JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הודגם פרוטוקול של מיקרוסקופיה להרחבת שמירת תוויות (LR-ExM). LR-ExM משתמשת במערך חדשני של עוגנים תלת-תכליתיים, המספקים יעילות תיוג טובה יותר בהשוואה למיקרוסקופיות הרחבה שהוצגו בעבר.

Abstract

מיקרוסקופיית הרחבה (ExM) היא טכניקת הכנת דגימות שניתן לשלב עם רוב שיטות המיקרוסקופיה הקלה כדי להגדיל את הרזולוציה. לאחר הטמעת תאים או רקמות בהידרוג'ל מתנפח, ניתן להרחיב פיזית דגימות פי שלושה עד שש עשרה (ממד ליניארי) בהשוואה לגודל המקורי. לכן, הרזולוציה האפקטיבית של כל מיקרוסקופ גדלה על ידי גורם ההרחבה. מגבלה מרכזית של ExM שהוצגה בעבר היא פלואורסצנטיות מופחתת לאחר פילמור והליך העיכול. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה מיקרוסקופיית הרחבה לשמירת תוויות (LR-ExM), המונעת אובדן אותות ומשפרת מאוד את יעילות הסימון באמצעות קבוצה של עוגנים תלת-תכליתיים חדשניים. טכניקה זו מאפשרת להשיג רזולוציה גבוהה יותר בעת חקירת מבנים תאיים או תת-תאיים בקנה מידה ננומטרי עם אובדן אות פלואורסצנטי מינימלי. ניתן להשתמש ב- LR-ExM לא רק לתיוג אימונופלואורסצנטי, אלא גם עם תגי חלבון עם תיוג עצמי, כגון תגי SNAP ו- CLIP, ובכך להשיג יעילות תיוג גבוהה יותר. עבודה זו מציגה את הפרוצדורה ופתרון הבעיות עבור גישה מבוססת חיסון זו, כמו גם דיון בגישות תיוג עצמי של LR-ExM כחלופה.

Introduction

מיקרוסקופיית הרחבה (ExM) שימשה חוקרים מאז שהוצגה לראשונה כגישה נוחה להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופים קונבנציונליים, כגון אפיפלואורסצנציה ומיקרוסקופים קונפוקליים 1,2,3,4,5,6,7 . באמצעות ExM, ניתן להשיג רזולוציה רוחבית של ~ 70 ננומטר גם עם מיקרוסקופים קונפוקליים רגילים. כאשר ExM משולב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, הרזולוציה משופרת עוד יותר. לדוגמה, ניתן להשיג רזולוציה של כ-30 ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM), ורזולוציה של כ-4 ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית שחזור אופטית סטוכסטית (STORM)1,5.

עם זאת, יעילות תיוג נמוכה היא בעיה קריטית בשיטות ExM סטנדרטיות. אובדן פלואורסצנטי יכול להשתנות בהתאם לסוג הקבוצות הפלואורסצנטיות וזמן העיכול. עם זאת, בממוצע, דווח כי יותר מ -50% מהפלואורופורים הולכים לאיבוד לאחר הפילמור ושלבי העיכול של החלבון של ExM, מה שפוגע באיכות ההדמיה 3,4.

לפיכך, פותחה מיקרוסקופיה להרחבת שמירת תוויות (LR-ExM), שיכולה לשמור ביעילות על תוויות ולהפחית את אובדן האות1. החידוש העיקרי של LR-ExM הוא השימוש בקבוצה של עוגנים תלת-תפקודיים במקום להשתמש רק בצבעים פלואורסצנטיים - כמו בנוהל ExM הסטנדרטי - להכתמת חלבונים מעניינים. המקשרים התלת-תכליתיים האלה מורכבים משלושה חלקים: (1) המחבר (למשל, N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS)) כדי להתחבר לנוגדן, (2) העוגן (למשל, מתקרילאמיד (MA)) כדי לעגן חלבונים לפולימר, ו-(3) הכתב (למשל, ביוטין או דיגוקסיגנין (DIG)) כדי להצמיד לצבע אורגני. העוגנים התלת-תפקודיים שורדים את שלבי הפילמור ועיכול החלבונים, ולכן מונעים אובדן פלואורופור.

יתר על כן, שיטה זו טומנת בחובה פוטנציאל רב מכיוון שהיא תואמת לתיוג עצמי של תגים אנזימטיים כגון SNAP או CLIP. לגישות תג אנזימטיות יש כמה יתרונות על פני גישת החיסון לגבי ספציפיות גבוהה ויעילות תיוג 8,9,10.

בכתב יד זה מודגם הליך מפורט של LR-ExM. LR-ExM היא שיטה יעילה וגמישה ביותר להשגת רזולוציה מרחבית גבוהה עם יעילות תיוג משופרת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תרבית תאים

  1. השתמש בתאי U2OS בתרבית במדיום 5A של McCoy בתוספת 10% FBS ב-37 °C ב-5% CO2.
  2. תאי תרבית על גבי 16 כיסויים תאיים נשלפים היטב (שטח תרבית 0.4 ס"מ2) לטיפול קל.

2. קיבעון וחדירה

הערה: תנאי הקיבוע והחדירה תלויים בפרוטוקולים הממוטבים של מערכת החיסון. להלן פרוטוקול קיבוע וחדירה למיקרוטובול קו-אימונוסטין ולבורות מצופים קלתרין (CCPs).

  1. ברגע שספירת התאים מגיעה ל-~0.04 x 10 6, תקן תאים עם 100 μL של 3.2% פרפורמלדהיד (PFA) במאגר PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA ו-1 mM MgCl2, pH6.9) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (טבלה 1).
    הערה: קיבוע באמצעות PFA מתבצע במכסה בטיחות מאושר.
  2. יש לשטוף תאים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 200 μL של מי מלח עם אגירת פוספט (PBS).
  3. חלחלו לתאים עם חיץ חלחול של 100 μL בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טבלה 1).
    הערה: המשך בהתוויה בהקדם האפשרי כדי למנוע פגיעה בחלבון המטרה, ברנ"א או בדנ"א, וכדי להשיג תוצאה מיטבית. עם זאת, אם יש צורך בכך, ניתן לאחסן דגימות קבועות לזמן ממושך (עד חודש) במאגר PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. החלף כל PBS שהתאדה והגן על הדגימה מפני הלבנת תמונות.

3. סטרפטאבידין אנדוגני וחסימת ביוטין

  1. דגירה של תאים עם תמיסת סטרפטאבידין מדוללת במאגר חוסם תאים (100 μL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (טבלה 1).
  2. יש לשטוף לזמן קצר עם 200 μL של מאגר חוסם תאים.
  3. דגירה של תאים עם 100 μL של תמיסת ביוטין מדוללת במאגר חוסם תאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בעת שימוש בגישת תיוג עצמי, כגון שימוש בתגיות SNAP או CLIP, דלג על שלב 4 והמשך לשלב 5.1: גישת תיוג עצמי.

4. מכתים נוגדנים ראשוניים

  1. דגירה של תאים עם נוגדן נגד α-טובולין של חולדות (דילול של 1:500) ונוגדן נגד קלתרין של שרשרת כבדה (דילול של 1:100) ב-100 μL של חיץ חסימת תאים למשך 16 שעות ב-4 מעלות צלזיוס או שעה אחת בטמפרטורת החדר. הכפילו את זמן הדגירה של דגימות הרקמה.
  2. יש לשטוף דגימות ארבע פעמים עם 200 μL של PBS למשך 5 דקות כל אחת.

5. מכתים נוגדנים משניים ספציפיים ל-LR-ExM

  1. הצמידו נוגדני IgG עם המקשרים התלת-תפקודיים כגון N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS) - מתקרילאמיד (MA) -ביוטין או NHS-MA-דיגוקסיגנין (Dig) (איור 1B). סינתזה של עוגנים תלת-תפקודיים והצמדה של הנוגדנים המשניים הוצגו בעבר ב- Shi et al.1. גישת תיוג עצמי: הצמדת נוגדני IgG עם המקשרים התלת-תפקודיים, כגון MA- בנזילגואנין (BG)-ביוטין או MA- בנזילציטוזין (BC)-Dig (איור 1B). סינתזה של עוגנים תלת-תפקודיים והצמדה של הנוגדנים המשניים הוצגו בעבר ב- Shi et al.1.
  2. דגירה של תאים עם החמור נגד ארנב-Dig-MA (דילול 1:100) ונוגדנים משניים נגד חולדה-ביוטין-MA (1:100 דילול) ב-100 μL של חיץ חסימת תאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הכפילו את זמן הדגירה הזה עבור דגימות הרקמה.
  3. יש לשטוף דגימות ארבע פעמים ב-200 μL של PBS למשך 5 דקות כל אחת.

6. עיגון נוסף

  1. דגירה של תאים עם 0.25% גלוטראלדהיד (GA) ב-PBS (100 μL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לעגן את החלבונים על ההידרוג'ל. לחלופין, יש להשתמש בחומצה מתקרילית N-הידרוקסיסוקיצינימיד אסטר (MA-NHS) של 25 מ"מ לעיגון. מומלץ לדגור של שעה בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף דגימות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.

7. ג'לציה

הערה: מהירות ההתפשטות נקבעת על ידי זמן הדיפוזיה של מלח ומים החוצה או לתוך הג'ל; לפיכך, יציקת ג'לים דקים מאיצה את זמן ההתפשטות.

  1. הסר את המבנה העליון של צלחת ג'ל 16 באר. הוסף 40 μL של תמיסת מונומר לכל באר כדי לרכך תאים על קרח. דגירה על קרח במשך 5 דקות.
    1. כדי להכין פתרון מונומר, ראה טבלה 2.
  2. הכינו את תמיסת הג'לציה על קרח. הוסף מים מזוקקים כפולים ומאיץ N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) לתמיסת המונומר (10% TEMED: תמיסת מונומר = 1:47); אל תוסיף עדיין את היוזם (טבלה 3).
  3. עבור תא תרבית תאים עם שטח של 0.4 ס"מ2, השתמש בנפח תמיסת ג'לציה של כ- 40 μL. הכן 45 μL של תמיסת ג'לציה עבור כל באר.
  4. הוסיפו 10% אמוניום פרסולפט (APS) לתמיסת הג'לציה, דגירה על קרח, ומיד פיפטה 40 μL של תמיסת ג'לציה לתוך כל אטם סיליקון על קרח. דגירה על קרח במשך 3 דקות (10% APS:10% TEMED:פתרון מונומר = 1:1:47).
  5. הגנו על הדגימה מפני אור והזיזו את הכיסוי בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי לג'לציה. כדי לשמור על הלחות של הג'ל במהלך הדגירה 37 מעלות צלזיוס, לכסות את צלחת פטרי עם המכסה, ולשים כמה טיפות מים בצלחת פטרי.

8. עיכול

  1. לאחר הג'לציה, הסר את הזכוכית כדי להפריד את הג'ל והעבר את הג'ל לצלחת 6 באר. לעכל תאים משובצים עם 2 מ"ל של חיץ עיכול (טבלה 1) בלילה בטמפרטורת החדר או 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. יש להשתמש בנפח עודף של לפחות פי 10 ממאגר העיכול.
  2. יש לשטוף ג'לים עם נפח מים עודף של פי 10 לפחות מנפח הג'ל הסופי. חזרו על שלב הכביסה ארבע פעמים למשך 20 עד 30 דקות בכל פעם. הג'ל מתרחב בערך פי שניים בכל ממד.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות ג'ל למשך עד חודש אחד במאגר PBS בטמפרטורה של 4 °C. החלף את כל המים שהתאדו כדי למנוע ייבוש, והגן על הדגימה מפני אור במהלך האחסון. כדי למנוע השפלה של עוגנים תלת-תפקודיים, יש להכתים דגימות בהקדם האפשרי לאחר העיכול והשטיפה.

9. צביעה פלואורסצנטית לאחר העיכול

  1. דגירה של ג'לים בנפח של 2 מ"ל של סטרפטווידין (STV)/דיגוקסיגנין (DIG) עם 2 עד 5 מיקרומטר STV-צבע ו/או צבע נגד DIG למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. שמור את הדוגמאות בחושך.

10. הרחבה

  1. יש לשטוף ולהרחיב את הג'ל ארבע פעמים עם עודף מים (2-3 מ"ל) למשך 30 דקות עד שעה בכל פעם.
  2. להדמיה קלה יותר של תאים תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הכתימו תאים עם DAPI במהלך השטיפה השלישית מתוך חמש. דילול ריכוז מלאי DAPI (5 מ"ג/מ"ל, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס) ב-1:5,000 דילולים במי שטיפה. דגירה של הג'ל עם תמיסת מים DAPI (2 מ"ל) למשך 30 דקות עד שעה.
  3. לשטוף פעמיים נוספות עם 3 מ"ל של מים.
  4. הרחיבו את הג'לים בכל מנה שטוחה שגדולה מספיק כדי להכיל את הדגימות. הג'לים המורחבים אשר מוכנים על 0.4ס" מ 2 שטח כיסוי זכוכית משתלבים יפה בתחתית זכוכית 6 - צלחת היטב.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות מוכתמות לאחר הרחבה למשך עד 4 חודשים במאגר PBS בטמפרטורה של 4° C. יש להוסיף כמות מספקת של מים כדי למנוע התייבשות ולהגן על הדגימה מפני הלבנת תמונות. חזור על שלב ההרחבה וצביעת DAPI לפני ההדמיה. כדי למנוע כל סיכון של השפלה פלואורופור, דגימות צריך להיות בתמונה בהקדם האפשרי.

11. הדמיה

  1. מצפים את תא ההדמיה התחתון מזכוכית 6 בארות עם 0.01% פולי-L-ליזין (3 מ"ל כל אחד) כדי לשתק את דגימות הג'ל.
  2. מעבירים דגימות ג'ל לתא ההדמיה המצופה.
  3. צלמו את הדגימות עם טווחי הפלואורסצנציה הרצויים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בורות מצופים קלתרין (CCPs) עוברים תהליך חיסוני באמצעות עוגנים תלת-תפקודיים (איור 1B) ו-LR-ExM מבוצע כמתואר באיור 1A. LR-ExM (איור 2C,E) מראה עוצמה פלואורסצנטית גבוהה בהרבה בהשוואה למיקרוסקופיית הרחבת שימור חלבונים (proExM, איור 2A) או ביוטין-ExM (איור 2B

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

החידוש העיקרי של LR-ExM הוא להשתמש בעוגנים תלת-תכליתיים כדי לתייג ביעילות את חלבוני המטרה ולשפר את איכות התמונה. שיטה זו מוגבלת על ידי עוגנים תלת-תפקודיים, שאינם זמינים כל כך לחוקרים. עם זאת, ניתן לשתף עוגנים תלת-שימושיים עם חוקרים אחרים על פי בקשה, ומוצרים דומים כגון בדיקות ExM של Chrometa זמינים כ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב (R00 GM126136 עד X.S.), הקרן הלאומית למדע של ארה"ב (DMS1763272 ל- S.P.) וקרן סימונס (594598 ל- S.P.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylamide Sigma A9099 ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearchH+L, 711–005-152Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson ImmunoResearchH+L, 712–005-153Antibody
Alexa Fluor 488-StreptavidinJackson ImmunoResearch016-540-084Fluorescent probes 
Alexa Fluor 594 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-580-084Fluorescent probes 
Alexa Fluor 647 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-600-084Fluorescent probes 
Ammonium Persulfate Sigma A3678 ExM Gel
anti-H3K4me3Abcamab8580Antibody
anti-H3K9me3Abcamab176916Antibody
DAPI dilacetateThermofisher ScientificD3571Fluorescent probes 
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)Vector LaboratoriesDI-7488Fluorescent probes 
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)Vector LaboratoriesDI-7594Fluorescent probes 
EGTAEMD Millipore Corp.324626-25GMFixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma EDTADigestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM GradeElectron Microscopy Sciences50-262-13Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglassGrace Bio-Labs GBL112358-8EACell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal toolGrace Bio-Labs GBL103259Removal tool
Guanidine HCl Sigma G3272 Digestion buffer
Magnesium chlorideSigmaM8266-1KGFixation buffer
McCoy's 5aATCC30–2007Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)Sigma 730300-1GAnchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibodyAbcamab24700Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide Sigma M7279 ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma T7024 ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionsElectron Microscopy Sciences50-980-487Fixation buffer
PIPESSigmaP6757-25GFixation buffer
Poly-L-LysineSigmaP8920-100MLChamber coating
Proteinase K Sigma-AldrichP4850-5MLDigestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibodyAbcamab21679Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2Millipore SigmaMAB1864-IAntibody
Sodium Acrylate Sigma408220ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kitVector LaboratoriesSP-2002Blocking buffer
Tris-HCl Life Technologies AM9855 Digestion buffer
U2OSATCCHTB-96Cell line
6 well glass bottom platesCellvisP06-1.5H-NImaging plate

References

  1. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  4. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  5. Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  9. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  10. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  11. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).
  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775(2021).
  13. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

188SNAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved