A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.
התגובות חוש הריח של הזחלים תסיסנית נחקרו באופן מסורתי בצלחות פטרי המהווים מקור יחיד ריח היקפי. בתוך פרדיגמה זו התנהגות, בדרך כלל הניסוי מניח כי דיפוזיה מהירה של מולקולות odorant ממקור מוביל ליצירת שיפוע יציב בצלחת. כדי ליצור התאמה כמותית בין תשומות חושי תגובות התנהגותיות, יש צורך להשיג אפיון מעמיק יותר של תנאי גירוי odorant. במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.
1. ציוד ריאגנטים
ריח דילולים:
Assay בזירה הגדרת:
הכנת תסיסנית הזחלים לבדיקות התנהגותיים:
הקלטה של תנועה הזחל:
2. ההתנהגות בזירה
הזירה התנהגות מורכבת משלושה מוערמים 96-היטב מכסים בצלחת. המכסה התחתון משמש כדי לבודד את שאר המערכת מהפנקס אור להפחית הסעה בזירה. המכסה השני, מכוסה 25ml של 3% agarose ג'ל, המשמש כבמה הזחלים ללכת. המכסה העליון מחזיק את טיפות ריח אשר נותרו תלויים על ידי מתח הפנים.
טיפות ריח הם pipetted ישירות לתוך הבארות של מכסה צלחת 96-היטב. מקורות ריח בודדות או מרובות ניתן להשתמש כדי ליצור מעברים הדרגתיים עם פרופילים שונים לאימות 2. כדי לבדוק תתרנות פגמים chemotaxis של זחלים, אנו מציעים להשתמש לאחר שני מבחני.
2.1. ריח יחיד assay מקור: טיפה ריח יחיד הניח את הבאר # E7 (תקן 96, גם מערכת התייחסות צלחת).
Assay זה ביעילות בדיקות תתרנות בסיסי הזחלים מוטציה. זה גם יכול לשמש כדי לקבוע באופן אמין את הסף לגילוי ריחות מסוימים 2.
2.2. ריח מרובים מקור assay
כמה טיפות ריח מוטלות היטב את המכסה העליון. במאמר הנוכחי וידאו, הקמנו הדרגתיים לאורך שורה E. מרכזי הכולל של שש טיפות הוכנסו בארות # E2, E4 #, # E6, # E8, E10 ו - # # E12 (תקן 96, גם מערכת התייחסות צלחת ). לעומת זאת עם צלחת פטרי אחת מבחני מקור הריח, assay מרובים מקור הריח מאפשרת שליטה איכותית של הגיאומטריה שיפוע הוקמה לאורך ורוחב של הזירה. Assay זה שימש כדי לאפיין את המנגנונים התחושתיים המאפשר הזחלים תסיסנית כדי chemotax 2.
3. פרופיל צבע אימות
לפני בדיקות זחלים ב שיפוע מסוים, חשוב לקבוע את יציבותו לאורך זמן. על בסיס זה, הנסיין יכול לקבוע את משך נאותה במשפט אחד ומספר הזחלים כי ניתן לעקוב ברצף בזירה אותו. כדי לבדוק את היציבות של השיפוע, פיתחנו שיטה המבוססת על ספקטרוסקופיית IR 2. שיטה זו היא מעבר להיקף של פרוטוקול זה לא יהיה עיבוד נוסף.
4. פרוטוקול להכנת ניסוי
4.1. הכנת צלחת agarose ו דילולים ריח:
הערות: כאשר ריכוזים נמוכים משמשים ריח, עדיף להכין סט של ריכוזי מקור המבוססת על דילולים סדרתי. התחל, למשל, עם פתרון 1.0m ולבצע דילול 01:02 כדי להשיג פתרון 0.5m. לפי הליך חוזר ונשנה, אחד מקבל סדרה דילול בעקבות 1.0m גיאומטרי, 0.5m, 0.25M, 0.12M, 0.06M, 0.03M, 0.015M.
חשוב: מאז ריחות אורגניים רבים מגיבים עם פלסטיק, דילולים ריח חייב להיות מאוחסן צלוחיות זכוכית עם טפלון כמוסות. באופן אידיאלי, ריחות יש להכין טרי לפני כל ניסוי כדי לצמצם תנודות ריכוז ריח בפועל על ניסויים. הדבר נכון במיוחד כאשר באמצעות כימיקלים נדיפים מאוד.
4.2. הזחלים הכנה:
5. פרוטוקול לבצע הקלטות התנהגותית
5.1. הגדרת ארנה:
5.2. טוען זחלים:
6. לדוגמה הניסויים הדגימו במאמר וידאו
6.1. ריח יחיד מקור assay עם 1.0m של אצטט isoamyl.
אנו בעיוורון נבדק ten Or83b-/ - מוטנטים ועשרה סוג הזחלים בר (W1118) כדי שכל אחד מהם מספר הוטל. הניסוי מעקבאה לא קיבלו שום מידע על הגנוטיפ של כל חיה. לאחר הקלטת כל פנוטיפ חזוי הוצב כל חיה נבדק: smellers, אם הצטברות נצפתה תחת המקור למשפט כולו; הלא smellers, אם הנתיב במהירות עזבו את השכונה של מקור הריח. לאחר הקליטה את התנהגותם של 20 בעלי חיים, שבילים קובצו לפי הפנוטיפ. התוצאה של קיבוץ זה הושווה אז עם גנוטיפ בפועל של הזחלים: עשה את כל המטלות נמצאו נכונים.
6.2. ריח מרובים מקור assay עם מילויים מעריכי ו ליניארי של אצטט isoamyl.
בניסוי זה, השווינו את הביצועים של הזחלים סוג בר chemotaxing לאורך ליניארי שיפוע אקספוננציאלי. התנהגויות Chemotactic נרשמו שתי gradients להגדיר עם הריכוז הגבוה ביותר של אותו 0.5m. כפי שהוסבר במאמר, מקורות ריח של שיפוע אקספוננציאלי נע בין 0.015 ו 0.5m. מקורות שיפוע ליניארית נע בין 0.25 ו - 0.5m (התקדמות חשבון משותף עם הבדל 0.05M).
שיפוע ליניארית ייצג chemotaxis סביבה מאתגרת יותר כמו ההבדל המקומית הריכוז היה קבוע קטן יחסית, וטווח ריכוז צר (0.25M). לעומת זאת, את טווח הריכוז של שיפוע אקספוננציאלי היה גדול עם הגדלת הבדלים מקומיים ריכוז לאורך השביל.
חמש עשרה זחלים נרשמו עבור כל אחד משני הגיאומטריות שיפוע ואת הנתיבים על גבי בגרף אחד. בדיקה ויזואלית של שני הגרפים מראה, כי הזחלים סוג בר הצליחו לעלות באופן מהימן את צבע עבור הגיאומטריות הן אלא כי כמות המתפתל היה גדול יותר עבור למצב שיפוע ליניארית. הדבר מצביע על כך נוכח אותות לאורך שיפוע מזוהה בצורה מהימנה יותר עבור צורה מעריכית מאשר אחד ליניארי.
6.3. ריח מרובים מקור assay עם שיפוע אצטט isoamyl בתוך הגיאומטריה "גג".
כאן אנו לוודא כי הזחלים הציג שיפוע ריח הרגישים לשינויים מקומיים ריכוז ריח ולא רק נוכחות או העדר ריח. שיפוע isoamyl הוקמה על ידי יישום של טיפות ריח עם הריכוזים הבאים: 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 0.25, 0.12M. הגיאומטריה הדרגתי שהתפתח דמה "גג" סימטרית peaking ב 0.5m.
הזחלים שוחררו בין טיפות ריח 0.06M לבין 0.12M. ההשערה שלנו הייתה שאם הזחלים היו רק מחשוב נוכחות של ריח הם יתחקו שיפוע כולו ללא העדפה מסוימת לכל היותר הריכוז. לעומת זאת, אם הזחלים רגישים לשינויים מקומיים בריכוז הם היו להצטבר מתחת אגל 0.5m. חמש עשרה זחלים נרשמו, נמצא כי לאחר תקופה קצרה גישוש הזחלים כל שהצטבר מתחת לריכוז גבוה יותר טוב. הדבר מצביע על שינויים מקומיים בריכוז ריח מחושבים ולהודיע התנהגות chemotactic של הזחלים תסיסנית.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ט הובר TP Sakmar לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של המוסד האמריקני הלאומי לבריאות בארה"ב כדי LBV וקרן הבלגי אמריקאי חינוכית וקרן Revson עד ML
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved