טכניקות מולקולריות ואימונולוגיות במודל עכבר מהונדס גנטית של גידול סטרומלי במערכת העיכול

Summary

מטרת כתב יד זה היא לתאר את מודל העכבר ^{Kit V558Δ/+} ואת הטכניקות לניתוח ועיבוד מוצלחים של דגימות עכברים.

Abstract

גידול סטרומלי במערכת העיכול (GIST) הוא הסרקומה האנושית הנפוצה ביותר והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה אחת בקולטן KIT. על פני סוגי גידולים, פותחו מודלים רבים של עכברים על מנת לחקור את הדור הבא של הטיפולים בסרטן. עם זאת, ב- GIST, רוב מחקרי in vivo משתמשים במודלים של עכברי קסנוגרפט שיש להם מגבלות מובנות. כאן, אנו מתארים מודל עכברי בעל יכולת חיסונית, מהונדס גנטית, של גידול סטרומלי במערכת העיכול עם מוטציה של Kit^V558Δ/+ . במודל זה, KIT המוטנטי, האונקוגן האחראי על רוב ה-GISTs, מונע על ידי המקדם האנדוגני שלו המוביל ל-GIST המחקה את המראה ההיסטולוגי ואת החדירה החיסונית שנראית ב-GISTs אנושיים. יתר על כן, מודל זה שימש בהצלחה כדי לחקור הן טיפולים מולקולריים ממוקדים והן טיפולים חיסוניים. כאן, אנו מתארים את הרבייה והתחזוקה של מושבת ^{עכברים Kit V558Δ/+} . בנוסף, מאמר זה מפרט את הטיפול והרכש של GIST, ניקוז בלוטות לימפה מזנטרית, וצקום צמוד בעכברי Kit^V558Δ/+ , כמו גם הכנה לדוגמה לניתוחים מולקולריים ואימונולוגיים.

Introduction

GIST היא הסרקומה הנפוצה ביותר בבני אדם עם שכיחות של כ -6,000 מקרים בארצות הברית של אמריקה¹. נראה כי מקורו של GIST בתאי קוצב הלב במערכת העיכול הנקראים תאי הביניים של קאג'אל, והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה בודדת בטירוזין קינאז KIT או PDGFRA². ניתוח הוא עמוד התווך של הטיפול ב- GIST ויכול להיות מרפא, אך חולים עם מחלה מתקדמת עשויים להיות מטופלים עם מעכב טירוזין קינאז (TKI), imatinib. מאז הצגתו לפני למעלה מ-20 שנה, אימטיניב שינתה את פרדיגמת הטיפול ב-GIST, ושיפרה את ההישרדות במחלות מתקדמות מ-1 ליותר מ-5 שנים ^3,4,5. למרבה הצער, imatinib הוא רק לעתים רחוקות מרפא בשל מוטציות KIT נרכש, ולכן יש צורך בטיפולים חדשים עבור גידול זה.

מודלים של עכברים הם כלי מחקרי חשוב בחקר טיפולים חדשניים בסרטן. מספר מודלים תת עוריים של קסנוגרפט וקסנוגרפט שמקורם בחולה פותחו ונחקרו ב-GIST ^6,7. עם זאת, עכברים אימונו-יעילים אינם מייצגים באופן מלא את ה-GIST האנושי מכיוון ש-GISTs הם בעלי פרופיל חיסוני דיפרנציאלי בהתאם למוטציה האונקוגנית שלהם, ושינוי המיקרו-סביבה של הגידול במערכת העיכול משפר את ההשפעות של טיפול TKI ^8,9. לעכבר Kit^V558Δ/+ יש מחיקה של חיידק הטרוזיגוטי ב-Kit exon 11, המקודדת את תחום ה-juxtamembrane, האתר בעל המוטציה הנפוצה ביותר ב-GIST¹⁰ האנושי. עכברי Kit^V558Δ/+ מפתחים GIST סקאל יחיד עם 100% חדירה, ולגידולים יש היסטולוגיה דומה, איתות מולקולרי, חדירה חיסונית ותגובה לטיפול כמו GIST ^8,11,12,13 אנושי. כאן, אנו מתארים רבייה, טיפול ובידוד ועיבוד דגימות בעכברי Kit^V558Δ/+ לשימוש במחקר מולקולרי ואימונולוגי ב- GIST.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העכברים שוכנו בתנאים נטולי פתוגנים באוניברסיטת פנסילבניה על פי הנחיות NIH ובאישור אוניברסיטת פנסילבניה IACUC. המתת חסד בוצעה בעקבות נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של משאבי בעלי חיים במעבדה של אוניברסיטת פנסילבניה.

1. ערכה^V558Δ/+ גידול עכברים

1. החזירו את עכברי ה-Kit^V558Δ/+ יותר מ-10 פעמים לרקע C57BL/6J באמצעות עכברי C57BL/6J. לשם כך, מגדלים את זכר עכברי Kit^V558Δ/+ עם נקבת עכברי C57BL/6J ביחס של 1:2.
   הערה: הגנוטיפ של הערכה ההומוזיגוטית^{V558Δ/V558Δ} היא קטלנית ברחם. ניתן לגדל נקבות קיט^V558Δ/+ עכברים עם עכברי C57BL/6J זכרים, אך גודל הפסולת הוא כמחצית מזה שנראה מנקבת עכברי C57BL/6J. יתר על כן, נקבות עכברי Kit^V558Δ/+ מייצרות המלטות מוגבלות לאחר גיל 4 חודשים.
2. גנוטיפ הגורים בגיל 7-14 ימים על ידי חיתוך הבוהן כדי לאשר את נוכחותו של הגנוטיפ ^{של Kit V558Δ/+} . השתמש בפריימר הקדמי: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; כתב 1: CCTCGACAACCTTCCA; פריימר הפוך: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; וכתב 2: TCTCCTCGACCTTCCA לגנוטיפ.

2. ערכה^V558Δ/+ טיפול בעכבר

1. הגיל והמין תואמים את הערכה^V558Δ/+עכברים לפני הטיפול. השתמש בעכברים תואמי גיל ומין בקבוצות, שכן גידולים מנקבת עכברי Kit^V558Δ/+ גדולים יותר מאלה שבעכברים זכרים. טפלו בעכברים בגיל 8-12 שבועות, ואז נוצרים גידולים (איור 1).
2. תן מעכבי טירוזין קינאז בעל פה או על ידי הזרקה תוך-צפקית (i.p.); Kit^V558Δ/+ גידולים רגישים למעכבי טירוזין קינאז. ספקו אימטיניב במינון של 600 מ"ג/ל' במי שתייה או זריקות i.p. של 45 מ"ג/ק"ג פעמיים ביום. מדוד את הירידה במשקל הגידול באמצעות קשקשים דיגיטליים לאחר כריתת הגידול כפי שמוצג בשלב 3, שהם כ-50% בשבוע אחד ו-80% לאחר 4 שבועות לאחר הטיפול באימטיניב (איור 2).

3. ערכה^V558Δ/+ קצירת איברי עכבר

1. המתת עכברים על ידי נרקוזה CO₂ בקצב זרימה של 60% נפח תא לדקה. השאירו את העכברים בחדר לפחות 2 דקות לאחר הפסקת הנשימה, ואז בצעו נקע צוואר הרחם כדי לאשר את המוות.
2. לעקר את כל המכשירים, ללבוש כפפות לאורך כל ההליך, ולשמור על שדה סטרילי. הכן את העור עם 70% אתנול. בצע חתך אנכי בקו האמצע של 2 ס"מ באמצעות מספריים והיכנס לחלל הבטן. בחדות למדוד כל הידבקויות תוך-בטניות.
3. כדי להסיר את בלוטת הלימפה המזנטרית המתנקזת, בצע את השלבים המתוארים להלן.
   1. זהה את ה-cecum והרים את המזנטריה שלו בצורה מעולה. בערך באמצע הדרך לבסיס המזנטריה המעי הגסית, זהה את בלוטת הלימפה המזנטרית ונתח אותה בחדות. בלוטת הלימפה היא אוף-ווייט וגודלה כ-0.5 ס"מ על 0.5 ס"מ.
   2. מחלקים את רקמת בלוטות הלימפה לשלישים לבידוד חלבונים, היסטולוגיה ותרחיף של תאים בודדים, לפי הצורך. עבור תרחיפים של תאים בודדים, יש להניח את רקמת בלוטת הלימפה ב-20 מ"ל של מדיה נטולת סרום (RPMI) ולשמור על קרח.
4. לבידוד של ה-GIST וה-cecum, בצע את השלבים המתוארים להלן.
   1. הצקום בעכברי Kit^V558Δ/+ מוחלף ברובו על ידי GIST. בזהירות לחלק את הצומת האילאוקולי מבסיס הגידול. כדי לאסוף את cecum, לחלק את המעי הגס שוב, 2 ס"מ פרוקסימלי לבסיס הגידול.
   2. ב-50%-60% מעכברי Kit^{V558Δ/+ של Kit V558Δ/+} , ראש הגידול מכיל מכסה של רקמת צ'ק, שבדרך כלל מכילה נוזל סרוסי, אך לעתים רחוקות עשויה להכיל מוגלה (איור 3). לנתח בחדות את רקמת הכובע הרחק מרקמת הגידול.
   3. מחלקים את רקמת הגידול ו/או את ה-cecum לשלישים לצורך בידוד חלבונים, היסטולוגיה ותרחיף של תאים בודדים, לפי הצורך. עבור תרחיפים של תאים בודדים, יש למקם רקמת גידול או cecum ב-HBSS עם 2% FCS, מספיק כדי לכסות את הדגימה ולשמור על קרח.

4. ניתוח כתם מערבי של רקמת GIST

1. הכינו מאגר ליזה של רקמות המכיל 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% חומר ניקוי שאינו מתכלה, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 10 mM NaF ותערובת מעכבי פרוטאינאז של 20 μl/ml.
2. הכינו תמיסת מלח משולשת אחת עם 1x Tween 20 (TBST) על ידי שילוב של 1800 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה, 2 מ"ל של Tween 20 ו-200 מ"ל של 10x מי מלח עם חיץ Tris (TBS).
3. יש לבצע החייאה של רקמה משלב 3.4.3 בצינור FACS ב-5 מ"ל/גרם של חיץ ליזיס רקמתי ולהומוגניזציה פעמיים עם הומוגנייזר מכני ב-15,000 סל"ד במשך 15 שניות על קרח. דגירה ליזאטה במשך 30 דקות על קרח.
4. מעבירים את הליזאט לצינור מיקרוצנטריפוג' בגודל 1.5 מ"ל. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את ה-supernatant לתוך צינור מיקרו-צנטריפוג' חדש.
5. הפעילו ליאסטים על ג'ל שיפוע של 4% עד 15%, ואז העבירו לקרום ניטרוצלולוז, כמתואר^ב-14.
6. יש לשטוף את הממברנה פעם אחת ב-1x TBS למשך 5 דקות ולאחר מכן לחסום את הממברנה בחלב 5% למשך שעה אחת. שוב, לשטוף קרום פעם אחת 1x TBS במשך 10 דקות.
7. ממברנת הדגירה בנוגדן ראשוני מדולל 1:1000 ב-5% BSA ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. יש לשטוף את הממברנה 3x ב-1x TBST למשך 10 דקות כל אחת. כתם דגירה עם נוגדן משני מדולל 1:2500 בחלב 2.5% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
8. יש לשטוף את הממברנה פעם אחת ב-1x TBS למשך 5 דקות. הוסף מספיק מצע HRP כדי לכסות את הממברנה, בדרך כלל 200-500 μL, והשתמש בתמונה דיגיטלית כדי לזהות ולכמת chemiluminescence.

5. אימונוהיסטוכימיה של רקמת GIST

1. תקן רקמה משלב 3.3.2 או 3.4.3 ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C לילה. אחסן רקמות ב-70% EtOH עד שיהיה מוכן לעיבוד. הטמעה וחתך בלוקים בעובי של 5 מיקרומטר על גבי מגלשות זכוכית, כמתואר^15,16.
2. זיהוי אימונוהיסטוכימי מלא באמצעות ערכת אימונודציה בסיסית, כפי שתואר קודם לכן¹⁷.

6. השעיה חד-תאית של בלוטת המזנטרית

1. יוצקים מדיית RPMI עם דגימת בלוטות לימפה משלב 3.3.2 מעל מסנן של 100 מיקרומטר. העבר את המסנן לבלוטות לימפה חרוטיות ומחתיות חדשות של 50 מ"ל עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק 3 מ"ל. מסנן שטיפה עם 20 מ"ל של מדיית RPMI.
2. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט.
3. גלולת Resuspend ב-20 מ"ל של 1% FBS ב-PBS (מאגר חרוזים) ושופכת מעל מסנן של 40 מיקרומטר. לאסוף את תפיח התא. לספור תאים באמצעות המוציטומטר.
4. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט. Resuspend במאגר חרוזים ב 6 x 10⁷ תאים / מ"ל עבור ציטומטריה זרימה.

7. השעיה של תא יחיד של GIST

1. הכינו את מאגר הקולג'אנאז על ידי הוספת 250 מ"ג של קולגן IV, טבליה אחת של מעכב פרוטאז ללא EDTA ו-100 μL של DNase I ל-50 מ"ל של HBSS. יש לסובב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עד להמסה.
2. מניחים את GIST במנה סטרילית ומוסיפים 2.5 מ"ל של מאגר קולגןאז. גידול טחון באמצעות אזמל סטרילי ומספריים עד שהגידול נמצא בשברים עדינים. השתמשו בפיפטה בור גדולה כדי לשאוף את הגידול ואת הקולגן לתוך צינור 50 מ"ל.
3. דגירה באינקובטור רועד ב-100 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. תגובת מרווה עם 2 מ"ל של FBS.
4. יוצקים קולגן עם דגימת GIST על מסנן של 100 מיקרומטר וגידול מחית עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק 3 מ"ל ואסוף בצינור 50 מ"ל. לשטוף מסנן עם 20 מ"ל של HBSS. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g, 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט.
5. בצעו החייאה של הכדור ב-20 מ"ל של מאגר חרוזים ושפכו מעל מסנן של 40 מיקרומטר. לאסוף את התסיסים ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g, 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט. Resuspend במאגר חרוזים ב 6 x 10⁷ תאים / מ"ל עבור ציטומטריה זרימה.

8. השעיה של תא יחיד של cecum

1. הכינו מאגר קולגן כמו בשלב 7.1. באמצעות מספריים, לפצל את cecum אורכית כדי לחשוף את הרירית הפנימית. חותכים למקטעים של 0.5 ס"מ ומניחים בצינור 50 מ"ל עם 5 מ"ל של HBSS עם 2% FBS. יש לנער במרץ במשך 30 שניות, לצנטריפוגה ב-450 x גרם במשך 20 שניות, ואז לשאוף לסופרנאטנט.
2. הוסף 5 מ"ל של HBSS עם 2 mM EDTA. דגירה באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-100 סל"ד למשך 15 דקות. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 20 s. לשאוף את הסופרנאטנט.
3. הוסף 5 מ"ל של HBSS. יש לנער במרץ במשך 30 שניות, לצנטריפוגה ב-450 x גרם במשך 20 שניות, ואז לשאוף לסופרנאטנט. חזור על הפעולה פעם נוספת.
4. הוסיפו 5 מ"ל של מאגר קולגןאז. דגירה באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-100 סל"ד. לנער במרץ כל 10 דקות. תגובת מרווה עם 2 מ"ל של FBS.
5. יוצקים קולגן עם דגימת cecum על מסנן של 100 מיקרומטר ומחית עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק 3 מ"ל. לשטוף מסנן עם 20 מ"ל של HBSS. לאסוף תבעיר.
6. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את הסופרנאטנט. גלולת Resuspend ב 20 מ"ל של מאגר חרוזים לשפוך מעל מסנן 40 מיקרומטר. לאסוף תסיסים ולספור תאים באמצעות המוציטומטר.
7. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את הסופרנאטנט. Resuspend במאגר חרוזים ב 6 x 10⁷ תאים / מ"ל עבור ציטומטריה זרימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מודל העכבר ^{Kit V558Δ/+} מאפשר לחקור טיפולים במודל עכברים אימונו-תחרותי. לערכה^V558Δ/+ לעכברים יש תוחלת חיים ממוצעת של 8 חודשים עקב חסימת מעיים מתקדמת (איור 4). גידולים מ-Kit^V558Δ/+ עכברים מבטאים סמנים קנוניים של GIST כולל הטירוזין קינאז KIT ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מודל העכבר ^{Kit V558Δ/+} הוא כלי מחקר רב עוצמה בניתוח מולקולרי ואימונולוגי של GIST. למרות שאסטרטגיית הרבייה דורשת צלב יחיד, שימוש בקבוצת עכברים ^{Kit V558Δ/+} בניסויים המנתחים את תגובת הגידול דורש רבייה נרחבת. עכברים צריכים להיות מותאמי גיל ומין כדי להבטיח משקל גידול דומה, ו -10% מהעכב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 micron filter	EMSCO	1194-2360
1x RBC lysis buffer	Life Technologies	00-4333-57
3mL syringe	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl	Bio-Rad	4561083
4% Paraformaldehyde Solution	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 micron filter	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 micron filter	EMSCO	1194-2350
AKT antibody (C67E7)	Cell Signaling	4691
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Complete mini edta free protease inhibitor	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 antibody	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate	Selleck Chemicals	S1026
KIT antibody (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotyping	Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm	Rio-Rad	1620145
Nonfat Dry Milk	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
p-AKT antibody (S473)	Cell Signaling	4060
p-ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9101
p-KIT antibody (Y719)	Cell Signaling	3391
PMSF Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 platform	Scanco medical