JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

קרום המרתף חיוני למורפוגנזה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המובילים למיקום נכון של מבנה זה, הפרוטוקול שהוצג מתאר שיטות להמחשה ואפיון של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני קרום המרתף בתאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.

Abstract

קרום המרתף (BM) - יריעה מיוחדת של מטריצה חוץ-תאית הקיימת בצד הבסיסי של תאי אפיתל - חיונית לביסוס ותחזוקה של מורפולוגיה של רקמת אפיתל ומורפוגנזה של איברים. יתר על כן, ה- BM חיוני למידול רקמות, משמש כפלטפורמת איתות, ומספק כוחות חיצוניים לעיצוב רקמות ואיברים. למרות התפקידים החשובים הרבים שה-BM ממלא במהלך ההתפתחות התקינה והתנאים הפתולוגיים, המסלולים הביולוגיים השולטים בסחר התוך-תאי של שלפוחיות המכילות BM וכיצד הפרשה בסיסית מובילה לתצהיר מקוטב של חלבוני BM אינם מובנים היטב. האפיתל הזקיק של השחלה דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוינת לחקר התצהיר הבסיסי של חלבוני ממברנת BM, שכן הוא מייצר ומפריש את כל המרכיבים העיקריים של BM. הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה בשילוב עם עיבוד תמונה ברקמות קבועות מאפשרת זיהוי ואפיון של גורמים תאיים המעורבים במיוחד בסחר תוך תאי ובתצהיר של חלבוני BM. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לצביעה והדמיה של בועיות המכילות BM ו- BM מופקד באמצעות חלבונים המתויגים באופן אנדוגני באפיתל הזקיקי של שחלת דרוזופילה . פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לענות על שאלות איכותיות וכמותיות כאחד והוא פותח כדי להתאים לסינון בתפוקה גבוהה, המאפשר זיהוי מהיר ויעיל של גורמים המעורבים בסחר תוך תאי מקוטב ובהפרשה של שלפוחיות במהלך התפתחות רקמת אפיתל.

Introduction

קרום המרתף (BM) הוא יריעה דקה של מטריצה חוץ-תאית דביקה של תאים מרובדים (ECM) הקריטית למבנה אפיתל ולמורפוגנזה1. הוא מכיל כ-50 חלבונים ונמצא בכל מקום ביסוד תאי האפיתל והאנדותל, ומעורר תא שלד, חלק ושריר לב ואדיפוציטים 1,2,3. שלושת המרכיבים העיקריים של ה-BM בצד הבסיסי של תאי האפיתל הם קולגן IV, פרלקן ולמינינים. ה-BM עומד בבסיס תאי האפיתל ואחראי על תפקודים רבים, כולל הפרדת רקמות ומחסום, גדילה ותמיכה, וקיטוב תאים 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . תפקידה כפלטפורמת איתות מווסת את המורפולוגיה וההתמיינות של תאי אפיתל ורקמות במהלך ההתפתחות 3,13,14. יתר על כן, ויסות שגוי של ה- BM ו / או הפרה בשלמותו הם הגורמים העיקריים למצבים פתולוגיים רבים, כולל גרורות גידול 2,15,16. למרות הפונקציות החיוניות המבוצעות על ידי BM במהלך מורפוגנזה של רקמות ואיברים, מרכיבי המסלולים הביולוגיים המוקדשים לסחר תוך-תאי מקוטב ולהפרשה של חלבוני BM ידועים במעורפל.

כדי לחקור את הסחר התוך-תאי של בועיות המכילות BM ואת הפרשת חלבוני BM על ידי תאי אפיתל, האפיתל הזקיקי (FE) של שחלת דרוזופילה הוא מערכת מודל רבת עוצמה (איור 1). שחלת דרוזופילה מורכבת מ-16-20 מבנים ארוכים דמויי צינור, הנקראים אובריולים (איור 1A,B)17,18,19. ניתן לחשוב על כל שחלות כפס ייצור של ביצים, עם התקדמות הגיל של תאי הביצה (שכל אחד מהם מוליד ביצה) שמתחיל בקצה הקדמי ונע לאחור, עד שהביצה הבוגרת יוצאת דרך האובידוקט. כל תא ביצית עטוף על ידי ה-FE, חד-שכבתי של תאי זקיק סומטיים (FCs), המקיף את תאי הנבט המרכזיים (GCs). ה-FE מקוטב מאוד עם קוטביות אפית-בסיסית מובהקת שבה התחום האפיקלי פונה אל הנבט, וחלבוני ה-BM מופרשים באופן בסיסי18,19. ה-FCs מפרישים באופן פעיל את כל המרכיבים העיקריים של ה-BM, כולל קולגן IV, פרלקן ולמינינים 20,21. בתאי אפיתל כגון FCs, רכיבי ה-BM מיוצרים ודורשים מסלול הפרשה מקוטב מיוחד עבור התצהיר שלהם חוץ-תאי. לדוגמה, במקרה של המרכיב הנפוץ ביותר של BM, קולגן IV (Coll IV), הפרטים סביב הסחר וההפרשה התוך-תאיים המקוטבים שלו מעורפלים למרות שהייצור והתצהיר שלו הם המוקד של מחקרים רבים. קול IV מתורגם ברשתית האנדופלסמית (ER), שבה כל פיבריל - המורכב משלושה פוליפפטידים (שתי שרשראות α1 ושרשרת α2 אחת) - מורכב לסליל משולש22. קיפול תקין של Coll IV ותפקוד דורשים מלווים ואנזימים של ER, כולל ליזיל ופרוליל-הידרוקסילאזות כגון Plod ו-PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. אנזימים פוסט-טרנסלציוניים אלה מווסתים את מיון ה-ER של קול IV, שכן האובדן של כל אחד מהם גורם ל-Coll IV להילכד ב-ER הבסיסי 20,23,24,25,26. לאחר מכן, הקולג' הרביעי המסונתז החדש יוצא מהמיון עבור הגולגי בשלפוחיות מצופות COPII. קולטן המטען Tango1 מסייע באריזת קולגן לתוך שלפוחיות גדולות הקשורות לגולגי שיכולות להכיל חלבונים רב-חומריים גדולים20,27. ברגע ש-Coll IV נארז לתוך שלפוחיות אקסוציטיות תוך-תאיות, הוא מופרש באופן ספציפי באופן בסיסי מתאי אפיתל. כדי לכוון את תצהיר BM לצד הבסיסי, תאי אפיתל דורשים קבוצה נוספת של גורמים המוקדשים במיוחד להפרשת BM מקוטבת. באמצעות ה-FE של שחלת דרוזופילה, אופיינו כמה מרכיבים של התהליך התאי החדש הזה, כולל גורמי חילופי הנוקלאוטידים (GEFs) Crag ו-Stratum, ה-GTPases Rab8 ו-Rab10, כמו גם הרמות של הפוספונינוסיטיד PI(4,5)P2, ו-Kinesin 1 ו-3 חלבונים מוטוריים 20,28,29,30,31 . רכיבים אלה חיוניים להבטחת ההתפלגות המקוטבת של חלבוני BM.

כדי לנטר את הלוקליזציה התוך-תאית של חלבוני BM ב-FE, חלבוני קרום מרתף המתויגים באופן אנדוגני (מלכודות חלבון), כגון Viking-GFP (Vkg-GFP או α2 Coll IV-GFP) ו-Perlecan-GFP (Pcan-GFP) יכולים לשמש32,33. הודגם כי קווי מלכודת חלבונים אלה משקפים במדויק את ההתפלגות האנדוגנית של חלבוני BM ומאפשרים זיהוי רגיש יותר של סחרבשלפוחית 28,30. הרכיבים המעורבים בתצהיר המקוטב של BM ב-FE אופיינו לראשונה באמצעות קווי מלכודת חלבונים עבור Vkg-GFP ו-Pcan-GFP 20,28,29,30. ניתן להשתמש במלכודות חלבונים ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטנטים וקווי Gal4 34. יתר על כן, ניתן להשתמש במלכודות חלבונים בשילוב עם צבעים פלואורסצנטיים ו/או חיסון פלואורסצנטי, מה שמאפשר אפיון מדויק של לוקליזציה של חלבוני BM כאשר משווים בין תנאים מסוג בר ומוטנטים35.

כדי להעריך באופן מדויק ויעיל את ההתפלגות והלוקליזציה של שלפוחיות המכילות חלבון BM, מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) וטכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד מהוות יתרון משמעותי לגישות הדמיה אחרות. גישות אלה משלבות הדמיה ברזולוציה גבוהה עם קלות שימוש יחסית. CLSM היא טכניקת מיקרוסקופיה המאפשרת רזולוציה אופטית משופרת על ידי סריקת הדגימה באמצעות לייזר באופן סריקת רסטר באמצעות גלוונומטרים. מפתח הצמצם של חור הפין הוא מרכיב מרכזי במיקרוסקופ קונפוקלי. על-ידי חסימת האותות מחוץ למיקוד המגיעים מעל או מתחת למישור המוקד, מפתח הצמצם של חור הפין מוביל לרזולוציה מעולה ביותר בציר z36. זה גם מאפשר לקבל סדרה של תמונות במישור z, הנקרא z-stack, המתאים לסדרה של קטעים אופטיים. z-stacks יוצרים לאחר מכן תמונה תלת-ממדית של הדגימה, באמצעות שחזור תלת-ממדי, בעזרת תוכנת הדמיה. מיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים קונבנציונליים (שדה רחב), בניגוד למיקרוסקופים קונפוקליים, מאפשרים לאור מחוץ למיקוד לתרום לאיכות התמונה, ובכך להקטין את רזולוציית התמונה ואת הניגודיות36,37. זה הופך את מיקרוסקופיית האפיפלואורסצנציה למועמדת פחות אטרקטיבית כאשר חוקרים לוקליזציה של חלבונים או קולוקליזציה.

למרות ש-CLSM היא גישה מתאימה ליישומים שונים, כולל הדמיה ואפיון של הסחר התוך-תאי בחלבוני BM, היא עדיין מהווה בעיה בעת הדמיה של דגימות מתחת לגבול עקיפת האור של Abbe (200-250 ננומטר). בעת הדמיה של דגימות כאלה, מיקרוסקופיה קונפוקלית, במיוחד בעת שימוש במטרת שמן, יכולה לגרום לרזולוציה גבוהה. עם זאת, טכניקות סופר-רזולוציה עוברות את הגבול של מיקרוסקופיה קונפוקלית. ישנן גישות שונות להשגת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, שלכל אחת מהן מגבלות רזולוציה ספציפיות, וכל אחת מהן מתאימה לניתוחים שונים. גישות אלה כוללות מיקרוסקופיית לוקליזציה פוטואקטיבית (PALM) או מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM) ומיקרוסקופיה אווירית (סופר-רזולוציה) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . למרות של-Airyscan יש רזולוציה גסה יותר מאשר PALM/STORM, STED ו-SIM, הוא עדיין יכול להשיג רזולוציה של עד ~120 ננומטר (בערך פי שניים מהרזולוציה של CLSM). יתר על כן, הודגם כי לגישת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה זו יש יתרון על פני SIM וטכניקות אחרות ברזולוציית-על בעת הדמיית דגימות ודגימות עבות עם יחס אות לרעש נמוך47,48.

Airyscan היא טכנולוגיית מיקרוסקופיה קונפוקלית חדשה יחסית ברזולוציה גבוההיחסית 46. בניגוד ל-CLSMs מסורתיים, המשתמשים ב-pinhole ובגלאי נקודה בודדת כדי לדחות אור מחוץ למיקוד, גישה זו של רזולוציית-על משתמשת בגלאי שטח שפופרת פוטומולטיפלייר (GaAsP) בעל 32 ערוצים של גליום ארסניד פוספיד (GaAsP) שאוסף את כל האור בכל מיקום סריקה45. כל אחד מ-32 הגלאים פועל כחור סיכה קטן, ומקטין את גודל חור הפין מיחידת ה-1.0 Airy Unit המסורתית (A.U.) ל-0.2 A.U. משופרת, מה שמאפשר רזולוציה גבוהה עוד יותר ויחס אות לרעש, תוך שמירה על היעילות של קוטר45 של 1.25 A.U. יתר על כן, הדה-קונבולוציה הליניארית המשמשת את Airyscan גורמת לעלייה של עד פי 2 ברזולוציה45. בהתחשב בכך, CLSM, ובמיוחד מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, מתאימים היטב לחקר חלבוני BM וחלבונים המווסתים את התצהיר הבסיסי של חלבוני BM, מכיוון שהם יכולים לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד למחקרי לוקליזציה וקולוקליזציה, ובכך לספק תובנות חדשות באירועים המרחביים, הזמניים והמולקולריים השולטים בתהליכים אלה.

גישה חלופית למיקרוסקופיה קונפוקלית שניתן להשתמש בה כדי לבצע ניסויי לוקליזציה היא דה-קונבולוציה של תמונות. מאחר שמיקרוסקופיית שדה רחב מאפשרת לאור מחוץ למיקוד להגיע לגלאים, ניתן ליישם אלגוריתמים מתמטיים וחישוביים של דקונבולוציה כדי להסיר או להקצות מחדש אור מחוץ למיקוד מתמונות המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה בשדה רחב, ובכך לשפר את הרזולוציה והניגודיות של התמונה49. ניתן ליישם אלגוריתמים של Deconvolution גם על תמונות קונפוקליות כדי להגדיל עוד יותר את הרזולוציה והניגודיות, ולהפיק תמונות סופיות כמעט דומות לאלה של מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה50. Airyscan עושה שימוש בפירוק מבוסס מסנן ויינר יחד עם הקצאת הפיקסלים מחדש של שפרד, וכתוצאה מכך רזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש משופרים ביותר. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, נצפתה עלייה של פי 2 ברזולוציה בכל שלושת הממדים המרחביים (120 ננומטר ב-x וב-y, ו-350 ננומטר ב-z) בעת שימוש בטכניקת מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה זו45,51.

כתב יד זה מספק פרוטוקולים מפורטים וממוטבים לצביעה, רכישה והדגמה של סחר ותצהיר תוך-תאיים של חלבוני BM תוך שימוש ב-FE של שחלת דרוזופילה כמערכת מודל בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. קווי דרוזופילה המבטאים חלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, למשל Vkg-GFP ו-Pcan-GFP, הם כלים יעילים ומדויקים להמחשת סחר והפרשת חלבוני BM. בנוסף, ניתן להשתמש בהם בקלות ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטציה וקווי Gal4/UAS 34. למרות שמומלץ להשתמש בחלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, השימוש בנוגדנים נגד חלבוני BM ספציפיים תואם גם את הפרוטוקולים המתוארים. פרוטוקולים אלה שימושיים במיוחד עבור מדענים המעוניינים לחקור סחר תוך-תאי ואת הפרשת חלבוני BM ברקמת אפיתל שלמה באמצעות הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. יתר על כן, היכולת לשלב ניתוח רקמת אפיתל עם הכלים הנרחבים של הגנטיקה של Drosophila הופכת את הגישה הזו לחזקה במיוחד. לבסוף, פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לחקר סחר בווסקולרי ומיון של חלבונים אחרים בעלי עניין.

Protocol

1. הכנת זבובים לניתוחי שחלה

  1. שים 10-15 נקבות נקבות דרוזופילה מלנוגסטר (בנות 1-2 ימים) של הגנוטיפ הרצוי בבקבוקון צר המכיל כ-8 מ"ל של מדיום זבוב דרוזופילה מפוזר עם כמות קטנה של שמרי אופה מגורענים 2-3 ימים לפני הנתיחה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. הוספת כמה זכרים לבקבוקון יכולה להגביר את תפוקת תאי הביצים. עם זאת, ודא כי המספר הכולל של זבובים לא יעלה על 20 כמו זה יכול להשפיע לרעה על התפתחות השחלה.
    הערה: תיאור של זכרים ונקבות של דרוזופילה, וטיפים ועצות שימושיים למדענים ללא ניסיון קודם בדרוזופילה ניתן למצוא במאמרים המצוטטים34,52. הוספת שמרים תעודד ייצור ביצים ותיצור שחלות עם שלבים שונים המיוצגים. יתר על כן, זה גם ישמין את השחלות ויהפוך אותם לקלים יותר לבלו. שמרים רטובים יכולים לשמש גם במקום שמרים מגורענים, אולם עבור מלאי חלש יותר, הזבובים עלולים להיתקע ולמות.

2. כריתה וקיבוע של השחלה

הערה: לקבלת משאבים נוספים על כריתה וכתם של השחלה, הקוראים מופנים לפרוטוקולים המצוטטים 53,54,55.

  1. ביום הנתיחה, הכינו תמיסת קיבוע טרייה עם ריכוז סופי של 4% פרפורמלדהיד (PFA) על ידי דילול תמיסת מלאי ה-PFA בתמיסת חיץ פוספט 1x (PBS).
  2. מרדימים את הזבובים באמצעות CO2 ומניחים אותם על משטח זבובים. שמור את הזבובים מורדמים עד כריתה. שקול זבובים מורדמים כראוי לאחר שתנועותיהם פסקו, מה שבדרך כלל לוקח 10-20 שניות.
    הערה: למרות ששימוש ב-CO2 מומלץ כאפשרות בטוחה ומהירה יותר, ניתן להרדים זבובים באמצעות קרח.
  3. מניחים שקופית קעורה מזכוכית או צלחת צביעה עם בארות שקע רדודות מתחת למיקרוסקופ ניתוח וממלאים את הבארות ב-1x PBS.
  4. תפסו זבוב נקבה בבית החזה התחתון באמצעות זוג מלקחיים. להבטיח את המין של הזבובים על ידי היעדר איברי מין זכריים בקצה האחורי של הבטן ואת היעדר מסרקי מין על הקדמיים שלהם כמאפיין משני52. לנתח זבובים בנפרד באמצעות זוג מלקחיים נוסף (שלב 2.5) תוך טבילתם לתוך בארות מלאות ב-1x PBS תחת מיקרוסקופ הניתוח (מומלץ להגדיל פי 20).
  5. תוך כדי התבוננות במיקרוסקופ הניתוח, השתמשו בזוג מלקחיים נוסף כדי למשוך את החלק האחורי של הבטן הזבובית, מה שהופך את האיברים הפנימיים (למשל, שחלות, מעיים) לנראים לעין.
  6. יש לסחוט בעדינות את החלק הקדמי של הבטן הזבובית (כמו עם צינור של משחת שיניים) כדי לדחוק את השחלות אל מחוץ לבטן. שיטה זו צריכה לשמור על השחלות שלמות. נתקו והסירו בזהירות איברים אחרים ופסולת זבובים.
  7. באמצעות מלקחיים או מחטים ניתוח, להפריד את ovarioles של השחלה תוך שמירה על מבנה השחלה הכוללת שלם. מטרת שלב זה היא לשבור את נדן השרירים המכסה את השחלות ולאפשר צביעה יעילה והומוגנית יותר.
  8. מעבירים במהירות את השחלות לצינור מיקרו-צנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל המכיל 1x PBS ושומרים על הצינור על הקרח עד שכל הזבובים מנותחים. אל תשמור את הצינור על קרח אם יש לדמיין מיקרוטובולים או מיקרופילמנטים (או שלפוחיות הנסחרות על ידי רכיבי שלד ציטוסקטליים אלה), שכן הדבר עלול לגרום לדה-פולימריזציה.
  9. לאחר שכל השחלות מנותחות ומועברות לצינור microcentrifuge, אפשרו להן לשקוע לתחתית הצינור ולהסיר את כל ה- PBS מלבד ~ 50 μL של ה- PBS. הוסיפו 1 מ"ל של 4% PFA והניחו על נדנדת פלטפורמה מתפרצת למשך 15 דקות. חשוב לציין, בדקו אם השחלות נעות קדימה ואחורה בפתרון הקיבוע כדי לאפשר קיבוע תקין, שכן קיבוע לא שלם עלול להוביל לבעיות צביעה והדמיה.
    הערה: המהירות של nutator אינה קריטית. בעוד שלחלק מהנואטורים יש בקרת מהירות, אחרים מגיעים עם מהירות מוגדרת מראש. המהירות שנקבעה מראש מספיקה, ואם היא מתכווננת, מוגדרת ל-40-50 סל"ד.
  10. הסר את פתרון הקיבוע (כמו בשלב 2.9), ולאחר מכן בצע שתי שטיפות מהירות עם 1 מ"ל של 1x PBS המכיל 0.1% Triton-X 100 (1x PBST), על ידי היפוך עדין של צינורות המיקרופוגה 5-6 פעמים. לאחר מכן, המשך עם ארבע שטיפות של 10-15 דקות (שטיפה ארוכה) עם 1 מ"ל של 1x PBST (40-60 דקות בסך הכל).
    הערה: מומלץ להשתמש ב- 1x PBS + 0.1% Triton-X 100 לשטיפות מכיוון שהגדלת אחוז חומרי הניקוי עלולה לגרום לדנטורציה של GFP, מה שיוביל לירידה בפלואורסצנציה ולזיהוי של חלבוני BM המתויגים על ידי GFP.
  11. לצביעת צבע, למשל, צביעת דנ"א ו-F-אקטין, המשך לשלב 3. עבור immunostaining, המשך לשלב 4. ניתן לאחסן את השחלות ב- 1x PBST בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות לפני שתמשיך.

3. צביעת דנ"א/F-אקטין סטנדרטית

  1. לאחר קיבוע ושטיפה, הסר PBST. הוסיפו 500 μL של דנ"א ותמיסת צביעת F-Actin. כדי להכין את תמיסת ה-DNA/F-Actin, יש לערבב את Hoechst (כתם דנ"א; דילול 1:1000 של תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל) ואת הפלואידין המתויג על-ידי פלואור (כתם F-actin; דילול של 1:500 עבור Alexa Fluor 546 או 1:100 דילול עבור Alexa Fluor 647, כל אחד מתמיסת מלאי של 66 μM) ב-500 μL של PBST.
  2. מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי לשמור על השחלות והצבעים בחושך כדי לשמור על הפלואורסצנציה להדמיה יעילה ודגירה על נדנדת פלטפורמה מתפרקת למשך 15 דקות.
  3. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הדנ"א/F-אקטין (כמו בשלב 2.9). בצע שתי שטיפות מהירות ושלוש שטיפות ארוכות (10-15 דקות) ב- 1x PBST כמתואר בשלב 2.10. המשך להרכבה כמתואר בשלב 5.

4. חיסון פלואורסצנטי

הערה: זהו פרוטוקול חיסון סטנדרטי להדמיה פלואורסצנטית והוא תואם לרוב הנוגדנים הראשוניים.

  1. חסימה ונוגדנים ראשוניים (יום 1)
    1. לאחר קיבוע ושטיפה, הסר PBST כמתואר בשלב 2.9. הוסף 1 מ"ל של תמיסת חסימה (PBS + 5% BSA) וחסום את השחלות על נדנדת פלטפורמה מתנדנדת למשך שעה אחת מינימום.
      הערה: בנוסף ל-BSA, ניתן להוסיף סרום בקר עוברי (FBS) או סרום עזים רגיל (NGS) לתמיסת החסימה. לחלופין, ניתן לחסום את השחלות למשך הלילה על נדנדת פלטפורמה מתפרצת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הסר את תמיסת החסימה כמו בשלב 2.9 והוסף 300 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית המכילה נוגדנים ראשוניים המדוללים בריכוזים המתאימים להם (ספציפית לנוגדן המשמש) בתמיסת החסימה. דגירה למשך הלילה על נדנדת פלטפורמה מתפרצת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים הראשונית והמשך לחיסון נוגדנים משני.
      הערה: ניתן לשמור חלק מהנוגדנים הראשוניים ולעשות בהם שימוש חוזר. במקרים מסוימים, נוגדנים ראשוניים בשימוש חוזר יכולים להפחית את צביעת הרקע, וכתוצאה מכך הדמיה טובה יותר. עם זאת, יש לבדוק שימוש חוזר עבור כל נוגדן כדי להבטיח יעילות.
  2. נוגדנים משניים לחיסון (יום 2)
    1. לאחר הסרת תמיסת הנוגדן העיקרית, בצע שתי שטיפות מהירות וארבע שטיפות ארוכות (10-15 דקות) כמו בשלב 2.10. שטיפות חוזרות ונשנות שנעשו בקפידה באמצעות PBST טרי של 1x יפחיתו את הרקע הלא ספציפי ויובילו להדמיה אופטימלית.
    2. הסר PBST כמו בשלב 2.9 והוסף 500 μL של תמיסת נוגדנים משנית המכילה נוגדנים משניים פלואורסצנטיים שיזהו את הנוגדנים העיקריים שבהם נעשה שימוש. הגן על הצינור מפני אור על ידי כיסויו ברדיד אלומיניום מנקודה זו ואילך לצורך שימור אופטימלי של פלואורסצנציה, שהוא קריטי לצורך רכישה וניתוח של תמונה.
      הערה: תמיסת הנוגדנים המשנית צריכה להכיל נוגדנים משניים המצומדים לפלואורופורים שאינם חופפים לחלבונים המתויגים באופן אנדוגני. לדוגמה, אם משתמשים בחלבונים המתויגים על-ידי GFP, מומלץ להשתמש בנוגדנים משניים של Alexa Fluor באורכי גל אדומים או אדומים רחוקים (למשל, 546, 568 או 647 ננומטר). צבעים פלואורסצנטיים, כגון Hoechst ו- Alexa Fluor 546 או 647 פאלואידין מצומד, ניתנים להוספה לתמיסה המשנית. כתמים אלה עשויים לעזור לסמן את מבנה התא הכולל (כלומר, גרעינים ו-F-אקטין). עיין בשלב 3.1 עבור הריכוזים.
    3. הדגירה של השחלות בתמיסת הנוגדנים המשנית על נדנדת פלטפורמה מתפרצת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בצעו שתי שטיפות מהירות וארבע שטיפות ארוכות (10-15 דקות) ב-1x PBST כמו בשלב 2.10. המשך להרכבה כמו בשלב 5.

5. הרכבה של שחלות מוכתמות

הערה: שיטה זו פועלת היטב אם השחלות מפותחות היטב ושופעות. הרכבה זהירה של השחלות בשקופית היא קריטית להדמיה אופטימלית.

  1. לאחר הכביסה האחרונה, השתמשו בפיפטה p1000 כדי לטפטף בעדינות את השחלות למעלה ולמטה בצינור כדי להפריד בין תאי הביצים. אפשרו לתאי הביצים לשקוע לתחתית על ידי שמירה על הצינור במצב זקוף למשך 5-10 דקות. הפרדה זהירה של תאי ביצים בודדים היא קריטית להשגת רכישת תמונה אופטימלית.
  2. הסר PBST באמצעות פיפטת פסטר, והשאר ~ 50 μL. הסר כמה שיותר מה- PBST הנותרים באמצעות פיפטה p200. הוסיפו שתי טיפות של מדיום הרכבה, מספיק כדי להתפשט באופן שווה על מכסה של 22 מ"מ x 22 מ"מ. ניתן לאחסן את השחלות במדיום ההרכבה בצינורות microcentrifuge בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש לפני ההרכבה.
    הערה: מספר מדיות הרכבה שונות זמינות באופן מסחרי; מומלץ להשתמש בחומרי הרכבה קשיחים, כגון תושבת אקווה-פולי/הר או תושבת אנטיפאדה מזכוכית ProLong, כדי להשיג תנאי הדמיה אופטימליים. השימוש בגליצרול כמדיום הרכבה אינו מומלץ מכיוון שהוא עלול להוביל לתנאי הדמיה ירודים (למשל, חוסר יציבות פלואורופור). עבור חומרי הרכבה שאינם מתפלמרים, אטמו את הכיסוי באמצעות חומר איטום/לק לכיסויים כדי לאבטח אותו במקומו.
  3. תייג מגלשת זכוכית וניגב אותה בנייר רך ונטול אבק כדי להסיר אבק וטביעות אצבעות. חותכים את הקצה של קצה פיפטה p200 כדי לאפשר העברה קלה של מדיום ההרכבה הצמיג אל המגלשה מצינור המיקרו-סנטריפוג'. לאחר מכן, מעבירים באיטיות את כל תאי הביצים במדיום ההרכבה לשקופית הזכוכית, ומבטיחים לא ליצור בועות.
  4. תחת מיקרוסקופ ניתוח, פרשו בעדינות את התווך המורכב ותאי הביצים המופרדים באמצעות קצה p200 חדש או מלקחיים כדי לכסות שטח בערך בגודל של קליפת הכיסוי.
  5. בעזרת מלקחיים, הניחו בזהירות את הכיסוי (המנוקה בנייר נטול אבק) על תאי הביצים בזווית כדי למנוע בועות.
  6. אחסנו את המגלשה בטמפרטורת החדר על משטח שטוח בחושך למשך יומיים כדי לבצע פולימריזציה. לאחר שמדיית ההרכבה נרפאה, ניתן לאחסן את השקופית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך מספר שבועות לצורך הדמיה.
    הערה: חשוב להגדרה קשה של מדיום הרכבה לפולימר לפני ההדמיה. אם המדיום עדיין לא עבר פולימריזציה, השחלות יצופו מתחת לכיסוי, מה שישפיע על רכישת התמונה. יתר על כן, האינדקס הרפלקטיבי האופטימלי של מדיית הרכבה מושג רק לאחר שהוא מתייצב לחלוטין (עיין במידע היצרן לפרטים).
  7. שיטת הרכבה חלופית: שיטה זו מומלצת כדי להפחית את אובדן הרקמות אם השחלות אינן בשפע. בשיטה זו (המתוארת להלן), להפריד את האובריולים ואת תאי הביצים על המגלשה בזמן ההרכבה, במקום להפריד אותם בצינור microcentrifuge על ידי צנרת כמתואר בשלב 5.1.
    1. לאחר הכביסה האחרונה, יש להסיר את כל תמיסת הכביסה מלבד כ-100 μL. באמצעות פיפטה של פסטר או פיפטה p1000, העבר את השחלות השלמות ב- PBS לשקופית. באמצעות פיפטה p200, הסר בזהירות כמה שיותר PBST מהשקופית. השתמשו בנייר נטול אבק כדי לנגב את ה-PBST, במידת הצורך. אל תיגע בשחלות.
    2. הוסף שתי טיפות של מדיית הרכבה. יש להפריד בזהירות בין השחלות לתאי הביצים באמצעות מלקחיים או מחט ניתוח. הסר והשליכו רקמה זרה, ולאחר מכן פזרו את תאי הביצים והאביריולים בתווך ההרכבה. המשך לשלבים 5.5-5.6.

6. רכישת תמונה קונפוקלית

הערה: חלק זה מספק פרמטרים מרכזיים להשגת רכישת תמונה אופטימלית באמצעות כל מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 2).

  1. הגדר את המיקרוסקופ ואתר את הדגימה כמתואר להלן.
    1. לפני ההדמיה, חיוני לאתר את אזור העניין (ROI) באמצעות העינית של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. השתמש במטרת הגדלה נמוכה (20x) או במטרה שתשמש לרכישת תמונה (כלומר, 40x או 63x). בחר תא ביצים לתמונה.
      הערה: לרכישת תמונה, מומלץ להשתמש ביעדי הגדלה גבוהים כגון 40x או 63x (ראה 6.2.1).
    2. לאחר בחירת ההחזר על ההשקעה, המשך לרכישת תמונה; המשך לשלב 6.2 להדמיה קונפוקלית, ולשלב 7 להדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד.
  2. בחר את הפרמטרים המרכזיים לרכישת תמונה אופטימלית כמתואר להלן (דוגמאות לפרמטרים מרכזיים עבור התמונות המייצגות מופיעות בטבלה 1).
    1. בחירת מטרה: לרכישת תמונה קונפוקלית של סחר תוך-תאי והפרשה של חלבוני BM ב-FE, השתמש במטרה של פי 40 או פי 63.
      הערה: כדי להשיג את הרזולוציה הטובה ביותר האפשרית, מומלץ מאוד להשתמש במטרות Plan-Apochromat, עם מפתח צמצם מספרי גבוה (NA) המספק את התיקון האכרומטי הגבוה ביותר.
    2. בחירת לייזרים לכל ערוץ/רצועה: עבור GFP, השתמש בלייזר 488 ננומטר; עבור DAPI או Hoechst, השתמש בלייזר 405 ננומטר; עבור Alexa Fluor 546 או 568, השתמש בלייזר 561 ננומטר; ועבור אלקסה פלואור 647, השתמש בלייזר 640 ננומטר.
      הערה: כל בחירת לייזר תגרום להיווצרות ערוץ/מסלול שונה. כאן, המונח ערוץ מתייחס לתמונה שנוצרה על ידי התפלגות העוצמה המוקלטת עבור פלואורופורים נרגשים עבור החזר ההשקעה שנבחר באורך הגל הספציפי של כל ערוץ.
    3. הגדרת חור פין: כדי להפחית אור מחוץ למיקוד במהלך רכישת תמונה, הגדר את חור הסיכה עבור כל ערוץ ל- 1 AU.
    4. עוצמת הלייזר והגדרות העלייה בגלאי: כדי לכוונן את רגישות התמונה, השתמש הן ברווח הראשי של הגלאי והן בעוצמת הלייזר. כדי להגדיר כראוי את רגישות התמונה, מומלץ מחוון טווח. הגדר הן את הרווח הראשי והן את כוח הלייזר כך שיהיו בעלי רגישות נכונה כאשר המבנים המעניינים (למשל, שלפוחיות המכילות BM) נראים בבירור תוך הימנעות מרוויה של גלאי.
      הערה: כדי להימנע מהלבנת תמונות, השתמש בכוח הלייזר המינימלי הדרוש. מומלץ להגדיל את רווח הגלאי תחילה תוך שימוש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית. אם עלייה של רווח הגלאי אינה יכולה להשיג את העוצמה הרצויה, ואז להגדיל את כוח הלייזר. מומלץ לבצע עוצמת הספק לייזר בין 0.5%-1.2%.
    5. גודל מסגרת: מומלץ להשתמש בגודל התמונה האופטימלי שנקבע על ידי תוכנת הרכישה. עבור רוב היישומים, השתמש ברזולוציה מקסימלית של 1024 x 1024. רזולוציה גבוהה יותר תגדיל משמעותית את זמן הרכישה.
    6. מהירות סריקה: השתמש במהירות סריקה בין 6-9, שהיא בטוחה עבור רוב הדגימות. אם הדגימה רועשת, השתמש במהירות סריקה איטית יותר כדי לשפר את יחסי האות לרעש. עם זאת, מהירויות סריקה נמוכות מגדילות את זמן ההלבנה והרכישה של תמונות.
    7. ממוצע העוצמה הממוצעת: כדי לשפר את איכות התמונה, השתמש בממוצע העוצמה הממוצעת באמצעות סריקות עוקבות עם הגדרות זהות. עבור רוב המקרים, השתמש בממוצע של שניים כדי לשפר את יחסי האות לרעש מבלי להלבין את הדגימה.
    8. זום: התאם את אזור הסריקה באמצעות פונקציית הזום. השתמש בזום בין 2x-4x עם מטרות של 40x ו- 63x כערך היעיל ביותר כדי לדמיין בבירור בועיות המכילות BM ב- FE. בחר בקפידה את ההחזר המינימלי ROI כדי לקצר את זמן הרכישה.
  3. כדי לרכוש z-stack באמצעות תוכנת Zeiss Zen, השתמש בפרמטרים הבאים של חיתוך Z והגדר אותם כמתואר להלן.
    הערה: שלפוחיות ומבנים תוך-תאיים אחרים המכילים חלבוני BM הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים). רכישת מחסנית z באמצעות ה-FE תשפר משמעותית את איכות התמונה ואת הרזולוציה שלה. בדרך כלל, די בטווח המשתרע על עובי/עומק הרקמה כדי לדמיין ביעילות לוקליזציה תוך תאית. לשחזור תלת מימדי אופטימלי, מומלץ להשתמש במרווח האופטימלי שנקבע על ידי התוכנה. עבור יעדים של 40x ו- 63x, הימנע ממרווחים גבוהים מ- 0.5 מיקרומטר בין כל מקטע z כדי לאפשר שחזור תלת-ממדי אופטימלי.
    1. לחץ על תיבת הסימון z-Stack באזור הראשי תחת הכרטיסייה רכישה . בחר במצב סריקה של כל הרצועות לכל פרוסה עבור מחסנית z. התוצאה תהיה שינוי ברצועות הערוצים עבור כל פרוסת מיקום z.
    2. בחר את הערוץ הרצוי כדי לצפות בדגימה ולחץ על Live כדי להתחיל בסריקה חיה. מומלץ להשתמש בתעלה הדרושה לזיהוי חלבון ה-BM המתויג ב-GFP.
    3. הגדר טווח עבור מחסנית z כמתואר. באמצעות ידית ההתאמה העדינה במיקרוסקופ, מצא את מיקום z עבור קצה אחד של הדגימה, ולחץ על Set First. באופן דומה, מצא את מיקום z עבור הקצה השני של הדגימה ולחץ על Set Last.
    4. עבור כל מיקום במחסנית z, לחץ על כל ערוץ בנפרד עם מחוון הטווח שנבחר, והתאם את עוצמת הלייזר ואת הרווח הראשי לפי הצורך, כמתואר בשלב 6.2.4.
    5. הגדר את מרווח הזמן עבור מחסנית z כדי להקצות את גודל הצעד כפי שמומלץ בהערה מתחת לשלב 6.3. לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל ברכישת z-stack.

7. רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה במיוחד

  1. בחר מטרה תואמת Airyscan. כדי לדמיין את הלוקליזציה התוך-תאית של חלבון BM, השימוש במטרת שמן 63x הוא אופטימלי (איור 3). הגדר את המטרה לפי 63 והנח בעדינות טיפה של שמן טבילה על העדשה שלה. מקם את השקופית על המטרה עם כיסוי הפונה למטרה לאתר את הדגימה.
  2. בחר תצורה עם הגדרות מתאימות עבור הפלואורופור לתמונה כמתואר להלן.
    1. לחץ על לחצן התקנה חכמה בכרטיסיה רכישה כדי להגדיר ניסוי חדש. בחר Airyscan (רזולוציית-על); כאשר אפשרות זו נבחרה, תידרש בחירה נוספת בין רזולוציה (Airyscan SR), SNR/רגישות (Airyscan Confocal) ומהירות (Multiplex SR-2Y). עבור רקמות קבועות, בחר רזולוציה מכיוון שתביא לרכישה הטובה ביותר.
    2. לחץ על + בתיבה קבע את תצורת הניסוי שלך כדי להוסיף רצועות/ערוצים. בחר את הרצועות עבור צבעים ספציפיים ממסד הנתונים של Dye. לניסוי רב-ערוצי, הוסף כל רצועה לפי הצורך על-ידי בחירת הצבעים המתאימים.
    3. לאחר שכל המסלולים נוספו, בחר אחת מהצעות הניסוי שסופקו על ידי התוכנה. עבור ניסוי זה, השתמש ב- Best Signal, מכיוון שלמרות שהמהירות תהיה מעט איטית יותר בהשוואה להצעת Smartest (Line), היא תיצור את הגדרות החומרה הטובות ביותר עבור כל צבע, וכתוצאה מכך רווח אות מקסימלי וצלב פליטה מינימלי. לאחר שהניסוי הוגדר ונטען, הוא יופיע בחלון 'הגדרת הדמיה' בכרטיסיה 'רכישה'.
    4. לאחר בחירת הגדרה חכמה, ייבחר באופן אוטומטי טווח אורכי הגל של הגלאי GaAsP-PMT. התאם את הטווח על-ידי הזזת פס הגלילה בתחתית כדי להגדיל או להקטין את הטווח או להזיז לחלוטין את הטווח לאזור אחר כנדרש. השתמש באפשרות זו כדי לוודא שהטווחים של שני ערוצים שונים אינם חופפים כדי למנוע הצלבה. שמור את התצורה לשימוש חוזר בעתיד.
  3. לאחר הגדרת התצורה, המשך לכוונן את אזור הזום והסריקה כמו בשלב 6.2.8. מטב את אזור הסריקה כדי להתמקד באזור העניין כדי לצמצם את זמן הסריקה ואת שטח האחסון. המשך לרכישת תמונות.
  4. עבור כל ערוץ בנפרד, בחר רצועה תחת ערוץ ולחץ על שידור חי. התאם את הרווח הראשי ואת עוצמת הלייזר באמצעות כלי מחוון הטווח כמתואר בשלב 6.2.4 ופעל לפי כל ההנחיות המתוארות כדי למנוע פיקסלים רוויים. אשר כי תצוגת הגלאי המשושה ממורכזת ומיושרת על ידי לחיצה על לחצן תצוגת גלאי Airyscan . ברוב המקרים, תצוגת הגלאי המשושה ממורכזת ומיושרת באופן אוטומטי. חזור על הפעולה לקבלת ערוצים נוספים.
  5. בחלון החלפת המצב רכישה, תחת גודל תמונה, לחץ על SR (ספירת פיקסלים מוגבלת ברזולוציה גבוהה במיוחד) כדי למקסם את היכולות של הגלאי. פעולה זו תתאים את גודל המסגרת באופן אוטומטי.
  6. שמור את הממוצע ל - None מכיוון שבדרך כלל אין בו צורך, וזה יקטין את זמן הסריקה. במקרים מסוימים, ממוצע של פי 2 עשוי לשפר את יחס האות לרעש.
  7. אסוף נתונים גולמיים עם עומקי נתונים של 8 סיביות. לחץ על הצמד כדי להשיג תמונה. כדי לרכוש מחסנית z, בצע את שלב 6.3.
  8. בצע עיבוד תמונה כמתואר להלן. פעולה זו תפיק תמונה של 16 סיביות.
    1. לאחר קבלת התמונה או מחסנית z, לחץ על שיטת עיבוד > ובחר עיבוד Airyscan.
    2. בצע מסנן אוטומטי כדי להתחיל בו ולבצע עיבוד ידני נוסף על-ידי שינוי ערך ה- SR כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר עבור המדגם. לאחר קביעת ערך ה- SR האופטימלי, לחץ על החל כדי ליצור תמונה מעובדת. במקרה של תמונות z-stack, תעבדו כ-z-slice אחד (תמונה נוכחית [2D]) או כ-z-stack כולו על-ידי לחיצה על התיבה 'עיבוד תלת-ממדי '.

8. עיבוד תמונה וניתוח נתונים (הקרנה אורתוגונלית, שחזור תלת מימדי ופרופיל עוצמה)

הערה: עבור שיטה זו, השלבים המשמשים ליצירת הקרנות אורתוגונליות, שחזורים תלת-ממדיים ופרופילי עוצמה מתוארים עבור תוכנת Zen (ראה טבלת חומרים). ניתוחי נתונים דומים עשויים להתבצע גם עם תוכנת ImageJ56.

  1. בצע הקרנה אורתוגונלית כמתואר להלן (איור 4).
    1. לאחר קבלת מחסנית z באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או סופר-רזולוציה, צור הקרנה אורתוגונלית כדי להציג את הבועיות בציר z של התא בתצוגה דו-ממדית (בהשוואה לשחזור תלת-ממדי). לשם כך, לחץ על שיטת עיבוד > ובחר הקרנה אורתוגונלית.
    2. תחת הפרמטרים, בחר את מישור ההקרנה הנדרש. להקרנה של ציר z (z-stack), בחר את המישור החזיתי (XY). תחת שיטה, בחר מקסימום כדי לגרום להקרנה באיכות הגבוהה ביותר.
    3. לאחר מכן, קבע את עובי ההקרנה על-ידי בחירת מיקום ההתחלה (תחילת פרוסת z), וקבע את העובי (המספר הכולל של פרוסות z) בהקרנה. זה אידיאלי לבחור את העובי השווה לזה של תא אחד בציר z.
    4. לאחר הגדרת הפרמטרים, לחץ על החל כדי ליצור את ההקרנה של מחסנית z באופן מישור XY.
      הערה: בעת יצירת היטלים אורתוגונליים של z-stacks מרובים כדי להשוות את הכמות של אובייקט מסוים שמעניין אותו, חובה לשמור על עובי ההקרנה זהה (או קרוב ככל האפשר) לדיוק הנתונים.
  2. בצע שחזור תלת-ממדי כמתואר להלן (איור 5).
    1. צור שחזורים תלת-ממדיים של z-stacks כדי לבחון את הלוקליזציה והצורה של מבנים. עשה זאת עבור z-stacks שנרכשו באמצעות גישות קונפוקליות וסופר-רזולוציה. עיבוד z-stacks ברזולוציה מעולה תחילה באמצעות עיבוד תלת-ממדי כמו בשלב 7.8 לשחזור תלת-ממדי.
    2. כדי ליצור תמונה תלת-ממדית, לחץ על הסמל התלת-ממדי בחלון התצוגה המקדימה. לאחר הלחיצה, לשונית תלת-ממדית תופיע במקטע בקרת התצוגה בחצי התחתון של המסך. תצוגות תלת-ממד, כגון שקיפות, עוצמת קול, מקסימום, משטח ו-Mixed, יהיו גלויות לעין. השתמש בתצוגות Surface או Mixed בעת הצגת מבנה הבועיות (עדיף).
    3. עבור התמונה באיכות הגבוהה ביותר, בחר את ההגדרה 'מדויק' , מכיוון שההגדרה המהירה ביותר תהיה פחות מדויקת ותוביל לעיבוד תלת-ממדי גרוע.
    4. לאחר יצירת התמונה, תפעל אותה על-ידי סיבוב ושינוי גודל התצוגה כדי להתמקד במיקום מועדף כדי להציג את האובייקטים המעניינים. תפעל את התמונה התלת-ממדית תחת הכרטיסיה 'מראה '.
    5. לאחר שהושגה תצוגה משביעת רצון, תחת הכרטיסייה 3D, בחר רזולוציה מוצגת ולאחר מכן לחץ על צור תמונה. פעולה זו תיצור תמונת מצב של התמונה באותו כיוון שבו היא הוצגה וניתן לשמור ולייצא אותה בפורמטים שונים של קבצים.
  3. צור פרופיל עוצמה כמתואר להלן (איור 7).
    הערה: ניתן לראות את פרופילי ההתפלגות והעוצמה של הפיקסלים המשויכים לאותות הפלורסנט השונים כתמונת שכבה כדי לקבוע את הקולוקליזציה שלהם.
    1. לאחר שתמונה אופטימלית נרכשה באמצעות הדמיה קונפוקלית או ברזולוציה גבוהה במיוחד, בחלונית View של חלון התצוגה המקדימה , לחץ על פרופיל. בחלון התצוגה המקדימה תופיע היסטוגרמה המציגה את פרופיל העוצמה כפונקציה של מרחק, וכן טבלה המציגה מרחקים וערכי עוצמה.
    2. באזור פקדי התצוגה בתחתית המסך, לחץ על כלי החץ בכרטיסיה הגדרת פרופיל . ציירו חץ לאורך העצם שעבורו יש להעריך את פרופיל העוצמה של הפיקסלים השונים. כדי לצייר את החץ, הגדל את התצוגה של התמונה.
    3. פרופיל העוצמה יופיע בצד שמאל של התצוגה המקדימה של התמונה, שם יוצגו המרחק והפסגות המתאימות לאורך נתיב החץ. כדי להסיר את ההיסטוגרמה המוצגת בתמונה עצמה, בטל את הסימון בתיבה הצג פרופיל בגרפיקה .
    4. בכרטיסיה ממדים באזור בקרת התצוגה, בטל את הבחירה בערוצים שאינם אמורים להיכלל בפרופיל העוצמה.
    5. בכרטיסיה גרפיקה, לחץ פעמיים על פרופיל המוצג תחת התיבה ביאורים/מדידות כדי לפתוח את התיבה הנפתחת עיצוב רכיבים גרפיים . השתמש באפשרות זו כדי לשנות את צבע החץ, כמו גם את הסגנון ואת עובי הקו שלו. סגור את התיבה לאחר בחירת ההגדרות הרצויות.
    6. לחץ על הכרטיסיה תצוגת פרופיל . במקטע התמונה החדשה, לחץ על תצוגה נוכחית ולאחר מכן על שמור בשם כדי לשמור את הקובץ. מומלץ לשמור את הקובץ כקובץ .tif כדי למנוע דחיסה ואובדן נתונים.

תוצאות

ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי לצלם ולאפיין ביעילות ובדייקנות את הסחר וההפרשה התוך-תאיים של חלבוני BM בתאי אפיתל מקוטבים, כגון FE של שחלת דרוזופילה . לאחר מכן, אנו מספקים תוצאות צפויות שהושגו באמצעות השיטות המתוארות, כמו גם עצות מועילות ומלכודות פוטנציאליות. כדי לעשות זאת, Vkg-GFP, Vkg מ...

Discussion

ה-BM חיוני למורפוגנזה עוברית ואיברית, ולתפקודים פיזיולוגיים של מבוגרים. יתר על כן, BM פועל כפלטפורמה איתות לביסוס ותחזוקה של קוטביות אפיתל ומספק לרקמות תמיכה2. עם זאת, המנגנונים המווסתים את המיקום הנכון של חלבוני BM אינם מובנים היטב. הבנה טובה יותר של המסלולים הביולוגיים המוקדשי?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לג'ולי מרקל על הערותיה המועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R15GM137236 ל- O.D. התמונות הקונפוקליות והסופר-רזולוציה נרכשו באמצעות Zeiss LSM 900 עם Airyscan 2, שנרכשה במענק NSF MRI 2018748.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 546 phalloidinInvitrogenA22283F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidinInvitrogenA22287F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibodyabcamab30637For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-PolymountPolysciences, Inc.1860620Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)Genesee Scientific62-103To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)Sigma-AldrichA7284For blocking solution
Depression wellsElectron Microscopy Sciences7156101For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needleFisher scientifc13-820-024
Drosophila IncubatorGenesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)Bloomington Drosophila Stock Center33594RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)Fine Science Tools11251-30For dissection
Glass Concavity SlideElectron Microscopy Sciences7187804For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11036Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)InvitrogenH3570DNA Stain (1 ug/mL)
KimwipesKimtechFisher Scientific: 06-666Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FCLeicaFor ovary imaging
Microscope SlidesCorning294875X25Microscope Slides
Nutating platform rockerCorning Life Sciences6720For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BFGenesee Scientific66-121Fly Food
Paraformaldehyde 20% SolutionElectron Microscopy SciencesFisher Scientific: 15713For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline TabletsFisher scientificBP2944100For PBS solution
ProLong Glass Antifade MountantInvitrogenP36980Mounting Medium
Square Cover GlassCorning285022Cover glass for microscope slides
Triton x-100Sigma-Aldrich9036-19-5For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2ZeissConfocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo MicroscopeZeissDissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)ZeissImage acquisition and processing

References

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved