JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מפרט טיהור של KIF1A(1-393LZ), חבר במשפחת קינזין-3, באמצעות מערכת ביטוי Sf9-baculovirus. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של מנועים מטוהרים אלה הפגין תכונות תנועתיות חזקות הדומות למנועים של ליזאט תאי יונקים. לפיכך, מערכת Sf9-baculovirus היא מקובלת להביע ולטהר חלבון מוטורי של עניין.

Abstract

סביבה תאית מורכבת מציבה אתגרים לניתוח תנועתיות של מולקולה בודדת. עם זאת, ההתקדמות בטכניקות ההדמיה שיפרה את המחקרים על מולקולות בודדות וצברה פופולריות עצומה באיתור והבנה של ההתנהגות הדינמית של מולקולות המתויגות על-ידי פלואורסצנט. במאמר זה נתאר שיטה מפורטת למחקרי מולקולה בודדת במבחנה של מנועים ממשפחת קינסין-3 באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF). Kinesin-3 היא משפחה גדולה הממלאת תפקידים קריטיים בתפקודים תאיים ופיזיולוגיים, החל מהובלת מטענים תוך-תאיים, דרך חלוקת תאים ועד להתפתחות. הראינו בעבר שמנועי קינזין-3 דימריים פעילים באופן מכונן מפגינים תנועתיות מהירה וסופר-מעבדית עם זיקה מיקרוטובולית גבוהה ברמת המולקולה הבודדת באמצעות ליזטים תאיים שהוכנו על ידי ביטוי מוטורי בתאי יונקים. המעבדה שלנו חוקרת מנועי קינסין-3 ומנגנוני הוויסות שלהם תוך שימוש בגישות תאיות, ביוכימיות וביופיזיקליות, ומחקרים כאלה דורשים חלבונים מטוהרים בקנה מידה גדול. ביטוי וטיהור של מנועים אלה באמצעות תאי יונקים יהיה יקר וגוזל זמן, בעוד שביטוי במערכת ביטוי פרוקריוטית הביא לחלבון מצטבר ולא פעיל באופן משמעותי. כדי להתגבר על המגבלות שמציבות מערכות טיהור חיידקים וליזה של תאי יונקים, הקמנו מערכת ביטוי חזקה של Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר את המנועים האלה. מנועי הקינזין-3 מתויגים באופן סופי ב-C עם חלבונים פלואורסצנטיים בעלי 3 טנדם (3xmCitirine או 3xmCit) המספקים אותות משופרים והפחתת הלבנה. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של חלבונים מטוהרים מדגם Sf9 מראה כי מנועי קינזין-3 הם מהירים וסופר-מעבדים בדומה למחקרים קודמים שלנו שהשתמשו בליסאטות של תאי יונקים. יישומים אחרים המשתמשים במבחנים אלה כוללים ידע מפורט על תנאי אוליגומרים של מנועים, שותפים מחייבים ספציפיים המקבילים למחקרים ביוכימיים, ומצבם הקיני.

Introduction

סביבת תאים צפופה מאוד מציבה אתגרים רבים במיון חלבונים ומולקולות מיועדים. עומס עבודה אינטנסיבי זה של ארגון והפצה מרחבית-טמפורלית של מולקולות בתוך הציטופלסמה מתאפשר על ידי מנועים מולקולריים ומסלולים ציטוסקטליים. מנועים מולקולריים הם האנזימים שמבצעים הידרוליזה של מטבעות האנרגיה כגון ATP ומנצלים אנרגיה זו במהלך תנועה ויצירת כוח1. בהתבסס על הדמיון ברצף חומצות האמינו, קינסינים מקובצים ל-14 משפחות ולמרות הדמיון הזה, כל מנוע תורם באופן ייחודי לתפקוד התא. מנועי משפחת קינסין-3 מהווים את אחד הגדולים ביותר, הכולל חמש תת-משפחות (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 ו- KIF28)2, הקשורות למגוון תפקודים תאיים ופיזיולוגיים, כולל הובלת שלפוחית, איתות, מיטוזה, הגירה גרעינית ופיתוח 3,4,5. פגיעה בתפקוד ההובלה של קינזין-3 כרוכה בהפרעות נוירודגנרטיביות רבות, פגמים התפתחותיים ומחלות סרטן 6,7,8,9.

עבודות אחרונות הראו כי מנועי קינזין-3 הם מונומרים אך עוברים דימריזציה הנגרמת על ידי מטען וגורמים לתנועתיות מהירה וסופר-תהליכית בהשוואה לקינסיןקונבנציונלי 10,11,12,13. האפיון הביוכימי והביופיזי שלהם זקוק לכמות גדולה של חלבונים מטוהרים ופעילים. עם זאת, הייצור שלהם במערכת הביטוי הפרוקריוטית הביא למנועים לא פעילים או מצטברים, ככל הנראה בשל סינתזת חלבונים, קיפול ושינוי מכונות 14,15,16,17,18 שאינן תואמות. כדי לעקוף מגבלות כאלה ולהגדיל את התשואה, כאן הקמנו מערכת ביטוי חזקה Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר את המנועים האלה.

מערכת הביטוי של baculovirus משתמשת בקווי תאי חרקים Sf9 כמערכת מארחת לביטוי חלבון רקומביננטי אאוקריוטי בעל תפוקה גבוהה19,20. ל-Baculovirus יש מקדם פוליהדרין חזק המסייע בביטוי גנים הטרולוגיים ובייצור חלבונים רקומביננטיים מסיסים17. בשל עלותו החסכונית, בטיחותו לטיפול וכמות גבוהה של ביטוי חלבון פעיל, הוא הפך לכלי רב עוצמה21. כדי לבטא חלבון בעל עניין, צעד מפתח הוא ליצור בסיס רקומביננטי. מכיוון שערכות ייצור הבקמיד הזמינות מסחרית הן יקרות ואנחנו נעבוד עם דגימות נוספות, פיתחנו פרוטוקול פנימי לתוספות גדולות וקטנות של מנועי קינזין-3 לתוך bacmids. מנועי קינזין-3 מטוהרים Sf9 שימשו לאפיון תכונות גלישה של מיקרוטובול מיקרו-מבחנה חד-מבנית ורב-מנועית באמצעות מיקרוסקופיית השתקפות פלואורסצנטית פנימית כוללת (TIRF). מנועים מתויגים באופן סופי C עם מולקולות פלואורסצנטיות 3-טנדם (3xmCit) כדי לספק אות משופר והפחתת הלבנת פוטו. בשל יחס אות לרעש מוגבר, פחות פוטוטוקסיות והדמיה סלקטיבית של אזור קטן מאוד קרוב לכיסוי, נעשה שימוש נרחב בהדמיית TIRF כדי לדמיין דינמיקה של חלבונים ברמת המולקולה הבודדת in vivo ו- in vitro.

מחקר זה דן בטיהור מנועי קינסין-3 על ידי שימוש במערכת ביטוי Sf9-baculovirus והדמיית מולקולה בודדת במבחנה וניתוח גלישה רב-מוטורית של מנועים באמצעות מיקרוסקופיית TIRF. בסך הכל, מחקר זה מראה כי תכונות התנועתיות של מנועים מטוהרים Sf9 זהות לאלה של מנועים שהוכנו מליסאטות של תאי יונקים. לפיכך, אנו מאמינים כי ניתן להתאים את מערכת Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר כל חלבון מוטורי בעל עניין.

Protocol

1. תרבית, טרנספקציה ויצירת וירוסים Sf9

הערה: שמור על תאי Sf9 ב-30 מ"ל של מדיום Sf-900/SFM בבקבוקון חרוטי סטרילי וחד-פעמי של 100 מ"ל ללא כל אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. שמור על תרבות המתלים בשייקר מסלולי ב-90 סל"ד. אין צורך באספקת CO2 ותחזוקת לחות. תאים הם בדרך כלל תת תרבית כל יום רביעי על ידי חיסון 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל כדי להגיע 2.0 x 106 תאים / מ"ל צפיפות ביום הרביעי.

  1. יצירת מלאי וירוסים P0
    1. לצורך טרנספקציה, תאי זרעים לתוך צלחת 35 מ"מ עם 4.5 x 105 תאים / מ"ל מפגש ולשמור על 28 מעלות צלזיוס ללא רעידות.
    2. לאחר 24 שעות, ברגע שהתאים מחוברים ונראים בריאים, המשיכו להעברה כמתואר להלן.
      1. צינור A: ערבבו 1 מיקרוגרם של קידוד DNA בקמיד עבור מנוע KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG ספציפי kinesin-3 עם 100 μL של המדיה של גרייס שלא הוכרעה.
      2. צינור B: ערבבו 6 μL של מגיב טרנספקציה עם 100 μL של מדיה של גרייס שלא הוכרעה.
      3. העבירו בזהירות את התוכן של Tube A לתוך Tube B וערבבו היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה (כ-20 פעמים).
      4. לדגור את התערובת במשך ~ 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לאחר השלמת הדגירה, יש להוסיף 0.8 מ"ל של מדיה של גרייס ללא תוספת לתערובת הנ"ל ולערבב באיטיות על ידי פיפטה.
    4. שאפו בעדינות את מדיית Sf-900/SFM מתאים (כדי להסיר עקבות של סרום שעלולים להשפיע על יעילות ההעברה).
    5. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה משלב 1.1.3 טיפה על החלק העליון של התאים ומדגרים את הצלחת במשך 6 שעות ב-28 מעלות צלזיוס.
    6. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את תערובת הטרנספקציה, הוסף 2 מ"ל של מדיה Sf-900/SFM ודגרה נוספת במשך 48 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
    7. בדוק את ביטוי החלבון המוטורי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. החלבון המוטורי מתויג עם חלבון פלואורסצנטי, mCitrine, גרסה של חלבון פלואורסצנטי צהוב.
      הערה: תאים שעברו טרנספקציה הודגמו תחת מיקרוסקופ הפוך המצויד בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ותאורת אפיפלואורסצנציה עם מטרה של פי 20 (הגדלה של פי 200), מנורת כספית ומצלמת EM-CCD. בדוק את היעילות של יצירת וירוסים וזיהום על ידי ניטור הביטוי של מנועים מתויגים mCitrine בתאים באמצעות עירור mCitrine וקוביית מסנן פליטה. בנוסף, בדקו אם קיימים שינויים מורפולוגיים של תאים נגועים, כגון תאים/גרעינים מוגדלים (איור 1A-C).
    8. שוב, בדוק את התאים 72 שעות לאחר ההדבקה. בדרך כלל, תאים מתחילים להתנתק מפני השטח (איור 2).
    9. אם >5% מהתאים מנותקים מפני השטח, קצרו את המדיה עם תאים נגועים בצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים של 1.5 מ"ל והסתובבו במשך 5 דקות ב-500 x גרם.
    10. אסוף את ה-supernatant והקפיא את ה-aliquots של 1 מ"ל בחנקן נוזלי ואחסן כמלאי P0 בטמפרטורה של -80°C או השתמש בו כדי ליצור מלאי וירוסים P1.
  2. יצירת מלאי וירוס P1
    1. כדי להגביר עוד יותר את מלאי ה-P0 baculovirus ולאשר את ביטוי החלבון, לגדל תאי Sf9 בתרבית תרחיף נוזלי.
    2. בבקבוק חרוטי סטרילי של 100 מ"ל, הוסף 10 מ"ל של מדיה Sf-900/SFM עם צפיפות תאים של 2 x 106 תאים למ"ל ו-1 מ"ל של מלאי וירוסים P0. דגירה ב-28°C עם רעידות קבועות ב-90 סל"ד.
    3. לאחר 72 שעות של זיהום, בדוק את ביטוי החלבון כפי שתואר קודם לכן (שלב 1.1.7). אם ביטוי החלבון טוב (>90% מהתאים מראים אות פלואורסצנטי בהיר של mCitrine) ומראה מוות תאי משמעותי (בערך 10%-15%), סובבו את התאים בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל בגודל 500 x g למשך 5 דקות.
    4. אסוף את ה-supernatant, הקפאה מהירה של 1 מ"ל (מלאי P1) בחנקן נוזלי ואחסן בטמפרטורה של -80°C או המשך לזיהום בקנה מידה גדול ולטיהור חלבונים.
  3. זיהום בקנה מידה גדול
    1. לביטוי חלבונים בקנה מידה גדול, יש להדביק 30 מ"ל של תרבית התרחיף בצפיפות של 2 x 106 תאים /מ"ל עם 1 מ"ל של מלאי נגיפי P1 ולדגור ב-28 מעלות צלזיוס עם רעידות קבועות ב-90 סל"ד.
    2. לאחר ~ 72 שעות לאחר ההדבקה, בדוק את ביטוי החלבון (באופן כללי, ביטוי חלבון מקסימלי מושג בין 65-75h לאחר ההדבקה).
    3. אם >90% מהתאים מראים אות פלואורסצנטי בהיר עם מוות תאי מינימלי (<5%), אספו את התאים בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל והסתובבו כלפי מטה בטמפרטורה של 500 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: צריך להיות מוות תאי מינימלי (<5%), מכיוון שתאים מתים משחררים את תוכן התאים למדיה, מה שמוביל לאובדן של חלבון מבוטא.
    4. השליכו את הסופרנטנט, אספו את גלולת התא והמשיכו בטיהור החלבון.

2. טיהור Sf9 של מנועי קינזין-3

  1. לכדור התא הנ"ל, הוסיפו 3 מ"ל של חיץ תזה קר כקרח (טבלה משלימה 1) בתוספת טרייה של 5 mM DTT, 5 מיקרוגרם/מ"ל של אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל של לאופטין, ו-5 מיקרוגרם/מ"ל של PMSF והניחו את התאים על ידי פיפטינג 20-25 פעמים מבלי ליצור בועות אוויר. עבור כל הרכבי החיץ והריאגנטים, עיין בטבלה משלימה 1.
  2. סובב את התא ליזאט ב 150,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. אסוף את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה וסטרילית וערבב עם ~ 40 μL של שרף זיקה נגד FLAG M2. דגירה של התערובת במשך 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם רעידות מקצה לקצה.
  4. לאחר הדגירה, גלולה שרף FLAG על ידי סיבוב ב 500 x g במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו בעדינות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור עם מחט של 26 גרם והשליכו אותו.
  5. יש לשטוף את גלולת השרף FLAG שלוש פעמים עם חיץ שטיפה קר כקרח (טבלה משלימה 1) בתוספת טרייה של 2 mM DTT, 5 מיקרוגרם/מ"ל של אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל של לאופטין ו-5 מיקרוגרם/מ"ל של PMSF. גלולה את החרוזים על ידי סיבוב ב 500 x גרם במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס בכל כביסה.
  6. לאחר הכביסה השלישית, מסננים בזהירות את חיץ הכביסה ככל האפשר מבלי להפריע לכדור. עבור elution חלבון, להוסיף ~ 70 μL של מאגר לשטוף המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל פפטיד FLAG גלולה שרף ו דגירה לילה ב 4 °C עם tumbling מקצה לקצה.
  7. ביום שלאחר מכן, לסובב את השרף ב 500 x גרם במשך 1 דקה ב 4 מעלות צלזיוס. יש לאסוף את הסופרנטנט המכיל חלבון מטוהר לתוך שפופרת טרייה ולהשלים עם 10% גליצרול. יש להקפיא אליקוטים של 5 μL בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
  8. הפעל את ג'ל SDS-PAGE כדי לקבוע את ריכוז החלבון ותפוקתו. יחד עם חלבון מטוהר של עניין, בקרת חלבון סטנדרטית, BSA של ריכוזים ידועים הנעים בין 0.2 מיקרוגרם, 0.4 מיקרוגרם, 0.6 מיקרוגרם, 0.8 מיקרוגרם ו 1 מיקרוגרם נטענים כדי ליצור עקומה סטנדרטית. הכתימו את הג'ל בכחול מבריק של Coomassie (איור 3).
  9. נתחו את הג'ל באמצעות כלי כימות ג'ל מובנה בתוכנת ImageJ. ראשית, מדדו את עוצמת הפסים של ריכוזים ידועים של BSA וצרו את העקומה הסטנדרטית. לאחר מכן, מדדו את עוצמת רצועת החלבון המטוהרת וקבעו את ריכוז החלבון. לשם כך פתח את תוכנת Image J, לחץ על נתח אפשרות בשורת התפריטים ובחר ג'לים בתפריט הנפתח.

3. בדיקת תנועתיות מולקולה בודדת במבחנה באמצעות מנועי קינזין-3 מטוהרים Sf9

הערה: ניתן להשתמש במנועי קינסין-3 המטוהרים Sf9 כדי לחקור תכונות ביוכימיות וביופיזיות כגון קצב תחלופת ATP, זיקת מיקרוטובולים, מהירות, אורך ריצה, גודל צעד ויצירת כוח. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לניתוח תנועתיות מולקולה בודדת במבחנה של KIF1A(1-393LZ) באמצעות מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת פלואורסצנטית (TIRF). עבור כל הרכב המאגרים והריאגנטים, עיין בטבלה משלימה 1.

  1. פילמור מיקרוטובול
    1. בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש של 0.5 מ"ל, הכינו תערובת פילמור על ידי פיפטינג בסדר הבא: 12.0 מיקרוליטר של חיץ BRB80, pH 6.9; 0.45 מיקרון ליטר של 100 mM MgCl2, 1 μL של 25 mM GTP.
    2. מוציאים 10 μL aliquot של 10 מ"ג/מ"ל טובולין המאוחסן בחנקן נוזלי, מפשירים מיד ומוסיפים לתערובת הפילמור הנ"ל. מערבבים בעדינות על ידי צנרת 2-3 פעמים מבלי ליצור בועות אוויר.
      הערה: בצע את השלבים לעיל במהירות ובקפדנות על קרח.
    3. תנו לתערובת הנ"ל לשבת על קרח למשך 5 דקות.
      הערה: זהו צעד קריטי כדי למנוע דנטורציה של טובולין או כדי למנוע היווצרות של זרעי microtubule קצרים.
    4. מעבירים את הצינור לבלוק חום/אמבט מים מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך 30 דקות לפילמור מיקרוטובולים.
    5. בזמן שהמיקרוטובולים מתפלמרים, הפשירו מאגר של P12 והביאו אותו לטמפרטורת החדר.
    6. לפני השלמת 30 דקות של דגירה, התחל להכין חיץ ייצוב MT על ידי הזרמת 100 μL של חיץ P12 לתוך צינור microcentrifuge טרי. לשם כך, מוסיפים 1 μL של 1 mM טקסול ומיד מערבלת את התערובת.
      הערה: התחל להכין את מאגר ייצוב MT כ-5 דקות לפני השלמת הדגירה בשלב 3.1.4. טקסול מייצב את המיקרוטובולים הפולימריים על ידי קשירה ל-β-טובולין.
    7. מחממים את חיץ הייצוב של המיקרוטובול למשך 2-3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומוסיפים אותו בעדינות למיקרוטובולים הפולימריים מבלי להפריע לתערובת הפילמור בתחתית.
      הערה: חימום חיץ הייצוב יביא אותו לאותה טמפרטורה כמו תערובת הפילמור.
    8. אין להקיש או לפיפטה על התערובת ולדגור עוד יותר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    9. מקישים בעדינות על התערובת ומערבבים אותה עם קצה חתוך משופע (קיבולת של 200 μL) באיטיות באמצעות הפיפטה.
      הערה: מנקודה זו והלאה, טפל תמיד במיקרוטובולים עם קצה חתך משופע כדי למנוע גזירה של מיקרוטובול.
    10. קח 10-15 μL של מיקרוטובולים פולימריים בתא זרימה כדי לבדוק פילמור תקין של מיקרוטובולים.
      הערה: ניתן לדמיין את המיקרוטובולים ללא תווית באמצעות הגדרת מיקרוסקופיית DIC.
    11. אם מרוכזים מיקרוטובולים, דיללו אותם במאגר P12 בתוספת טקסול של 10 מיקרומטר.
  2. הכנת תא תא זרימה תנועתיות
    1. הכינו תא תנועתיות באמצעות מגלשת זכוכית, סרט הדבקה דו-צדדי וכיסוי זכוכית (22 מ"מ x 30 מ"מ).
    2. קח מגלשת זכוכית, הנח טיפה (~ 70 μL) של מים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה באמצע ונגב אותם עם נייר טישו ללא מוך.
    3. חותכים שתי רצועות של סרט דו-צדדי (~ 35 x 3 מ"מ) ומדביקים אותן בחוזקה לשקופית הזכוכית במקביל, משאירים רווח של ~ 4-5 מ"מ בין שתי רצועות כדי ליצור מעבר צר.
    4. לאחר מכן, קח כיסוי והוסף טיפה (~ 20 μL) של מים מזוקקים deionized באמצע. הניחו רצועה של נייר טישו לניקוי עדשות ללא מוך על טיפת המים עד שהיא סופגת את המים. לאחר מכן, החליקו אותו באיטיות לעבר קצה אחד של הכיסוי.
      הערה: הכיסוי צריך להיות יבש לחלוטין. אין לראות מים על הכיסוי.
    5. הניחו את הכיסוי על הרצועות הדו-צדדיות שנתקעו על המגלשה ולחצו על הכיסוי באופן שווה לאורך הרצועות כדי להידבק בחוזקה.
      הערה: ודא שהצד הנקי של הכיסוי פונה למגלשת הזכוכית.
    6. ודא שיחד זה יוצר תא צר של קיבולת של 10-15 μL לביצוע בדיקת תנועתיות (איור 4A).
  3. מבחן תנועתיות של מולקולה בודדת במבחנה
    הערה: כדי לחקור את תכונות התנועתיות מבוססות המיקרוטובול של מולקולות בודדות של מנועים, יש לספוח מיקרוטובולים על משטח הכיסוי בתא התנועתיות.
    1. דילל את המיקרוטובולים המיוצבים בטקסול פולימרי במאגר P12 בתוספת טקסול של 10 μM ביחס של 1:5 וערבב על ידי פיפטינג איטי עם קצה משופע.
    2. שמור על תא הזרימה במצב נטוי (~15-20°). הזרם 30 μL של תמיסת מיקרוטובול מדולל דרך תא הזרימה מהקצה העליון תוך שמירה על נייר טישו ללא מוך בקצה התחתון לספיגת הנוזל. פעולה זו יוצרת כוח גזירה ליישור המיקרוטובול בכיוון הזרימה ומסייעת לספוח את המיקרוטובולים ישר וליישר במקביל.
    3. השאירו טיפה קטנה של נוזל בשני קצות התא ושמרו על תא הזרימה במצב הפוך (כיסוי הפונה לתחתית) בתא סגור ולח כדי למנוע ייבוש של תא התנועתיות.
    4. תן לו לשבת במשך ~ 30 דקות, כך microtubules ספיחה על פני השטח של כיסוי להחליק בתוך תא תנועתיות.
    5. בינתיים, הכן את מאגר החסימה על ידי ערבוב 500 μL P12-BSA מאגר עם 5 μL של 1 mM טקסול.
    6. זרימה 40-50 μL של מאגר חוסם ודגירה של המגלשה במצב הפוך במשך 10 דקות בתא לח.
    7. הכן את תערובת התנועתיות על ידי צינורית הרכיבים הבאים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בקיבולת 500 μL בסדר הבא: 25 μL של חיץ P12 עם טקסול, 0.5 μL של 100 mM MgCl2, 0.5 μL של 100 mM DTT, 0.5 μL של 20 מ"ג / מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 0.5 μL של 8 מ"ג / מ"ל קטלאז, 0.5 μL של 2.25 M גלוקוז, ו 1.0 μL של 100 mM ATP.
      הערה: הדמיה פלואורסצנטית נמצאת בשימוש נרחב עבור יישומים ביולוגיים 22,23,24,25,26. פוטו-אקסצייטציה של חלבונים פלואורסצנטיים יוצרת מיני חמצן תגובתי (ROS), מה שעלול לגרום לפוטו-הלבנה של החלבונים הפלואורסצנטיים ולפגיעה בדגימות הביולוגיות27,28. אוכלי נבלות חמצן כגון גלוקוז, גלוקוז אוקסידאז וקטלאז משמשים באופן שגרתי במבחני תנועתיות כדי להגביל את הפוטו-דאם ולהאריך את זמן ההלבנה של חלבונים פלואורסצנטיים.
    8. לבסוף, הוסיפו 1 μL של המנוע המטוהר לתערובת התנועתיות הנ"ל וערבבו היטב לפני שתזרמו לתא התנועתיות.
    9. אטמו את שני הקצוות של תא התנועתיות עם שעוות פרפין נוזלית ומיד צלמו תחת תאורת TIRF באמצעות יעד TIRF 100X של 1.49 NA עם הגדלה של פי 1.5.
    10. על מנת למקד את משטח הכיסוי, ראשית, התמקדו באחד הקצוות הפנימיים של סרט הדבקה דו-צדדי בתא התנועתיות תחת תאורת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC).
      הערה: המשטח הבהיר והלא אחיד יהיה גלוי.
    11. לאחר מכן, העבר את המיקוד לתא התנועתיות. באמצעות כוונון עדין, מקד את משטח הכיסוי וחפש את המיקרוטובולים הנספגים על משטח הכיסוי.
    12. לאחר שהמיקרוטובולים ממוקדים, עברו לתאורת TIRF עם לייזר עירור של 488 ננומטר והתאימו את עומק ההארה על ידי שינוי זווית קרן העירור כדי לקבל את תאורת ה-TIRF הטובה והאחידה ביותר (איור 4B).
    13. מקד את המנועים הבודדים המתויגים על-ידי mCitrine הנעים באופן תהליכי לאורך משטח המיקרוטובול בחשיפה של 100 אלפיות השנייה והקלט את התנועה באמצעות מצלמת EM-CCD.
      הערה: למרות שמבחני התנועתיות בוצעו על מיקרוטובולים ללא תווית, ניתן להשתמש בפונקציית ההטלה z בעוצמה המרבית כדי לחשוף את קווי המתאר של מסלול המיקרוטובול. באופן מועדף, אירועים על מסלולי מיקרוטובול ארוכים נחשבו לניתוח מעקב.
    14. עקוב באופן ידני אחר מיקומם של מנועים בודדים המתויגים באופן פלואורסצנטי ההולכים על מסלולי מיקרוטובול ארוכים מסגרת אחר מסגרת באמצעות תוסף שנכתב בהתאמה אישית בתוכנת ImageJ (nih.gov) כפי שתואר קודםלכן 29.
    15. צור את ההיסטוגרמות של מהירות ואורך ריצה עבור אוכלוסיית המנוע על ידי התוויית מספר האירועים בכל סל. התאימו את ההיסטוגרמות האלה לפונקציית שיא גאוס יחידה כדי לקבל מהירות ממוצעת ואורך ריצה12 (איור 4C-E).

4. בדיקת גלישה במיקרוטובול במבחנה

הערה: כדי להבין את ההתנהגות הקולקטיבית של מנועי קינזין-3, בדיקת גלישה במיקרוטובול במבחנה בוצעה 18,30,31. כאשר מנועים משותקים על הכיסוי במצב הפוך, וכאשר מוסיפים מיקרוטובולים לתא, מיקרוטובולים נוחתים על מנועים וגולשים הלאה בזמן שהמנועים מנסים ללכת עליהם (איור 5A,B).

  1. פולימריזציה של מיקרוטובולים פלואורסצנטיים: פילמר את המיקרוטובולים בהתאם לפרוטוקול שתואר קודם לכן, למעט ערבוב רובולין המסומן ברודמין (3 מ"ג/מ"ל) עם טובולין ללא תווית (10 מ"ג/מ"ל) ביחס של 1:10.
  2. לאחר 30 דקות של פילמור, הוסיפו בעדינות 30 μL של חיץ ייצוב מיקרוטובול שחומם מראש ודגרו עוד יותר במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר מכן, גזירת המיקרוטובולים על ידי פיפטינג עם קצה העמסת הנימים (~25-30 פעמים).
  4. הכינו את תא זרימת התנועתיות כפי שתואר קודם לכן, זרמו 50 μL של ננו-גופי GFP מטוהרים Sf9 (2.5 μL של 100 ננומטר מדולל ב-50 μL של חיץ P12) ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כאשר הכיסוי פונה כלפי מטה בתא לח.
    הערה: המנועים מתויגים באופן סופי C עם mCitrine. ננו-גופים GFP משמשים לשיתוק המנועים בשל קבוע הדיסוציאציה הנמוךשלהם 32.
  5. חסום את משטח הכיסוי על ידי הזרמת 50 μL של מאגר בלוקים לתוך תא הזרימה כדי למנוע ספיחת חלבונים לא ספציפיים ודגרה נוספת במשך 5 דקות.
  6. הכן את תערובת המנוע על ידי צינורות 50 μL של חיץ בלוק, 1 μL של 100mM ATP, ו 5 μL של 100 nM Sf9 מטוהרים קינזין -3 מנועים. מערבבים בעדינות לפני הזרימה לתוך התא ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
  7. שטפו את התא פעמיים עם 50 מיקרו-ליטר של קזאין P12.
  8. בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי, הכינו את תערובת בדיקת הגלישה בסדר הבא, 45 μL של P12-casein עם 10 μM טקסול, 1 μL של 100 mM ATP, 0.5 μL של 8 מ"ג / מ"ל קטלאז, 0.5 μL של 20 מ"ג / מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 0.5 μL של 2.25 M גלוקוז ו 1 μL של מיקרוטובולים פלואורסצנטיים גזוזים. מערבבים בעדינות את התוכן לפני הזרימה לתוך תא התנועתיות ואוטמים את קצות התא עם שעוות פרפין נוזלית.
  9. מיקרוטובול תמונה גולש תחת תאורת TIRF בחשיפה של 100 אלפיות השנייה וצלם את התמונות באמצעות מצלמת EM-CCD מחוברת.
    הערה: מהירות הגלישה הממוצעת של מיקרוטובול נקבעה על-ידי מעקב ידני אחר כ-100 מיקרוטובולים בודדים מסגרת אחר מסגרת באמצעות תוסף שנכתב בהתאמה אישית ב-ImageJ29. קבעו את מהירות הגלישה הממוצעת של מיקרוטובולים על ידי יצירת היסטוגרמה והתאמה לפונקציית גאוס (איור 5C,D).

תוצאות

כדי לבטא ולטהר חלבונים מוטוריים רקומביננטיים פעילים ופונקציונליים בקנה מידה גדול באמצעות הביטוי Sf9-baculovirus, המערכת זקוקה ליצירת חלקיקים נגיפיים הנושאים ביציבות רצף קידוד כדי להדביק תאי Sf9. כדי להשיג זאת, תאי Sf9 הומרו עם קידוד רקומביננטי של הבקמיד KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. לאחר 72 שעות, אוכלוסייה משמעו?...

Discussion

מערכת הביטוי Sf9-baculovirus היא אחת השיטות הרב-תכליתיות והמוצלחות ביותר לייצור חלבונים בתפוקה גבוהה 19,36,37. יכולת השינוי לאחר ההעברה של תאי Sf9 דומה מאוד למערכת היונקים15. חסרון ניכר בשימוש במערכת זו הוא שהיא איטית ורגישה לזיהום. אחד ה...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים להצהיר.

Acknowledgements

V.S. ו- P.S. מודים לפרופ' קריסטן ג'יי ורהי (אוניברסיטת מישיגן, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב) ולפרופ' רופ מאליק (המכון ההודי לטכנולוגיה בומביי (IITB), מומבאי, הודו) על תמיכתם ללא תנאי לאורך כל המחקר. נ.ב. מודה לד"ר סיבפריה קירובקאראן על תמיכתה לאורך כל הפרויקט. V.S. מאשרת מימון באמצעות DBT (מענק מס': BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 ו-BT/RLF/Re-entry/45/2015) ו-DST-SERB (מענק מס': ECR/2016/000913). P.K.N מאשרת את ICMR למימון (מענק מס' 5/13/2019/NCD-III). נ.ב. מאשרת מימון משעון הקיץ (מענק מס': SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S מכיר במלגה מ- IIT Gandhinagar.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502For protein purification
AprotininSigmaA6279For protein purification
CellfectinInvitrogen10362100For Sf9 transfection
DTTSigmaD5545For motility assays and protein purification
FLAG peptideSigmaF3290For protein purification
GlycerolSigmaG5516To freeze the protein
HEPESSigmaH3375For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896For Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541For buffers preparation
LeupeptinSigmaL2884For protein purification
MgCl2SigmaM2670For buffers preparation
NaClSigmaS7653For preparing lysis buffer
PMSFSigmaP7626For protein purification
Sf9 cellsKind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottlesThermo Scientific4115-0125For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlFor culturing Sf9 cells
SucroseSigmaS1888Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlFor Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATPSigmaA2647For motility and gliding assay
BSASigmaA2153For blocking motility chamber
CatalaseSigmaC9322For motility and gliding assay
DMSOSigmaD5879For dissolving Rhodamine
EGTASigma3777For preparing buffers
GlucoseSigmaG7021For motility and gliding assay
Glucose oxidaseSigmaG2133For motility and gliding assay
GTPSigmaG8877For microtubule polymerization
KOHSigmaP1767Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needleDispovanFor shearing microtubules
CaseinSigmaC3400For microtubule glidning assay
GFP nanobodiesGift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)For attaching motors to the coverslip
RhodamineThermo Scientific46406For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tipsEppendorfFor Sf9 culture and purification
15ml concal tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
35mm cell culture dishCole Palmer15179-39For Sf9 culture
BalanceSartorious0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubatorREMIFor Sf9 suspenculture at 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897For TIRF imaging and acquesition
Double sided tapeScotchFor making motility chamber
Glass coverslipFisherfinest12-548-5Asize; 22X30
Glass slideBlue StarFor making motility chamber
Heating blockNeuationDissolving paraffin wax
Inverted microscopeNikon Eclipse Ti- UTo check protein expression
Lasers488nm (100mW)For TIRF imaging
Liquid nitrogenFor sample freezing and storage
Microcapillary loading tipEppendorfEP022491920For shearing microtubules
MicroscopeNikon Eclipse Ti2-E with DIC set upFor TIRF imaging
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdFor quick spin
Objective100X TIRF objective with 1.49NA oil immersionFor TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterFor protein purification
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430To adjust pH
Pipette-boyVWRFor Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificFor protein purification
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificProtein purification
ThermoMixerEppendorfFor microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubesBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixerNeuationSample mixing
WaxSigmaV001228To seal motility chamber

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved