאחר הסורג הוא קו המורכב מהרכיבים הספקטרליים השונים של משאבת הפס הרחב לאורכו. כל רכיב ספקטרלי של קו המשאבה יתמקד במרחק f על ידי עדשה כדורית (ראו שלבים 3.1-3.2).
   1. כדי להימנע מחיתוך המשאבה המפוזרת, הניחו את העדשה הכדורית קרוב ככל האפשר לסורג. שים PBS מיד אחרי העדשה הכדורית כדי להפריד את העתקי המשאבה.
      הערה: כאן נעשה שימוש במפצל קרן קובייה מקטב מכיוון שסוג זה של מקטב אינו מערבל את הקיטוב של קרן המשאבה. הוא גם מפריד ביעילות בין העתקי המשאבה השונים ויכול להיות גדול מספיק כדי להימנע מחיתוך משאבת הפס הרחב. ה-PBS ישקף את העתק האות (מקוטב s) וישדר את העתק הייחוס (מקוטב p).
   2. בעזרת זוג מראות היגוי, הנחיו את האות והתייחסו לגלאים המתאימים להן (איור 1).
      הערה: בתצורה המאוזנת האידיאלית, העתקי האותות והייחוס צריכים להיות בעלי אותה עוצמה אופטית.
   3. כדי להסיר את הרעש בקרן המשאבה, תאם את הערוצים של מערך הפוטודיודה המודד את האות עם עמיתיהם בגלאי הייחוס. לפיכך, ודא שהפוטודיודה n^th של מערכי הפוטודיודה של האות והייחוס מודדים את העוצמה האופטית של אותו רכיב ספקטרלי של העתקי האות והייחוס.
      הערה: איור 8 מראה ספקטרום RIN למופת.
5. כדי להבטיח את ההתאמה הספקטרלית בין שני מערכי הפוטודיודה, הניחו חריץ קטן או קשתית בין הסורג ל-PBS כדי לסנן באופן מרחבי את המשאבה המפוזרת. צמצם את כל הרכיבים הספקטרליים מלבד אחד של המשאבה כדי למרכז את הקרניים המועברות בגלאי n^th של מערכי הפוטודיודה הייחוס והאותות. השתמש במראות ההיגוי שהוזכרו כדי להתאים את המתאם של ערוצי הזיהוי השונים.
6. בשלב זה, התחל מיקרוסקופיית SRS. כדי לעשות זאת, לווסת את הסטוקס, לסרוק את הדגימה באופן רסטר ולרכוש את העברת המודולציה על ספקטרום המשאבה (ΔI) עם ספקטרום DC (I) המתאים לו כדי לקבל את ספקטרום ה-SRS המנורמל (ΔI/I) מכל פיקסל. הפק מטריצות תלת-ממדיות שהשורות (x) והעמודות שלהן (y) מכילות את המיקומים הסרוקים של המדגם. על כל וקטור (z) אורתוגונלי למישור x-y, אחסן ספקטרום SRS.
   הערה: איור 12 מציג את המבנה של נתונים היפרספקטרליים של SRS.
   1. הגדר את ההספק של קרן סטוקס ל-65 mW ואת זה של קרן משאבת הפס הרחב ל-20 mW. קבעו זמן אינטגרציה אידיאלי לניסויים.
      הערה: כאן, זמן האינטגרציה היה 44 μs; עם זאת, זמן השהייה של הפיקסל היה 1 אלפיות השנייה בגלל סורק piezo האיטי.

4. כימומטריקה של נתוני SRS היפרספקטרליים

1. השתמש בניתוח רזולוציה של עקומה רב-משתנית כדי לנטרל את המרכיבים הכימיים השונים של הדגימה. הורד את ממשק המשתמש הגרפי מהקישור בטאולר, דה חואן ו- Jaumot³³.
   הערה: כאן, תוכנית MATLAB של רזולוציה של עקומה רב-משתנית -ריבועים לפחות מתחלפים (MCR-ALS) שפותחה על ידי טאולר ועמיתים לעבודה שימשה^34,35. עבור יישומים של MCR-ALS לנתוני SRS, עיין ^{ב- 36,37}; לדיונים מפורטים על האלגוריתם, עיין ^{ב- 38}.
2. ב- MATLAB, עצבו מחדש את קוביית הנתונים ההיפר-ספקטרלית של SRS למטריצה D עם השורות שלה המכילות את ספקטרום ה-SRS. נניח שה-SRL hypercube D המתקפל הוא צירוף ליניארי של הריכוז C והפרופילים הספקטרליים S של המרכיבים הכימיים של הדגימה (כלומר, D = CS ^T + E, כאשר E היא מטריצה המכילה את השגיאה הניסיונית, והכתב העילי ^T מציין טרנספוזה של מטריצה).
3. קבל את המרכיבים העיקריים של הנתונים כדי להפריד בין C ו - S. כפי שידוע מראש כי הדגימה הנדונה בסעיף 1 מכילה ארבעה מינים, כלומר DMSO, שמן זית, PMMA ו- PS, מגדירים את התוכנית לחיפוש אחר ארבעה מינים ועוד אחד כדי להסביר את רעשי הרקע. אם יש דגימה אחרת עם מספר גבוה יותר או נמוך יותר של מינים, להגדיר את התוכנית בהתאם.
   הערה: התוכנית מבצעת פירוק בעל ערך יחיד של הנתונים הספקטרליים, ומשתמשת בהם כניחושים הראשוניים של הספקטרה S הטהורה.
   1. לחלופין, הזן את התוכנית במטריצה המכילה את העקבות הספקטרליים הידועים (למשל, ספקטרום הראמן הספונטני של החומרים).
      הערה: באמצעות האומדנים הראשוניים של הספקטרום הטהור, התוכנית תחשב C = DS(S^TS)⁻¹ ו - S^T = (C^TC)⁻¹C^TD. הערכים החדשים של C ו- S ממוטבים באמצעות אלגוריתם ריבועים לפחות מתחלפים.
4. מכיוון ש-SRS הוא אות לא שלילי, הגבילו את אלגוריתם הריבועים הפחות מתחלפים כדי לספק רק ערכים חיוביים.
   הערה: C ו- S הממוטבים יאפשרו בניית מטריצה חדשה D*= CS^T, ערכת נתונים שהתוכנית תשווה מול הנתונים המקוריים D. התוכנית חוזרת באופן אוטומטי על שלבים אלה עד שההפרש בין D* ל- D קטן מערך סף שרירותי שניתן להגדיר.
5. חלקה C ו - S לרכישת תמונות כימיות ואת הספקטרום האופייני של המרכיבים הכימיים של הדגימה.

תוצאות

איור 3 מציג תוצאות מופתיות שהתקבלו באמצעות פרוטוקול זה עם PS, PMMA ושמן זית. סיבוב זה של LBO₁ ישנה את מקדם השבירה שחווה שדה SHG, וישנה ישירות את מהירות הפאזה שלו. כאשר מהירות הפאזה של שדה SHG תואמת את זו של הקיטוב הלא ליניארי המושרה ב-LBO₁, השדה הלא-ליניארי שנוצר והקיטוב הלא-ליניארי יהיו בפאזה, מה שיוביל לקרינת SHG אינטנסיבית. במילים אחרות, שינוי זווית φ של LBO₁ יאפשר למשתמש להשיג את תנאי התאמת הפאזה האידיאלי עבור SHG. מכיוון שנעשה שימוש בגביש תואם פאזה מסוג I כאן, הקיטוב של קרן SHG יהיה אורתוגונלי לזה של הקרן הבסיסית (איור 5B).

איור 8 מראה את ה-RIN של המקורות האופטיים המשמשים בפרוטוקול זה ואת מגבלת רעשי הזריקה, שהיא תוצאה של האופי הקוונטי של אלקטרונים ופוטונים שמציב גבול בסיסי לרעש הלייזר. ה-RIN המוגבל של רעשי הצילום מחושב עם כפי שמוצג על-ידי Eq (3).

(3)

כאשר h הוא קבוע פלאנק, ו- ν הוא התדר האופטי. לפיכך, רעש הצילום מספק הנחיות שימושיות לעיצוב האלקטרוניקה.

איור 11A ואיור 11C מראים נתונים מופתיים של ספקטרום מאוזן ולא מאוזן. באופן טבעי, ההשפעות של גילוי מאוזן משפיעות על התוצאות הסופיות של הניסויים, כלומר על המפות הכימיות. איור 11B ואיור 11D מראים תמונות מורכבות בתנאים הלא מאוזנים והמאוזנים, בהתאמה. יישום מוצלח של הפרוטוקול המתואר יסייע לזהות ולמקם את המרכיבים הכימיים השונים של דגימה הטרוגנית ולחלץ את ספקטרום ה- SRS האופייני להם. הכפפת הנתונים ההיפר-ספקטרליים של איור 12 לניתוח כימומטרי נותנת את איור 13. איור 13A מראה מרוכב של מפות הריכוז של המרכיבים הכימיים השונים של הדגימה, ואילו איור 13B מראה את ספקטרום ה-SRS האופייני להם. שים לב שהנתונים המוצגים באיור 13A לא רק מאפשרים למשתמש לזהות בקלות את המרכיבים השונים של המדגם, אלא גם לבצע ניתוח כמותי רב יותר. לדוגמה, על ידי שימוש במפות הריכוזים, נוכל לחשב את הממוצע של הריכוז השברירי של כל מין כימי: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS ו-22% שמן זית.

איור 1: שרטוט של מיקרוסקופ ה-SRS בפס רחב שבו נעשה שימוש בפרוטוקול זה. קיצורים: PBSx = קיטוב אלומותplitter; SHG = מודול הדור ההרמוני השני; OPO = מתנד פרמטרי אופטי; AOM = אפנן אופטי acousto; SPF = מסנן מעבר קצר; M-LIA: מגבר נעילה רב-ערוצי; DM = מראה דיכרונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: ספקטרום של משאבת הפס הרחב הניתנת לכוונון (כחול) ושל קורות הפס הצר (האדום) של סטוקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונת ברייטפילד של הדגימה ההטרוגנית מבחינה כימית. שים לב כי מיקרוסקופיה קונבנציונלית אינה מאפשרת להבחין בין המרכיבים השונים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: PS = פוליסטירן; PMMA = פולימתיל מתקרילט; DMSO = דימתיל סולפוקסיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: אפנון הפולסים של הפס הצר של סטוקס. (A) העקבה הכחולה השקופה מראה את הקרן^{המפוזרת 0 th th} , בעוד שהשחור מראה^{את הסדר המתאים} של st 1. (B) התקנה אופטית למיטוב יעילות האפנון של הקרן המפוזרת מסדר 1^st וכוונון עדין של גודל הנקודה של קרן סטוקס לפני ההגעה למטרת העירור. קיצורים: AOM = אפנן אופטי acousto; f_x = אורך מוקד של עדשה X. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תהליכים אופטיים לא ליניאריים הנדרשים כדי להניע את ה-OPO. (A) הגיאומטריה של האינטראקציה של SHG. שני פוטונים בסיסיים ב-ω₁ מביאים את מערכת החומר לרמה וירטואלית בעלת אנרגיה גבוהה, משם מערכת החומר מזנקת אל מצב הקרקע, ופולטת פוטון ב-ω_SHG. (B) סכמת ניסוי SHG. (C) שרטוט של הגדרות SHG ו-OPO. (D) גיאומטריה של האינטראקציה DFG. פוטון ω_SHG מפוצל לפוטונים אות (ω_אות) ואידלר (ω_Idler). רווח של קרן האות מושג על ידי הזנת פוטוני האות בחזרה והפיכתם למהדהדים בחלל. (E) תכנית ניסוי ה-DFG. קיצורים: SM_x = מראה כדורית (R = 75 מ"מ); OPO = מתנד פרמטרי אופטי; SHG = מודול הדור ההרמוני השני; DFG = יצירת תדר הפרשים; LBO = ליתיום טריבוראט; OC = מעבה שמן; DM = מראה דיכרואית; f_x = אורך מוקד של עדשה X. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: גיאומטריה של מדחס המנסרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: יצירת תדרי סכום כדי למטב את החפיפה הספטיו-טמפורלית. (A) SFG בין המשאבה לסטוקס וה-SHG שלהם בהתאמה פוגעים במסך. כאן, עדשה מיקדה את המשאבה ואת קרני הסטוקס על גביש, בעוד מסנן בעל מעבר נמוך הסיר אותם. (B) עוצמת ה-SFG בין המשאבה לסטוקס כפונקציה של עיכוב בזמן. הגדר את אפס הזמן של הגדרת ה- SRS במיקום שממקסם את ה- SFG. האסימטריה של המתאם הצולב ב-B נובעת מהפרופיל הזמני שנגרם על ידי האטאלון על קרן סטוקס. קיצורים: SFG = יצירת תדר סכום; SHG = מודול הדור ההרמוני השני; SRS = ספקטרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 8: ספקטרום RIN. הפס המודגש בירוק מראה את האזור הספקטרלי הטוב ביותר עבור ניסויי ה-SRS. ויסות קרן סטוקס בכל תדר בתוך רצועה זו מבטיח כי ההשפעות של רעש הלייזר על אות ה- SRS יהיו הנמוכות ביותר האפשריות. קיצורים: RIN = רעש בעוצמה יחסית; SRS = ספקטרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 9: פרופילי קרן. (A) משאבה, (B) סטוקס, ו-(C) משאבה וסטוקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 10: הגיאומטריה המשוערת עבור סורג פיזור וגלאי מערך פוטודיודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11. ההשפעות של זיהוי מאוזן. השפעות על ספקטרום (A, C) ותמונות כימיות (B, D). החומרים המרוכבים המוצגים בלוחות (B) ו-(D) הם התוצאות הסופיות של הניסויים (כלומר, לאחר ניתוח כימומטרי של נתונים היפרספקטרליים). ראה פרוטוקול סעיף 4 לפרטים). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצור: SRS = ספקטרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 12: היפרקוב SRS מייצג שנרכש באמצעות מיקרוסקופיית SRS בפס רחב. מישור x-y מאחסן את הקואורדינטות של המיקומים הסרוקים, בעוד שכל וקטור לאורך z רושם ספקטרום SRS. קיצור: SRS = ספקטרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 13: ניתוח כימומטרי של נתוני SRS היפרספקטרליים. (B) ספקטרום אופייני של המינים הכימיים. בשני הלוחות, צהוב: שמן זית, כחול: DMSO, ציאן: PS, וכתום: PMMA. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר (A). קיצורים: SRS = ספקטרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה; PS = פוליסטירן; PMMA = פולימתיל מתקרילט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

מיקרוסקופיית SRS בפס רחב היא טכניקת הדמיה רבת עוצמה המציעה ניגודיות כימית אותנטית כדי לזהות ולפרק את המרכיבים הכימיים של דגימה הטרוגנית. הפוטנציאל של כלי אנליטי זה יכול להועיל למספר תחומי מחקר, החל ממדע החומרים ועד היסטופתולוגיה. החיסרון של מיקרוסקופיית SRS בפס רחב הוא העובדה שהיא תובענית מבחינה טכנית; הנסייניסט לא רק דורש ידע על מקורות לייזר בפס רחב, אלא גם צריך לתמרן את פולסי הלייזר כדי ליצור ביעילות SRS, אות שבתורו צריך להימדד באמצעות סכימות זיהוי מתוחכמות. מאמר זה מציג פרוטוקול המתאר זרימת עבודה להפקת מפות כימיות של תרכובות כימיות מעורבות באמצעות מיקרוסקופ SRS בפס רחב מרובה. למרות שהעבודה המתוארת עשויה להיות טריוויאלית עבור כמה פיזיקאים של לייזר ומיקרוסקופיסטים לא ליניאריים, ייתכן שזה לא המקרה עבור קוראים המעוניינים ביתרונות של מיקרוסקופיית SRS בפס רחב שהידע המדעי שלה שוכן מחוץ לתחומים אלה. לכן, שאפנו לפרט כל צעד כדי להנחות את הקהל הרחב המעוניין במיקרוסקופיית SRS בפס רחב.

הפרוטוקול שלפנינו התחיל בכך שהראה כיצד להכין דגימה פשוטה אך עשירה בספקטרוסקופית המורכבת מכמה מפזרי ראמאן חזקים ומוכרים. דנו כיצד להשיג את משאבת הפס הרחב ואת קורות סטוקס בפס הצר הדרושות להקמת מיקרוסקופ SRS. איור 5C מציג סכימה של הגדרות SHG ו-OPO. שימו לב שעדשה f₁ ממקדת את הקרן הבסיסית על LBO₁ כדי ליצור את ה-SHG, בעוד שמראה דיכרואית משקפת את קרינת ה-SHG ומעבירה את הקרן היסודית השיורית. עדשה שנייה f₂ קולשת את קרן SHG. כאשר f₂ > f₁, קרן SHG מורחבת על ידי גורם_השווה ל- f 2/f₁. עדשה שלישית f₃ ממקדת את קרן SHG המורחבת בגביש LBO מסוג I שני (LBO₂) שנחתך ב- θ = 90° ו- φ = 29.0°. על ידי שאיבת LBO₂ עם ה-SGH (520 ננומטר) הנ"ל, הקרינה בטווח של 680-910 ננומטר תצא מ-LBO₂ דרך יצירת תדרי הפרש (DFG), ותיצור שתי אלומות: האות והבטלן²⁷ (איור 5D,E). האחרון מושלך בעוד הראשון מוגבר בחלל OPO כדי לספק את פולסים המשאבה המשמשים בניסויי SRS. אין לבלבל את המשאבה של OPO ב-520 ננומטר, כלומר את קרן SHG, עם המשאבה של ניסויי ה-SRS (כלומר, קרן האות של ה-OPO).

הניגודיות במיקרוסקופ SRS נובעת מאות לא ליניארי שנוצר בנקודת המוקד של המיקרוסקופ, אות הדורש רכזת מספר רב של פוטונים במישור הדגימה בזמן נתון. כליאה זו של פוטון מושגת עם מטרת מיקרוסקופ צמצם נומרי גבוה (NA), מערך עדשות שקובע גם את הרזולוציה המרחבית של המערכת: ככל שה-NA גבוה יותר, כך הרזולוציה המרחבית גבוהה יותר. עם זאת, מטרות NA גבוהות עמוסות בצפיפות בזכוכית, מה שמכניס GDD חיובי לקרינה פועמת, ציוץ תדר שבסופו של דבר מרחיב את הפרופיל הזמני של הפולסים³⁹. לפיכך, ה-GDD שהוצג על ידי מטרת המיקרוסקופ עשוי להאריך את משך פולסים של משאבת הפס הרחב, מה שהופך אותו לארוך עוד יותר מהמעטפת הטמפורלית של סטוקס ומפחית את רוחב הפס האפקטיבי והנגיש של אות הרמאן. יתר על כן, הרחבה זו עשויה גם ליצור עיוות של הפרופיל הספקטרלי של ספקטרום ה-SRS הנמדד.

ב-CARS, האות הרלוונטי מבחינה ספקטרוסקופית מתגלה באורכי גל השונים מאלו של שדות העירור. ניתן להשתמש בצינור פוטומולטיפלייר פשוט יותר או במצלמת התקן מצומד לטעינה (CCD) כדי לשלב את אות ה-CARS בזמן, תוך סיכום אלפי פולסים כדי למדוד את רעש הלייזר הממוצע. במקום זאת, אות ה-SRS מופיע כהעברת אפנון קלושה המוטבעת בתוך רקע לייזר חזק ותנודתי. מכיוון שמודולציה זו חלשה, רעש הלייזר יכול להציף אותו בקלות, ולהפחית הן את מהירות ההדמיה והן את הרגישות של מיקרוסקופ SRS. לכן, לפני ההדמיה, חובה למדוד את רעש העוצמה היחסית (RIN) כדי לקבוע אם הלייזר מתאים להדמיית SRS במהירות גבוהה ולבחור את תדר המודולציה עם הרעש הנמוך ביותר. ה-RIN מוגדר כצפיפות הספקטרלית של הספק הרעש [δP(f), עם יחידות W²/Hz] של הלייזר המנורמלות על ידי ההספק האופטי הממוצע ()^40,41. במילים אחרות, ה-RIN מתאר את תנודות הלייזר המנורמלות בתדרים שונים (Eq [4]).

(4)

לפיכך, RIN הוא פרמטר של מערכת SRS הקובע את טווח תדרי האפנון האידיאלי עבור הניסויים. לדוגמה, חטיף הזית באיור 8 מראה את טווח תדרי המודולציה האידיאלי להדמיית SRS. במקרה של SRS בפס צר, המשתמש צריך למדוד את ה- RIN של המשאבה ושל סטוקס כדי לבחור איזו קרן צריכה להיות מווסתת כדי להשיג ביצועים אופטימליים. שימו לב מאיור 8, למשל, שלקרן סטוקס יש RIN מעט גבוה יותר מהמשאבה, מה שמרמז על כך שמדידות ה-SRG יתבררו רועשות יותר ממקבילותיהן ב-SRL. במקרה של SRS בפס רחב, הקרן שיש לאמוד היא קרן הפס הצר.

הפיזור הזוויתי D של הסורג מבטא את זווית הדיפרקציה כפונקציה של אורך הגל, ומוגדר כנגזרת של משוואת הסורגים. עבור תצורת ליטרו, הפיזור הזוויתי ניתן על ידי Eq (5).

(5)

כדי לקבל Eq (5), הנחנו α = β, פתרנו את Eq (2) עבור m/d והכנסנו את התוצאה לתוך dβ/ dλ. שימו לב שבתצורת ליטרוב, β = ^sin-1(mλ/2d). בתוך קירוב הזווית הקטנה, השינוי במיקום לאורך הספקטרום הוא fdβ ≈ dl (איור 10). לפיכך, על ידי הכנסת dβ לתוך Eq (5), אנו יכולים לחשב את הפיזור הליניארי, כמות עם יחידות של nm ^mm-1 באמצעות Eq (6):

(6)

עבור סורג עקיפה הפועל בתצורת ליטרו עם 1,851.85 חריצים/מ"מ, d = 540 ננומטר. אם נשתמש ב עקיפה מסדר ראשון של אור ב~ 789 ננומטר, D = 0.0027 rad nm-1. עם עדשת f = 750 מ"מ, אנו מקבלים פיזור ליניארי של ≈ 0.5 ננומטר מ"^מ-1, המתורגם ≈ 7.8 ס"^מ-1 מ"מ-1. לפיכך, אורך המוקד של העדשה קובע את "הצפיפות" של nm למ"מ במישור הגלאי: ככל שאורך המוקד ארוך יותר, כך מתקבל פחות ננומטר למ"מ, מה שמגדיל את הרווח בין הקווים הספקטרליים של משאבת הפס הרחב. לעומת זאת, עם אורכי מוקד קצרים יותר, יהיו יותר nm לכל מ"מ במישור הגלאי, מה שמקטין את השטח שתופסת המשאבה המפוזרת.

זיהוי מאוזן משפר את איכות התמונה ואת הרגישות של הגדרות רועשות. לדוגמה, על פי ספקטרום RIN המוצג באיור 8 ובהתחשב ב-SRS טיפוסי עם משרעת של 1 x ^10-5, יחס האות לרעש הלא מאוזן (SNR) הוא ≈60. באמצעות זיהוי מאוזן (כלומר, קרוב לרעש הזריקה), ניתן להשיג SNR של ≈145. איור 11 מציג תמונות ספקטרום וקומפוזיציה בתנאים מאוזנים ולא מאוזנים. באופן טבעי, ההשפעות של גילוי מאוזן משפיעות על התוצאות הסופיות של הניסויים, כלומר על המפות הכימיות. בתמיכת תוצאות אלה, אנו מדגישים כי זיהוי מאוזן הוא טכניקה רבת עוצמה להתמודדות עם ההשפעות המזיקות של תנודות לייזר על איכות התמונה. ראוי להזכיר כי זיהוי מאוזן הוא המתאים ביותר עבור לייזרים רועשים, כגון מתנדים סיבים. מיקרוסקופי SRS הפועלים עם מקורות אור אופטיים שקטים (למשל, לייזרים במצב מוצק), עשויים שלא לדרוש זיהוי מאוזן.

הפרוטוקול גם מסביר גישה המבוססת על אופטיקה לא ליניארית למציאת החפיפה המרחבית-טמפורלית בין הפולסים של אלומות אלה. תיארנו את היתרונות של שימוש ב-1^st במקום ב-0^{th diffraction-order} של AOM בתור קרן סטוקס המאופננת. יתר על כן, ההשפעות המזיקות של פיזור על יעילות הדור SRS תוארו עם הצעות של דרכים למתן אותם באמצעות מדחס מנסרה. בנוסף, הפרוטוקול מסביר כיצד ליישר את המנסרות ומדגיש שלושה היבטים קריטיים שיש לקחת בחשבון לביצועים אופטימליים. אנו לא רק דנים ברלוונטיות של ה- RIN למיקרוסקופיית SRS, אלא גם מראים כיצד למדוד אותו באמצעות מגבר נעילה, ועם ספקטרום ה- RIN, להגדיר את תדירות המודולציה הטובה ביותר. עם דוגמה קונקרטית, מאמר זה מסביר כיצד משוואת הסורגים מסייעת בתכנון שרשרת הגילוי. לבסוף, הפרוטוקול ממחיש, עם נתוני SRS אמיתיים, את המבנה של hypercube SRS וכיצד לנתח אותו עם שפת תכנות מדעית בשימוש קונבנציונלי.

לפרוטוקול זה יש שלוש מגבלות קלות. ראשית, תוכנית הגילוי המשמשת בתרומה זו מורכבת מגלאי נעילה לא קונבנציונלי ורב-ערוצי שתוכנן ונבנה בתוך הבית על ידי Sciortino et ^al.26 כפי שהוכח בעבר²⁵, ניתן להחליף גלאי זה בפוטודיודה מאוזנת מהמדף. למרות ששינוי זה נוגע רק לגלאי ומשאיר את הפרוטוקול כמעט ללא שינוי, עם פוטודיודה אחת, יש לסרוק כל רכיב ספקטרלי בגלאי במקום למדוד את כולם בבת אחת. שנית, פרוטוקול זה משתמש בזיהוי מאוזן בתוך השורה, הדורש החדרת מספר אלמנטים אופטיים לנתיב הקרן. אלמנטים אופטיים אלה מגבירים את מורכבות המערכת ומובילים לאובדן כוח אופטי והרחבת פולסים.

גילוי מאוזן מוטבע גם דורש ששני העתקי המשאבה יעברו דרך הדגימה, מצב שעשוי להיות לא אידיאלי עבור דגימות רגישות לאור, כגון תאים חיים, או עבור אלה דו-מפרגנים מאוד שבהם שני העתקי המשאבה עשויים לחוות תכונות אופטיות שונות, ובכך לבטל את הגילוי המאוזן. שלישית, הפרוטוקול מסתמך על OPO שנבנה בבית, מכשיר שייתכן שאינו זמין בקלות. עם זאת, חלופות לספקטרום הפס הרחב המסופקות על ידי OPO הן יבשת העל מסיבים אופטיים לא ליניאריים או גבישים בתפזורת. זה האחרון יכול להיות מועסק רק עם לייזרים בקצב חזרה נמוך (עד 5 MHz). לכן, כמו בכל תכנון ניסיוני, לפרוטוקול העומד על הפרק יש כמה מגבלות. עם זאת, הם מינימליים ואינם מתפשרים על הצלחתה של גישה זו.

למרות שמדגם ייחוס מתואר כאן, פרוטוקול זה יכול לנטרל בהצלחה מינים כימיים בתוך תאים ורקמות של בעלי חיים וצמחים, כגון תאית, מינים שומניים או חלבונים, ולמצוא יישומים מעשיים במשימות ביוכימיות שונות או ככלי אבחון בהיסטופתולוגיה. באופן דומה, פרוטוקול זה יכול להיות כלי רב ערך במדעי החומרים. לדוגמה, בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לחקור את ההרכב המולקולרי ואת הריכוז של מינים פולימריים⁴². יתר על כן, מתודולוגיה זו תואמת לטכניקות מיקרוסקופיה לא ליניאריות אחרות, כגון מיקרוסקופיה בפס רחב המבוססת על משאבה-בדיקה⁴³ והטרודין CARS⁴⁴, תהליכי ערבוב של ארבעה גלים, שכמו ב-SRS, דורשים גם שתי אלומות אור עירור ומדידות אפנון-העברה. לבסוף, ניתן ליישם חלק מהמידע הכלול במאמר זה על טכניקות הדמיה לא ליניאריות שאינן מסתמכות על טכניקות העברת אפנון, אלא דורשות יישור שתי קרני לייזר פולסים או יותר, כגון מכוניות קונבנציונליות⁴⁵ ומיקרוסקופיות SFG⁴⁶.

לסיכום, פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה רבת עוצמה המבוססת על מיקרוסקופיית SRS בפס רחב כדי לחלץ מפות כימיות וספקטרום SRS האופייני להן מתערובות הטרוגניות מבחינה כימית, ומספק מערכי נתונים המאפשרים ניתוח נתונים כמותי פשוט. הרבגוניות והפשטות של השיטה גם נותנות לקורא המעוניין את האפשרות להתאים אותה לטכניקות לא ליניאריות שונות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collection objective	Nikon	CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon	Oil immersion objective
Coverslips	Thermo Fisher	043211-KJ	Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line	Physik Instrumente (PI)	M-406.6PD	Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO	Merck	D8418-500ML	Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon	SLS Optics Ltd	Custom made	Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective	Nikon	CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon	Water immersion objective
Grating	LightSmyth	T-1850-800s Series	High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser	Coherent	Custom made	Fidelity, HP
λ/2	Thorlabs	SAHWP05M-1700	Mounted superachromatic half-wave plate
PBS	Thorlabs	CM5-PBS203/M	16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads	Merck	MFCD00198073	Micro particles based on polymethacrylate
Prisms	Crisel	320-8218	LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads	Merck	72986-10ML-F	Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal	Dr. Sztatecsny GmbH	Custom made	thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 - 1,100 nm