JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים מהכבד ואלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כריבונוקלאופרוטאינים ו-mRNA כדי לשבש גן מטרה טיפולי הקשור למחלה מטבולית תורשתית של הכבד. השיטות המתוארות מביאות לכדאיות גבוהה ולרמות גבוהות של שינוי גנים לאחר אלקטרופורציה.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים ולאחר מכן אספקה בתיווך אלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כריבונוקלאופרוטאינים (RNPs) ו-mRNA בתיווך אלקטרופורציה. הפטוציטים ראשוניים של עכברים בודדו בשיטת זלוף מדרדרת בת שלושה שלבים וכתוצאה מכך הופקו תשואות גבוהות של עד 50 × 106 תאים לכל כבד וכדאיות התאים של >85%. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות לציפוי, צביעה וגידול הפטוציטים. התוצאות מצביעות על כך שאלקטרופורציה מספקת יעילות טרנספקציה גבוהה של 89%, כפי שנמדדה על ידי אחוז התאים החיוביים לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) והכדאיות התאית הצנועה של >35% בהפטוציטים של עכברים.

כדי להדגים את התועלת של גישה זו, CRISPR-Cas9 המכוון לגן הידרוקסיפנילפירובט דיאוקסיגנאז התחשמל לתוך הפטוציטים ראשוניים של עכברים כעריכה גנטית הוכחה עקרונית כדי לשבש גן טיפולי הקשור למחלה מטבולית תורשתית (IMD) של הכבד. עריכה גבוהה יותר על המטרה של 78% נצפתה עבור RNPs לעומת 47% יעילות עריכה עם mRNA. הפונקציונליות של הפטוציטים הוערכה במבחנה באמצעות בדיקת אלבומין שהצביעה על כך שאספקת CRISPR-Cas9 כ-RNPs ו-mRNA גורמת לכדאיות דומה של תאים בהפטוציטים ראשוניים של עכברים. יישום מבטיח לפרוטוקול זה הוא יצירת מודלים של עכברים למחלות גנטיות אנושיות המשפיעות על הכבד.

Introduction

IMDs של הכבד הם הפרעות גנטיות המאופיינות על ידי מחסור של אנזים כבד חיוני המעורב בחילוף החומרים שמוביל להצטברות של מטבוליטים רעילים. ללא טיפול, IMDs של הכבד לגרום לאי ספיקת איברים או מוות בטרם עת 1,2. אפשרות הריפוי היחידה לחולים עם IMDs של הכבד היא השתלת כבד אורתוטופית, המוגבלת בשל הזמינות הנמוכה של איברים תורמים וסיבוכים מטיפול מדכא חיסון בעקבות ההליך 3,4. על פי נתונים שנאספו לאחרונה על ידי הרשת לרכש והשתלת איברים, רק 40%-46% מהחולים הבוגרים ברשימת ההמתנה להשתלת כבד מקבלים איבר, בעוד 12.3% מהחולים הללו מתים בזמן שהם ברשימת ההמתנה5. יתר על כן, רק 5% מכלל מחלות הכבד הנדירות יש טיפול שאושר על ידי ה- FDA6. ברור כי יש צורך קריטי בטיפולים חדשניים עבור IMDs של הכבד. עם זאת, נדרשים מודלים מתאימים למחלה כדי לפתח אפשרויות טיפוליות חדשות.

מידול מחלות אנושיות באמצעות מערכות in vitro ו - in vivo נותר מכשול לפיתוח טיפולים יעילים ולחקר הפתולוגיה של IMDs של הכבד. הפטוציטים מחולים עם מחלות כבד נדירות מאתגרים להשיג7. מודלים של בעלי חיים חיוניים לפיתוח הבנה של פתולוגיה של מחלות ולבדיקת אסטרטגיות טיפוליות. עם זאת, מכשול אחד הוא יצירת מודלים מעוברים הנושאים מוטציות קטלניות. לדוגמה, ניסיונות ליצור מודלים עכבריים של תסמונת אלג'יל (ALGS) עם עוברים המכילים מחיקות הומוזיגוטיות של רצף של 5 קילובייט ליד 5′-הקצה של הגן Jag1 הביאו למוות מוקדם של העוברים8. בנוסף, יצירת מודלים של עכברים על ידי עריכת גנים בתאי גזע עובריים יכולה להיות עתירת זמן ומשאבים9. לבסוף, מוטציות יופיעו מחוץ לרקמה הממוקדת, מה שיוביל למשתנים מבלבלים שעלולים לעכב את המחקר של המחלה9. עריכת גנים סומטיים תאפשר עריכה קלה יותר ברקמת הכבד ותעקוף את האתגרים הכרוכים ביצירת מודלים באמצעות תאי גזע עובריים.

אלקטרופורציה מאפשרת העברה של CRISPR-Cas9 ישירות לתוך הגרעין על ידי הפעלת זרמי מתח גבוה כדי לחדור לקרום התא ותואמת לסוגי תאים רבים, כולל אלה שאינם מתאימים לטכניקות טרנספקציה, כגון תאי גזע עובריים אנושיים, תאי גזע פלוריפוטנטיים ותאי עצב 10,11,12 . עם זאת, כדאיות נמוכה היא חיסרון פוטנציאלי של אלקטרופורציה; אופטימיזציה של ההליך יכולה להניב רמות גבוהות של מסירה תוך הגבלת רעילות13. מחקר שנערך לאחרונה מדגים את ההיתכנות של אלקטרופורציה של רכיבי CRISPR-Cas9 לעכברים ראשוניים ולהפטוציטים אנושיים כגישה יעילה ביותר14. אלקטרופורציה של Ex vivo בהפטוציטים יש פוטנציאל להיות מיושם כדי ליצור מודלים חדשים של עכברים עבור IMDs אנושיים של הכבד.

פרוטוקול זה מספק הליך מפורט שלב אחר שלב לבידוד הפטוציטים של עכברים מהכבד ולאחר מכן אלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כקומפלקסי RNP, המורכבים מחלבון Cas9 ו-RNA סינתטי חד-מנחה (sgRNA), או Cas9 mRNA בשילוב עם sgRNA כדי להשיג רמות גבוהות של עריכת גנים על המטרה. בנוסף, הפרוטוקול מספק שיטות לכימות היעילות, הכדאיות והפונקציונליות של עריכת גנים בעקבות אלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 להפטוציטים של עכברים שזה עתה בודדו.

Protocol

הניסויים בבעלי חיים בוצעו כולם בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ופרוטוקולים מאושרים באוניברסיטת קלמסון. הליכים כירורגיים בוצעו בעכברי C57BL/6J מורדמים מסוג פרא בגילאי 8 עד 10 שבועות.

1. ניתוח בעלי חיים

  1. הכנת פתרונות ומכשירים
    הערה: פתרונות פרפוזיה ומתכוני קוקטייל הרדמה מוצגים בטבלת החומרים.
    1. הכן את תמיסת פרפוזיה 1 (HEPES, EGTA ו- EBSS), תמיסת פרפוזיה 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl2 ו- MgSO4), ותמיסת פרפוזיה 3 (פתרון 2 וליבראז). ודא שהפתרונות מעורבבים היטב.
    2. קבעו את אמבט המים ל-42 מעלות צלזיוס והניחו לפני המלחמה פתרונות פרפוזיה 1, 2 ו-3 למשך 30 דקות לפחות לפני תחילת ההליך ושמרו אותם באמבט המים.
      הערה: פתרונות פרפוזיה 1 ו-2 יוציאו את הסידן וישטפו את הדם בכבד. תמיסת פרפוזיה 3 מכילה את אנזים העיכול ליבראז כדי לנתק את המטריצה החוץ-תאית.
    3. מניחים 150 מ"ל של DMEM + 10% סרום בקר עוברי (FBS) בצינורות חרוטיים ושומרים אותם על קרח.
      הערה: מדיום זה ישמש לשחרור התאים מכמוסת הכבד ולשטיפת הפטוציטים המבודדים בשלבים 2.1 ו-2.2, בהתאמה.
    4. הגדר את הצנטריפוגה ל- 4 °C (76 °F).
    5. מעקרים את צינורות המשאבה על ידי הנחת שני קצות הצינורות בבקבוקון מלא ב-70% אתנול ומחזור האתנול שלוש פעמים.
    6. שטפו את הצינורות במים מזוקקים ורוקנו אותם.
    7. מלאו את הצינורות ב-30 מ"ל של תמיסת פרפוזיה 1, ולאחר מכן 8 מ"ל של תמיסת פרפוזיה 2. אם לצינורות עדיין יש מקום לנוזלים נוספים, מלאו את שאר הצינורות ב-Perfusion Solution 3. עצרו את המשאבה בעת מעבר לתמיסת פרפוזיה אחרת כדי להימנע מהכנסת בועות אוויר לצינורות.
    8. הניחו את הצינורות העודפים באמבט המים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס כדי לשמור על חום תמיסות ההזלפה.
    9. מניחים את קצה צינור המשאבה בצינור החרוטי המכיל את תמיסת פרפוזיה 3, תוך שהם נשמרים באמבט המים.
      הערה: שלב זה נחוץ כדי לאפשר למשאבה להתמלא באופן רציף עם תמיסת פרפוזיה 3 במהלך זלוף.
  2. הכנת בעלי חיים
    1. הרדמה את העכבר על ידי הזרקת קוקטייל ההרדמה באופן תוך-צפקי במינון של 10-11.7 μL/g משקל גוף. בקוקטייל ההרדמה ריכוז סופי של 7.5 מ"ג/מ"ל קטמין, 0.25 מ"ג/מ"ל אקפרומזין ו-1.5 מ"ג/מ"ל קסילאזין.
    2. עקוב אחר נשימת העכבר ובדוק שהעכבר אינו מגיב לכאב. המתן עד שלעכבר יש קצב נשימה של כ-55-65 נשימות לדקה, אינו מגיב לצביטת בהונות רגליו, ויש לו זנב רפוי. בנוסף, בדקו את הרפלקס הפלברלי (המצמוץ) על ידי נגיעה קלה בעור בצד המדיאלי של העין הסגורה. אם העכבר ממצמץ או ששרירי העיניים מתעוותים, הגדילו את המינון של קוקטייל ההרדמה כולו ב-5-10 מיקרול'.
    3. הניחו את העכבר על גבו בתנוחה שכיבה והצמידו את הגפיים לפני השטח באמצעות סיכות או סרט הדבקה (איור משלים S1).
    4. מרססים את הבטן ב-70% אתנול וטפחים עליה יבשים באמצעות כדור צמר גפן.
  3. פרפוזיה בכבד
    1. בצע חתך רוחבי בצורת U בעור הבטן באמצעות מספריים והרחב את החור דרך הצדדים.
    2. ממשיכים לפתוח את העור לכלוב הצלעות.
    3. באמצעות מספריים, לחתוך דרך הצפק כדי לחשוף את חלל הבטן עד כלוב הצלעות, נזהר לא לנקות איברים. הזז את המעיים לצד ימין באמצעות גב המלקחיים או המשטח הקהה של מספריים. זהה את הווריד הנבוב התחתון ואת וריד הפורטל (איור משלים S1).
    4. הפעילו את המשאבה כדי לשטוף את תמיסת הזלוף המתוכננת מראש דרך הצנתר.
    5. עצרו את המשאבה והסירו את הצנתר לאחר שכל האוויר נשטף דרך המערכת. הכנס את קצה המחט המחוברת לצנתר לתוך הווריד הנבוב התחתון בזווית של 10°-20° לווריד. מוציאים את המחט מהקטטר ודוחפים בעדינות את הצנתר לתוך הווריד בתנועה מקבילה לווריד.
      הערה: על המשתמש לצפות בפלאשבק של דם בקטטר כדי לאמת תותח תקין בווריד.
    6. חברו את הצינורות לצנתר מבלי להזיז את הצנתר עוד יותר לתוך הווריד.
    7. התחילו את המשאבה בקצב זרימה של 2 מ"ל/דקה. חפשו את הכבד מיד הופך חיוור כסימן לכך שהזלוף מצליח.
    8. חותכים את וריד הפורטל באמצעות מספריים.
    9. הגדל בהדרגה את קצב הזרימה ל-5 מ"ל לדקה.
    10. הפעילו לחץ מעת לעת על וריד הפורטל באתר החיתוך המשוער במשך 3 שניות באמצעות מלקחיים או מטוש כותנה כדי לחסום את הניקוז ולהקל על זלוף טוב.
    11. לאחר שפתרון פרפוזיה 3 זורם, עקוב בקפידה אחר גמישות הכבד. כדי לקבוע אם הכבד מתרכך, לחץ בעדינות על הכבד עם צמר גפן או מלקחיים ובדוק אם נוצרות כניסות על הכבד. היזהרו שלא להפריז יתר על המידה כדי למנוע אובדן של כדאיות התא.
    12. לאחר ריכוך הכבד (המתרחש לאחר 30-50 מ"ל של תמיסת פרפוזיה 3 זרם דרך), לעצור את המשאבה, להסיר את הצנתר, ולנתח בזהירות את הכבד. מכניסים את הכבד לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ המכילה מדיום DMEM קר כקרח + 10% FBS. לבלות את כיס המרה, להיזהר לא לשפוך את תוכנו. סובבו את צלחת הפטרי כדי להסיר בעדינות קרישי דם אפשריים.
    13. מעבירים את הכבד לצלחת פטרי חדשה המכילה DMEM קר כקרח + 10% FBS בינוני.

2. בידוד הפטוציטים

  1. שחררו תאים מקפסולת הכבד.
    1. מניחים את צלחת הפטרי על הקרח ומשתמשים בשני זוגות מלקחיים סטריליים, קורעים בעדינות לגזרים את כמוסת הכבד על כל האונות. סובבו בעדינות את הכבד במדיום באמצעות מרים תאים או מלקחיים כדי לשחרר את ההפטוציטים. המשך בתנועה זו עד שהכבד הופך להיות קטן מאוד והמתלים הופכים חומים ואטומים.
    2. הסר את שרידי רקמת הכבד מהצלחת ובאמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל המוגדרת למהירות נמוכה, העבר בזהירות את תרחיף התא לצינור חרוטי של 50 מ"ל (prechilled על קרח) המצויד במסנן תאים של 100 מיקרומטר.
    3. הוסיפו מדיום DMEM + 10% FBS רענן וקר כקרח לצלחת פטרי כדי לשטוף ולאסוף את התאים הנותרים מפני השטח ולהעביר לצינור החרוטי של 50 מ"ל. חזור על שלב זה עד לאיסוף כל התאים.
  2. לשטוף ולטהר hepatocytes מתאים שאינם פרנצ'ימליים.
    1. צנטריפוגה התאים שנאספו בצינור החרוטי 50 מ"ל ב 50 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות בהאטה נמוכה או ללא כל בלמים.
    2. יש להשליך את הסופרנטנט המכיל פסולת ותאים לא-פרנכימליים ולהחזיר את הכדור לשאריות הסופרנאטנט על ידי סיבוב עדין של הצינור. לאחר החזרת הכדור, הוסיפו 30 מ"ל של מדיום DMEM טרי וקר כקרח + 10% FBS בינוני.
    3. חזור על הצנטריפוגה (שלב 2.2.1) והשטיפה (שלב 2.2.3) שלוש פעמים.
    4. בצעו שימוש חוזר בכדור התא הסופי ב-10 מ"ל של מדיום DMEM קר כקרח + 10% FBS בינוני.
      הערה: נפח המדיום המשמש להחייאה של הכדור תלוי בגודל הכדור. אם הכדור קטן משמעותית מ-15 מ"מ, השתמש ב-1-5 מ"ל של מדיום DMEM קר כקרח + 10% FBS.
  3. כימות הכדאיות של התא
    1. בצינור מיקרופוג', הוסיפו 50 μL של תמיסת טריפאן כחולה של 0.4% ל-350 μL של מדיום ציפוי הפטוציטים (PM). לאחר מכן, הוסיפו 100 μL של תרחיף התא כדי לבצע דילול סופי של 1:5 ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב.
    2. ספירת צפיפות התאים וכדאיותם באמצעות המוציטומטר. תוך כדי ספירה, מניחים את תרחיף הפטוציטים על הקרח, ואז מניחים את דלי הקרח על שייקר מסלולי שנקבע ל-30 סל"ד כדי למנוע מהפטוציטים להתיישב.
    3. עקוב אחר שלבי הטיפול והצנטריפוגה של פרקול להלן אם כדאיות התא היא <70%.
      1. דילול פרקול עם 10x מלח בעל מאגר פוספט (PBS) ביחס של 9:1.
      2. מערבבים את תרחיף הפטוציטים עם הפרקול המדולל ביחס של 1:1.
      3. צנטריפוגה ב 200 × גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות.
      4. יש להשליך את הסופרנט המכיל תאים מתים. בצעו החייאה של הכדור ב-DMEM קר כקרח + 10% FBS בינוני.
      5. ספרו שוב את התאים.
  4. בדיקת הפטוציטים לצורך צלחתיות
    1. צלחת חלק מהתאים על צלחות קולגן מצופות I 6-well בצפיפות של 0.5 × 106 תאים למ"ל באמצעות 1.5 מ"ל של PM מתוכנן מראש.
    2. שמור את התאים הנותרים על קרח בזמן שהם על שייקר מסלולי עד שהם מוכנים לבצע אלקטרופורציה.
    3. הניחו את צלחת התאים באינקובטור CO2 עם ציפוי מים ב-37 מעלות צלזיוס. הזיזו את הצלחת בצורה אופקית ואנכית בעדינות בתנועה מצפון לדרום וממזרח למערב כדי להבטיח ציפוי הומוגני. חזור על התנועה פעמיים נוספות כל 1.5 שעות.
    4. אמת את חיבור התא ב-3 שעות לאחר הציפוי.
      הערה: לפחות 60% מהתאים צריכים לדבוק בצלחת כאינדיקטור להפטוציטים באיכות טובה.
    5. שנה את המדיום למדיום תחזוקת הפטוציטים לפני המלחמה (MM) ב-24 שעות לאחר הציפוי כדי לשמור על התאים בתרבית.
  5. צביעת גליקוגן
    1. לאחר שהתאים התחברו ל-6 צלחות הקולגן המצופות I, הסירו את המדיום המושקע מהתאים בתרבית.
    2. תקן את התאים במשך 10-15 דקות באתנול קר כקרח.
    3. יש לשטוף היטב במים סטריליים.
    4. דגירה ב-1% חומצה מחזורית מימית למשך 5 דקות ולאחר מכן שטפו במים סטריליים.
    5. דגירה ב-100% שיף ריאגנט למשך 30 דקות.
      הערה: אין לדלל את המגיב של שיף לפני שמוסיפים לתאים.
    6. לשטוף עם מים שלוש פעמים מעל 10 דקות.
    7. הר במדיום הרכבה.
    8. תמונה באמצעות מיקרוסקופ על הגדרת שדה בהיר.

3. תכנון sgRNAs לעריכת גנים CRISPR-Cas9

הערה: חלק זה מתאר את התכנון של sgRNA המכוון לגן הידרוקסיפנילפירובט דיאוקסיגנאז (Hpd) של העכבר כעריכה גנטית הוכחה עקרונית כדי לשבש גן מטרה טיפולי הקשור ל-IMD של הכבד.

  1. תכנן את רצף המדריך המכוון ל - Hpd באמצעות התוכנה המופנית15.
  2. אמת את הרצף עבור Hpd באמצעות דפדפן Ensembl Genome.
  3. השתמש בפרמטרים הבאים לתכנון ה-gRNA: אורך מדריך יחיד של 20 נוקלאוטידים ורצף NGG (N יכול להיות כל נוקלאוטיד) של מוטיבים סמוכים לפרוטוספייסר (PAM).
  4. בחר אזור יעד מתוך exon 3 ב- Hpd.
  5. צור רשימה של רצפי מדריכים מאזור היעד עם ציוני יעד ומחוץ ליעד.
    הערה: ציון היעד מציין את יעילות העריכה החזויה ביעד עבור העיצוב הנתון: ציון גבוה יותר מתואם עם יעילות עריכה גבוהה יותר. ציון מחוץ ליעד תואם את הספציפיות של רצף המדריך: ציון גבוה יותר מציין הסתברות נמוכה יותר לעריכה מחוץ למטרה. באופן אידיאלי שני הציונים צריכים להיות גבוהים: הציון על היעד >60, והציון מחוץ ליעד >50.
  6. בחר את רצף המדריך עם הציונים הגבוהים ביותר ביעד וביעד מחוץ ליעד. בקשו מה-sgRNA המכיל את רצף המדריך להיות מסונתז כימית.

4. אלקטרופורציה ותרבית תאים

  1. הכנת מצעי CRISPR-Cas9, מדיה, תאים ומכשיר האלקטרופורציה
    1. הוסיפו את כל התוספת הנלווית ל-PM וחממו באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. הפעל את התקן האלקטרופורציה על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה והגדר את תוכנית האלקטרופורציה על ידי לחיצה על כפתור x ולאחר מכן על כפתור החץ למטה עד שהתוכנית T-028 תופיע על המסך.
    3. הכן את בארות היעד עבור הפטוציטים אלקטרופורציה על ידי הוספת 1.5 מ"ל של PM לצלחות קולגן מצופות I של שישה בארות. דוגרים את הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לשימוש.
    4. מוסיפים את כל התוסף הנלווה לתמיסת חיץ האלקטרופורציה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
      הערה: סמן את תאריך התפוגה של מאגר האלקטרופורציה על הבקבוקון (3 חודשים לאחר תאריך תוספת התוספת).
    5. הסר את כלי האלקטרופורציה מהאריזה ותייג אותם עבור כל דגימה.
    6. בצינורות PCR מפוצלים, הכינו את מתחמי Cas9 RNP על ידי שילוב של 30 מיקרוגרם של sgRNA עם 300 pmol של חלבון Cas9 ודגמו את הקומפלקסים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הכן את ה- Cas9 mRNA על ידי שילוב של 30 מיקרוגרם של sgRNA עם 4 μL של Cas9 mRNA (1 מיקרוגרם / μL). אחסנו את תערובת ה-mRNA-sgRNA על קרח עד לאלקטרופורציה. הכן בנפרד צינור המכיל 1.0 מיקרוגרם של mRNA eGFP כדי לאמת אלקטרופורציה מוצלחת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
    7. צנטריפוגה 1.2 × 106 תאים לכל תגובת אלקטרופורציה ב 100 × גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (74 °F).
    8. הסר את הסופרנאטנט מכדור התא והוסף 100 μL של תמיסת אלקטרופורציה לכל תגובה לאורך דופן הצינור. החייאת הפטוציטים בתמיסת האלקטרופורציה על ידי נדנדת הצינור בעדינות ביד.
  2. אלקטרופורציה של רנ"א קריספר-Cas9 ו-mRNA להפטוציטים
    1. ברגע שההפטוציטים מופיעים מפוזרים באופן שווה בתמיסת האלקטרופורציה, העבירו 100 μL של תרחיף הפטוציטים לצינורות הרצועה המכילים את מתחמי Cas9.
      הערה: השתמש בעצות פיפטה רחבות משקל בעת העברת הפטוציטים כדי לשמור על כדאיות התאים.
    2. להעביר את התוכן של הרצועה היטב לכלי אלקטרופורציה.
    3. מקם את כלי הנוקליאובט לתוך החריץ במכשיר האלקטרופורציה. אלקטרופורציה של הפטוציטים על ידי לחיצה על כפתור x . לאחר אלקטרופורציה, המתן עד שמסך יופיע במכשיר שכתוב עליו אישור. לחץ שוב על כפתור x והסר את כלי השיט.
    4. דגירה של כלי הדם האלקטרו-פוסע על קרח למשך 15 דקות.
    5. הוסף 500 μL של PM מוכן מראש לכלי האלקטרופורציה.
    6. העבר 300 μL של תגובת האלקטרופורציה לכל יעד היטב על הלוח המחומל מראש.
      הערה: צריכות להיות שתי בארות יעד לכל תגובת אלקטרופורציה. באר אחת תשמש לכימות יעילות עריכת גנים; הבאר השנייה תשמש למבחני MTT ואלבומין.
    7. כדי למנוע מהפטוציטים להצטבר במרכז הבאר, פזרו את התאים על ידי הזזה עדינה של לוחות אופקית ואנכית בתנועה מצפון לדרום וממזרח למערב. יש לוודא שהצלחת שומרת על קשר עם מדף האינקובטור בזמן הזזתו. חזור על תנועה זו ב 15, 30, 45, 60, ו 90 דקות לאחר ציפוי hepatocytes electroporated.
    8. דגירה של הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    9. הסר את המדיום מהבארות המיועדות לניתוח עריכת גנים 24 שעות לאחר ציפוי התאים, והחלף בשכבת-על של מטריצת ממברנת מרתף של 0.25 מ"ג/מ"ל.
      הערה: אם אתה מאוחסן במקפיא, העבר את מטריצת הממברנה ל- 4 °C (7 °F) ואפשר לה להפשיר. מכיוון שמטריצת קרום המרתף מוצקה מעל 10 מעלות צלזיוס, חיוני שמטריצת קרום המרתף תישאר על קרח או ב-4 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לשימוש.

5. חשב את הנפח של מטריצת הממברנה כדי לערבב עם MM כדי לתת ריכוז סופי של 0.25 מ"ג / מ"ל

הערה: עבור צלחת של 6 בארות, יש צורך ב-2 מ"ל של שכבת-על לכל באר.

6. הוסף את הנפח המחושב של מטריצת הממברנה ל- MM קר כקרח וערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים

  1. פיפטה את תערובת הכיסוי באיטיות על גבי התאים, והניחה את הצלחת בחזרה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  2. החליפו את המדיום במדיום תחזוקה טרי כל 24 שעות.
  3. בשעה 24 שעות לאחר הציפוי, העבירו את המדיום המותנה מהבאר המיועדת למבחני MTT ואלבומין. אחסנו את המדיום המותנה בצינור מיקרופוג'ה עד שיהיו מוכנים לביצוע בדיקת האלבומין. המשך לשלב 7.1 עבור בדיקת MTT.
    הערה: אחסן את המדיום המותנה ב- 4 °C (7 °F) לאחסון לטווח קצר (פחות מיום). לאחסון ארוך יותר, אחסן את המדיום בטמפרטורה של -80 °C (80 °F).

7. ניתוח יעילות האספקה, הכדאיות והעריכה על המטרה בהפטוציטים של עכברים אלקטרופורים

  1. מדידת כדאיות באמצעות בדיקת MTT
    1. הכן תמיסת מלאי 12 mM MTT על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS לבקבוקון אחד של 5 מ"ג MTT.
    2. הוסף 150 μL של תמיסת מלאי MTT לבארות ודגירה למשך 24 שעות.
    3. לאחר הדגירה, מוסיפים 1.5 מ"ל של תמיסת נתרן דודציל סולפט-הידרוכלוריד (SDS-HCl) לכל באר ולאחר מכן פיפטה לערבוב.
    4. דגירה של הצלחת למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחפשו שינוי בצבע המדיום מבהיר לסגול כדי לציין תאים בני קיימא.
    5. ערבבו שוב כל דגימה באמצעות פיפטה וקראו את הספיגה ב-570 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
    6. חשב את הכדאיות המנורמלת עבור דגימות שטופלו ב-Cas9 באמצעות Eq (1):
      figure-protocol-14415 (1)
  2. בדיקת אלבומין להערכת פונקציונליות הפטוציטים
    1. מעבירים 50 μL של המדיום המותנה לבארות בצלחת המסופקות על ידי ערכת האלבומין. מכסים את הבארות ודוגרים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
    2. שטפו את הבארות 5x עם 200 μL של מאגר כביסה.
    3. הפכו את הצלחת כדי לרוקן כל באר על נייר טישו והקשו כמה פעמים.
    4. לאחר הכביסה, יש להוסיף 50 μL של הנוגדן הביולוגי המסופק בערכת בדיקת האלבומין לכל באר ולדגום בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
    5. חזור על שלבים 5.2.2-5.2.3 כדי לשטוף את הבארות.
    6. הוסיפו 50 μL של סטרפטווידין-פרוקסידאז המסופקים בערכת בדיקת האלבומין לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    7. חזור על שלב 5.2.2.
    8. הוסיפו 50 μL של מצע הכרומוגן המסופק בערכת בדיקת האלבומין לכל באר ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הקישו בעדינות על הצלחת כדי להבטיח ערבוב אחיד. הסר את כל בועות האוויר עם קצה פיפטה.
    9. לבסוף, הוסף 50 μL של תמיסת עצירה לכל באר וחפש שינוי צבע מצהוב לכחול כדי לציין תאים פונקציונליים.
    10. המשך מיד לקריאת הספיגה במהירות של 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטה.
  3. הערך את יעילות האספקה בבארות עם eGFP mRNA.
    1. ללכוד ניגודיות פאזה ותמונות פלואורסצנטיות ירוקות של הפטוציטים 24 שעות לאחר אלקטרופורציה. צלם שלוש תמונות במיקומים שונים בתוך הבאר.
    2. העלה תמונות של התאים ל- ImageJ. תחת הכרטיסיה תמונה , בחר הקלד | 16 סיביות כדי להמיר תמונה לגווני אפור.
    3. כדי לסמן מבני תאים בתמונה, תחת הכרטיסיה תמונה , בחר התאם | סף. התאם את המחוון כדי לסמן תאים.
    4. תחת הכרטיסיה תהליך , בחר חיסור רקע כדי להסיר רעשי רקע.
    5. ספור את התאים על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ניתוח ולאחר מכן בחר נתח חלקיקים. לחץ על אישור כדי ליצור רשימה של חלקיקים שנספרו.
    6. חשב את אחוז התאים החיוביים ל-GFP על-ידי חלוקת מספר החלקיקים הנספרים בתמונות הפלואורסצנטיות הירוקות במספר החלקיקים שנספרו בתמונת ניגודיות הפאזה המתאימה.
  4. ניתוח פעילות Cas9 ביעד
    1. לחלץ דנ"א גנומי מתאים אלקטרופורים.
      1. יש להסיר את המדיום מהצלחת 3 ימים לאחר האלקטרופורציה, ולהוסיף 500 μL של 0.25% טריפסין. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. פיפטה מספר פעמים לאחר הדגירה כדי להבטיח שהפטוציטים התנתקו מהצלחת.
      2. מעבירים את תרחיף התאים הטריפסיניים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה ומסובבים בצנטריפוגה שולחנית ב-800 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, בדוק את הצינורות עבור גלולות.
      3. הסר את ה-supernatant המכיל טריפסין על ידי צנרת. הקפידו לא להפריע לכדור. בצעו החייאה של הכדור ב-80 μL של תמיסת מיצוי DNA. אם הכדור קשה לראות, resuspened את התוכן של הצינור ב 50 μL של תמיסת מיצוי DNA.
      4. מערבולת במשך 30 שניות כדי להבטיח שהכדור יוחזר. מעבירים את המתלים לצינורות PCR עם פסים מפוצלים ומניחים אותם ברכיבה התרמית. לרוץ במשך 15 דקות ב 95 °C (95 °F) ו 8 דקות ב 68 °C (68 °F).
    2. PCR-להגביר את הלוקוס על המטרה.
    3. בצע את ההליך המתואר להלן להגברת אזור המטרה של HPD באמצעות DNA פולימראז.
      1. הכן תגובה המכילה 0.5 μL של 10 mM dNTPs, 0.5 μL של 10 μM פריימר קדימה, 0.5 μL של 10 μM פריימר הפוך, 0.125 μL של Taq פולימראז, 5 μL של DNA גנומי שהופק מהפטוציטים, ו-18.375 μL של מים נטולי נוקלאז. ראה טבלה משלימה S1 עבור רצפי פריימרים.
      2. בקצרה מערבולת במהירות צנטריפוגה תערובת PCR כדי להבטיח כי הפתרון הוא בתחתית הצינור.
      3. מקם את תערובת ה- PCR ברכיבה תרמית והגבר בתנאים אלה: 94 ° C עבור 30 שניות עבור denaturation, 30 מחזורים של 94 ° C עבור 30 s, 57 ° C עבור 45 s עבור חישול, 68 ° C עבור 1 דקה, והרחבה סופית של 68 ° C למשך 5 דקות.
        הערה: טמפרטורת החישול עבור תגובת ה- PCR תשתנה בהתאם להרכב הפריימרים. שקול להשתמש במחשבון טמפרטורת התכה לפני ביצוע PCR.
      4. כדי לאשר את גודל המוצר הנכון, יש לערבב 3 μL של מוצרי PCR עם 2 μL של מים ו 1 μL של 6x צבע. הפעילו על ג'ל אגרוז 1.5% ואשרו את גודל המוצר הנכון.
    4. לטהר את הדנ"א באמצעות חרוזים מגנטיים.
      הערה: עמודות ספין יכולות לשמש גם לניקוי PCR. להלן נהלים לטיהור מוצרי PCR באמצעות חרוזים מגנטיים.
      1. הסר חרוזים מגנטיים מ-4 מעלות צלזיוס ואפשר להם להגיע לטמפרטורת החדר.
      2. בקצרה מערבולת במהירות צנטריפוגה תערובת PCR.
      3. הוסף נפח של חרוזים השווה ל- 1.8× נפח תערובת ה- PCR. פיפט את תערובת חרוזי ה-PCR פי 10 כדי להבטיח שהפתרון מעורבב באותה מידה.
      4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
      5. מעבירים את תערובת חרוזי ה-PCR לצלחת PCR ומניחים אותה על צלחת מגנטית.
      6. דגירה של הצלחת על המגנט למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, בדקו שהתמיסה ברורה, והחרוזים קשורים למגנט לפני המעבר לשלב הבא.
      7. השליכו את הסופרנאטנט.
      8. מוסיפים 200 μL של 70% אתנול לבאר ודגירה למשך 30 שניות.
        הערה: יש להכין את האתנול של 70% זמן קצר לפני ביצוע הניקוי כדי למנוע אובדן DNA.
      9. יש להשליך את ה-supernatant ולחזור על שלב 7.4.4.8.
      10. מסירים את חומר העל ומאפשרים לייבוש במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר עקבות של אתנול.
      11. הסר את הצלחת מהמגנט והוסף 22 μL של מים לדגימה. פיפטה למעלה ולמטה 10x כדי לערבב מים וחרוזים.
      12. דגירה של הדגימות למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
      13. מעבירים את הצלחת בחזרה למגנט ומדגרים למשך 3 דקות או עד שהתמיסה ברורה.
      14. העברת 20 μL של הדגימה לצינור PCR. דאגו לכך שלא יינשאו חרוזים.
    5. רצף דנ"א מטוהר אמפליקון על ידי ריצוף סנגר.
    6. העלה קבצי רצף .ab1 עבור דגימות מטופלות ובקרה (לא מטופלות) למעקב אחר אינדלים על ידי פירוק (TIDE)16 כדי לכמת את האינדלים באתר היעד.

תוצאות

בידוד של הפטוציטים ראשוניים הניתנים לציפוי מהכבד
התהליך הכולל של זלוף בכבד ובידוד הפטוציטים מודגם באיור 1. בניסוי זה נעשה שימוש בעכברי C57BL6/6J בני 8-10 שבועות. ההליך צפוי להניב 20-50 × 106 תאים לכל עכבר עם כדאיות של בין 85% ל-95%. אם הכדאיות היא <70%, יש לעקוב אחר טיפול פר?...

Discussion

השלבים המתוארים בפרוטוקול לבידוד הפטוציטים הם מאתגרים ודורשים תרגול לצורך מיומנות. ישנם מספר שלבים מרכזיים לבידוד מוצלח של הפטוציטים מהכבד. ראשית, שימור תקין של הווריד הנבוב התחתון קאווה חיוני לזלוף מלא בכבד. היעדר ההדבקה בכבד לאחר הזלוף מצביע על תזוזה של הצנתר (טבלה 1). הווריד הנ...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

Acknowledgements

RNC קיבלה מימון ממרכז הביו-הנדסה של דרום קרוליינה להתחדשות ויצירת רקמות מענק פיילוט הנתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) של המכונים הלאומיים לבריאות, האגודה האמריקאית לחקר מחלות כבד הקרן, והחברה האמריקאית לטיפול בגנים ותאים תחת מספרי מענק P30 GM131959, 2021000920, 2022000099, בהתאמה. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של האגודה האמריקאית לתרפיה גנטית ותא או האגודה האמריקאית לחקר הקרן לחקר מחלות כבד. הסכימה עבור איור 1 נוצרה עם BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, naturalUSA Scientific1402-4700
6-well Collagen PlatesAdvanced Biomatrix5073
accuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
All-in-one Fluorescent MicroscopeKeyenceBZ-X810
Analog Vortex MixerVWR97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µLThermoFisher Scientific2079GPK
Automated Cell CounterBio-Rad LaboratoriesTC20
Blue Wax Dissection TrayBraintree Scientific Inc.DTW19" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifterArgos TechnologiesUX-04396-53Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL)Fisher Scientific339650
Conical tubes (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Cotton applicatorsFisher Scientific22-363-170
Curved scissorsCooper Surgical62131
Disposable Petri DishesFalcon351029100mm,sterile
Disposable Petri DishesVWR25373-10035mm, sterile
Epoch Microplate SpectrophotometerBioTek Instruments250082
Falcon Cell strainer (70 µm)Fisher Scientific08-771-2
ForcepsCooper Surgical61864Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters BD38261224 G x 0.75 in
IV infusion setBaxter2C6401
MyFuge 12 Mini CentrifugeBenchmark Scientific1220P38
NeedlesFisher Scientific05-561-2025 G
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic PumpMasterflex HV-77120-4210 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubingMasterflexHV-96410-1425 ft, silicone
Primaria Culture PlatesCorning Life Sciences353846Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL)Fisher Scientific12-567-604
SyringesBD3294641 mL, sterile
T100 Thermal CyclerBio-Rad Laboratories1861096
Water bathALT27577Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mLFisher ScientificNC9959336
CleanCap Cas9 mRNATrilink BiotechnologiesL-7606-100
CleanCap EGFP mRNATrilink BiotechnologiesL-7201-100
Corning Matrigel MatrixCorning Life Sciences356234
DMEMThermoFisher Scientific11885076Low glucose, pyruvate
Ethanol 70%VWR71001-652
Fetal bovine serumThermoscientific26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM)LonzaMM250
Hepatocyte Plating Medium (PM)LonzaMP100
Mouse Albumin ELISA KitFisher ScientificNC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector KitLonzaVPL-1004
OneTaq HotStart DNA PolymeraseNew England BiolabsM0481L
PBS 10x pH 7.4 Thermoscientific70011-044No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution)Santa Cruz Biotechnologysc-500790A
Periodic acidSigma-AldrichP7875-25G
Permount Mounting MediumVWR100496-550
QuickExtract DNA Extraction SolutionLucigen CorporationQE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagentSigma-AldrichS5133
Trypsin-EDTA (0.25%)ThermoFisher Scientific25200056Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability AssayThermoFisher ScientificV13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) Stable at 4 °C for 2 months
EBSSFisher Scientific14155063Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M)Bioworld40520008-1200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM)SigmaC7902-500G360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)Fisher Scientific14-155-063Complete to 200 mL
HEPES (1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM)Sigma30391-25G160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3 Prepared fresh prior to use
Solution 250 mL
LiberaseRoche54011270010.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine0.25 mg/mL final concentration
Ketamine7.5 mg/mL final concentration
Xylazine1.5 mg/mL final concentration
SoftwareURL
Benchlinghttps://www.benchling.com/
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decompositionhttps://tide.nki.nl/

References

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. . OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019)
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2022)
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M., Tanguay, R. M. . Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved