מדידת In Vivo שנפתרה בזמן של נוירופפטידים דינמיים על ידי אימונופרוב קיבולי בלב חזירי

Summary

שיטות אימונוכימיות מבוססות למדידת משדרי פפטידים in vivo מסתמכות על מיקרודיאליזה או על משיכת נוזלים בתפזורת כדי לקבל את הדגימה לניתוח לא מקוון. עם זאת, אלה סובלים ממגבלות מרחביות-טמפורליות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הייצור והיישום של ביוסנסור אימונופרוב קיבולי המתגבר על מגבלות הטכניקות הקיימות.

Abstract

היכולת למדוד סמנים ביולוגיים in vivo הרלוונטיים להערכת התקדמות המחלה מעניינת מאוד את הקהילות המדעיות והרפואיות. קבלת הרזולוציה של התוצאות המתקבלות מהשיטות הנוכחיות למדידת סמנים ביולוגיים מסוימים יכולה להימשך מספר ימים או שבועות, מכיוון שהם יכולים להיות מוגבלים ברזולוציה הן מבחינה מרחבית והן באופן זמני (למשל, מיקרודיאליזה של תאי נוזלים של נוזל אינטרסטיציאלי של נוזל אינטרסטיציאלי שנותחה על ידי בדיקה חיסונית המקושרת לאנזים [ELISA], כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים [HPLC], או ספקטרומטריית מסה); לפיכך, ההנחיה שלהם לאבחון וטיפול בזמן מופרעת. במחקר הנוכחי מדווחת טכניקה ייחודית לאיתור ומדידה של משדרי פפטידים in vivo באמצעות שימוש בביוסנסור אימונו-פרובי קיבולי (CI probe). פרוטוקול הייצור והאפיון החוץ גופי של בדיקות אלה מתוארים. מדידות של נוירופפטיד Y (NPY) מעורר גירוי סימפתטי משחרר in vivo מסופקות. שחרור NPY מתואם לשחרור אוהד של נוראדרנלין לעיון. הנתונים מדגימים גישה למדידה מהירה ומקומית של נוירופפטידים in vivo. יישומים עתידיים כוללים הערכה תוך ניתוחית בזמן אמת של התקדמות המחלה ופריסה זעיר פולשנית מבוססת צנתרים של בדיקות אלה.

Introduction

מספר שיטות כימיות לאיתור וכימות סמנים ביולוגיים משמשות באופן שגרתי הן בכימיה של חלבונים והן באבחון קליני, במיוחד באבחנות סרטן ובהערכת התקדמות מחלות לב וכלי דם. נכון לעכשיו, שיטות כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISA) וספקטרומטריית מסה מסתמכות על איסוף דגימות מתא כלי הדם ^1,2,3 על ידי משיכת נוזלים בתפזורת או מהתא הבין-כוכבי על ידי מיקרודיאליזה. מיקרודיאליזה משתמשת בצינור ממברנה חצי-חדיר באורך ידוע הממוקם באזור עניין. נוזל האיסוף מחלחל דרך הצינור במשך מספר דקות⁴ כדי לאסוף את הדגימה לניתוח⁵, ובכך מגביל את הרזולוציה הטמפורלית. באופן זה, דגימות שנאספו מספקות רק ערך ממוצע לאורך זמן של המיקרו-סביבה המקומית ומוגבלות על ידי קצב הזלוף והאיסוף של נפח דגימה מספיק. יתר על כן, שיטות אלה דורשות איגום של נתונים ניסיוניים וממוצע אותות; לכן, הם עשויים שלא לתת דין וחשבון על השונות בין הנושאים. חשוב לציין כי הזמן שבין איסוף הדגימות לבין הניתוח הלא מקוון שלאחר מכן מונע התערבות קלינית וטיפולים מיידיים.

בפרוטוקול הנוכחי, מתואר השימוש בביו-סנסור אימונופרוב קיבולי (CI probe) לזיהוי חשמלי שנפתר בזמן של פפטידים ביו-אקטיביים ספציפיים. נוירופפטיד Y (NPY), המשתחרר מתאי עצב סימפתטיים פוסט-גנגליוניים המעצימים את כלי הדם, אנדוקרדיום, קרדיומיוציטים וגרעינים תוך-לבביים, הוא משדר פפטידים נוירומודולטוריים מרכזי במערכת הלב וכלי הדם 6,7,8,9. השיטה המוצגת כאן נועדה למדוד NPY, וההיתכנות הניסויית מודגמת במודל לב חזירי. עם זאת, גישה זו חלה על כל פפטיד ביו-אקטיבי שעבורו נוגדן סלקטיבי זמין¹⁰. שיטה זו מסתמכת על הצומת הקיבולי בין בדיקה של חוט פלטינה לבין הנוזל המוליך בקצה המתפקד^11,12. ביישום זה, האינטראקציה הייתה מתווכת באמצעות נוגדן נגד נוירופפטיד המטרה (NPY), שהיה קשור לקצה האלקטרודה, והתממשק לסביבת הנוזל המוליך. פונקציונליזציה זו הושגה באמצעות אלקטרודפוזיציה של פולידופאמין תגובתי על קצה הגשושית חוט הפלטינה ^10,13.

כאשר הגשושית המתפקדת על ידי נוגדנים ממוקמת באזור עניין in vivo, שחרור NPY אנדוגני מעורר מוביל לקשירת נוגדנים לוכדים על קצה הגשושית, והנוזל המוליך במשטח האלקטרודה נעקר על ידי חלבון NPY. שינוי מקומי בסביבה החשמלית גורם לתזוזה של נוזל דיאלקטרי בעל ניידות גבוהה עם מולקולה חסרת תנועה וטעונה סטטית. זה משנה את ממשק האלקטרודה-זורם, ובכך את הקיבוליות שלו, הנמדדת כשינוי בזרם המטען בתגובה לפוטנציאל פקודה של פונקציית צעד. פוטנציאל "איפוס" שלילי מופעל מיד לאחר כל מחזור מדידה בודד כדי להדוף NPY מאוגד מהנוגדן באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית, ובכך לנקות את אתרי הקישור של הנוגדנים לסבבים הבאים של מדידה¹⁰. זה למעשה מאפשר מדידה של NPY באופן שנפתר בזמן. טכניקת CI הייחודית מתגברת על המגבלות של השיטות האימונוכימיות מבוססות המיקרודיאליזה שתוארו לעיל כדי למדוד רמות סמנים ביולוגיים דינמיים מניסוי יחיד ללא אגום נתונים או ממוצע איתותים על פני מספר ניסויים⁹, ומספקת נתונים כמעט בזמן אמת. יתר על כן, היכולת להתאים שיטה זו לכל סמן ביולוגי בעל עניין שעבורו קיים נוגדן מתאים בקנה מידה פתור ומלוקלי מספקת התקדמות טכנית משמעותית במדידה אימונוכימית להערכת התקדמות המחלה והכוונת התערבויות טיפוליות.

התוכנה לאיסוף וניתוח נתונים נכתבה בהתאמה אישית ב- IGOR Pro (סביבת תוכנה אינטראקטיבית לחלוטין). מערכת ממיר אנלוגית לדיגיטלית (A/D) הוציאה מתח פקודה תחת בקרת מחשב ורכשה נתונים ממגבר מותאם אישית. המגבר היה בעל תכונות ייחודיות מסוימות. אלה כללו נגד משוב (ניתן להחלפה) עבור כל אחד מארבעת ערוצי הרכישה, המאפשר בחירה במעגלי מהדקי מתח משוב של 1 MOhm או 10 MOhm כדי לשלב את השונות של האלקטרודה. יחידת במה עם ראש יחיד ומעגל קרקע/ייחוס הדדי לכל ארבעת ערוצי הרכישה נבנתה גם היא כדי למקם את המכשיר קרוב לחזה במודול פיזי יחיד. הגדרת נגד משוב 1 MOhm שימשה לאיסוף כל הנתונים המדווחים.

הגדרות המסנן והרווח הועתקו מהמגבר ותועדו בתוך קובץ הנתונים. הנתונים סוננו ב-1 קילוהרץ באמצעות מסנן בסל אנלוגי בן 2 קטבים שעבר דיגיטציה ב-10 קילוהרץ. ההבדל בפוטנציאל בין הגשושית לתמיסה המוליכה הסובבת יוצר שכבה קיבולית של הלמהולץ בקצה הגשושית. קשירת ליגנד לנוגדן בקצה הגשושית גורמת לשינוי במטען המקומי, ובכך לשינוי בקיבוליות הלמהולץ. שינוי זה ברכיב הקיבולי של המעגל גורם לשינוי בגודל המטען המוזרק הנדרש כדי להביא את הגשושית לפוטנציאל בפרוטוקול המתח של פונקציית הצעד. לפיכך, קשירת ליגנד מסוים לבדיקה הפונקציונלית גורמת לשינוי במדידת קיבוליות האלקטרודה כשינוי בזרם הקיבולי הגבוה ביותר.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס ובוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המדריך הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (מהדורה 8, 2011). חזירי יורקשייר זכרים בוגרים במשקל של כ-75 ק"ג שימשו למחקרי in vivo ¹⁰.

1. ייצור אימונו-פרובינציה קיבולית ותפקודיזציה

1. חותכים חוט פלטינה מצופה פרפלואורואלקוקסי (PFA) באורך 25 ס"מ (PFA) (ראו טבלת חומרים) ומפשיטים כ-5 מ"מ של ציפוי PFA מקצה אחד באמצעות אזמל, תוך זהירות שלא לחתוך לחוט הפלטינה.
2. הכנס את הקצה המופשט של חוט הפלטינה לתוך פין מחבר זכר 1 מ"מ מצופה זהב וצמצם את שיני פין המחבר סביב הקצה המופשט של חוט הפלטינה באמצעות צבתות אף מחט (ראה טבלת חומרים).
3. הלחימו את חוט הפלטינה לפין המחבר המצופה זהב. היזהר לא להשתמש בכמות מוגזמת של הלחמה.
4. הכינו תמיסת דופמין על ידי המסת 50 מ"ג דופמין הידרוכלוריד ב-50 מ"ל של 10 מ"מ מלוחים עם מאגר פוספט (PBS, pH 6.0) על ידי ערבוב.
5. לאחר שהדופמין מומס לחלוטין, הניחו את קצה חוט הפלטינה בכלי המכיל את ה-PBS הטרי עם תוספת דופמין. חבר סיכת מחבר זהב לערוץ של הבמה (ראה טבלת חומרים).
6. חברו את אלקטרודת דיסק AgCl (אלקטרודת הארקה, ראו טבלת חומרים) לתעלת הקרקע בראש הבמה. הניחו את דיסק ה-AgCl בכלי המכיל PBS ותיל פלטינה עם תוסף דופמין; היזהרו רק כדי להטביע את אלקטרודת הדיסק ולא כל אורך של החוט או ההלחמה. חברו חוט תיל לערוצי הייחוס של הבמה לפני ההמשך.
7. פתח את התוכנה האינטראקטיבית לרכישת נתונים (ראה טבלת חומרים). הכן פרוטוקול פוטנציאל פקודה של אלקטרודת מסור עם הפרמטרים הבאים: התחל פוטנציאל = −0.6 V; פוטנציאל קצה = +0.65 V; קצב סריקה = 0.04 V∙^s-1; משך התצהיר = 420 שניות. התחל את פרוטוקול התצהיר polydopamine, להבטיח כי כל החוטים מחוברים כראוי.
8. לאחר השלמת תצהיר הפולידופאמין, הסר את גלולת הקרקע AgCl ואת קצה חוט הפלטינה מהכלי, תוך זהירות שלא להפריע לקצה אלקטרודת חוט הפלטינה. מכניסים את קצה החוט למיקרו-צינור המכיל PBS (pH 7.4) למשך 2-5 דקות בזמן הכנת תמיסת הנוגדן; ודא שקצה החוט אינו יוצר קשר עם הצדדים או בתחתית המיקרו-טיוב.
   הערה: תמיסת נוגדנים יכולה להיעשות במהלך תצהיר פולידופאמין; עם זאת, אין לדלג על העברת חוט הפלטינה מכלי המכיל דופמין למיקרו-צינור של PBS לאחר תצהיר פולידופאמין.
9. הכן את פתרון הנוגדנים. שלבו את הנוגדן המעניין עם PBS (pH 7.4) ביחס של 1:20 בכלי בגודל מתאים (למשל, מיקרו-צינורית).
   הערה: הנוגדן החד-שבטי נגד NPY (ראה טבלת החומרים) שבו נעשה שימוש כאן הוצמד ל-1 מ"ג/מ"ל; הכנה לדוגמה של נוגדנים כאן תהיה 4 μL של נוגדנים ל-76 μL של PBS.
10. משרים את הקצה המופקע מפולידופאמין של אלקטרודת הפלטינה בתמיסת נוגדנים למשך 2 שעות לפחות בטמפרטורת החדר, ושוב מבטיחים שקצה חוט הפלטינה תלוי בתמיסה ולא נח על המשטח הפנימי של המיקרו-צינור.
    הערה: יישום לאחרונה של טכניקה זו העדיף להשתמש באלקטרודת חוט הפלטינה מיד לאחר שלב זה במקום אחסון רטוב או יבש לשימוש מאוחר יותר.
11. לאחר השריית תמיסת הנוגדנים, יש לשטוף לזמן קצר את קצה החיסון הקיבולי החדש (CI probe) ב-PBS (pH 7.4). הגשושית מוכנה כעת לשימוש.

2. מערך ניסויי לזיהוי ומדידת מבחנה של פפטיד

1. הכניסו את הקצה התפקודי של הגשושית CI לתא הזרימה, תוך הקפדה שלא להפריע לקצה האלקטרודה בשום צורה, שכן פעולה זו עלולה לפגוע בקצה החושי של הגשושית.
   הערה: תא הזרימה נוצר על ידי מזיגת אלסטומר סיליקון (ראו טבלת חומרים) לתוך צלחת תרבית של 35 מ"מ עם מילוי חלל ביצתי מוארך במרכז המנה. לאחר ההתקשות, צורת הביצית מוסרת מהאלסטומר. לאחר מכן, התא מועשר בתמיסת מלח עם חציצה משולשת (TBS) ומאפשר קצב זרימה של 3 מ"ל/דקה. ודא שהזרימה והיציאה שומרות על רמת הנוזלים בתא כך שלא נצפתה פעולת גאות של הסופרפוזט. הזרימה חייבת להישאר במקומה כל עוד הגשושית CI נמצאת בשימוש.
2. לפני הבדיקה הניסיונית הראשונה, בצע ריצה סטנדרטית של TBS כדי להתנות את הגשושית CI. הגדר את פרוטוקול מתח הפקודה הבא: פוטנציאל צעד חיובי = +100 mV; פוטנציאל צעד שלילי = −5 mV; משך צעד = 20 אלפיות השנייה; משך הרכישה = 600 שניות.
   הערה: חשוב לאפשר את שיווי המשקל של הגשושית במהלך השלב הראשוני של פוטנציאל הפיקוד על מחזור לפני איסוף הנתונים.
3. צור תמיסה של הפפטיד המעניין באמצעות אותו TBS כדי לשמור על הרכב הסופרפוסאט. הגדר מערכת סעפת שבה ניתן להחליף את הסופר-פוסאט בין TBS ל-TBS עם תוספת פפטידים מבלי להכניס בועות למערכת הצינורות או לתא הזרימה.
   הערה: פפטיד NPY חזירי סינתטי (ראה טבלת חומרים) שימש במחקר הנוכחי.
4. הגדר את פרוטוקול איסוף הנתונים של חישת הפפטידים באמצעות פרמטרים סטנדרטיים של TBS (ראה שלב 2.2.).
   הערה: ביישום זה, משך הזמן של כל בדיקה ניסיונית היה 360 s (120 s TBS, 120 s TBS בתוספת פפטיד, 120 s TBS).

3. התאמת הגשושית CI לשימוש in vivo

1. לפני שקיעת פולידופאמין (שלב 1.7.), משחילים את הקצה החשוף של אלקטרודת חוט הפלטינה דרך מחט היפודרמית של 22 גרם, ומשאירים כ-2 מ"מ מעבר לקצה המחט. באמצעות מלקחיים, כופפו בעדינות את קצה אלקטרודת חוט הפלטינה, ויצרו "ברב" שתלוי מקצה המחט ההיפודרמית.
   1. משכו בעדינות את המחט מקצה התיל, והשאירו מספיק חוט למקם בכלי מבלי שהמחט תיצור קשר עם הנוזל. המשך עם שלבים 1.4.-1.11.
      הערה: בהתאם להגדרת in vivo , ייתכן שיהיה צורך לחתוך אורך של חוט פלטינה ארוך מ -25 ס"מ.
2. לפני חיבור הגשושית CI לראש הבמה, ודא שכל מערך החשמל מקורקע כראוי. אם לא תעשו זאת, הדבר עלול לגרום להפרעה חשמלית לא רצויה במהלך הקלטות הניסוי.
3. להרדים את בעלי החיים בעקבות דו"ח¹⁰ שפורסם בעבר.
4. בצע ניתוח כדי לחשוף את אזור העניין.
   הערה: עצם החזה החציונית בוצעה במחקר הנוכחי כדי לחשוף את הלב. אנא ראו Kluge et ^al.10 לקבלת פרטים על ניתוחים בבעלי חיים.
5. הסר בעדינות את הקצה המתפקד משטיפת ה- PBS (שלב 1.11.), העבר את המחט ההידודרמית אל בוחן ה- C.I. התוחם והשתיל אותה בעדינות באזור העניין לפני חיבור פין מחבר הזהב לבמה הראשית. לאחר ההשתלה, למשוך את המחט ההיפודרמית, ולהשאיר את האלקטרודה במקומה.
   הערה: עבור המחקר הנוכחי, הגשושית הונחה בדופן האמצעית-צידית של שריר הלב בחדר השמאלי¹⁰.
6. לאחר הבטחת התקנה חשמלית נכונה, המשך עם פרוטוקולי בדיקה סטנדרטיים וניסיוניים (שלב 2.2. ושלב 2.4.).
7. עם השלמת הניסויים, המתים את החיה על פי טכניקות שאושרו על ידי המוסד.
   הערה: במחקר הנוכחי, בעלי החיים מורדמים תחת הרדמה עמוקה באמצעות אינדוקציה של פרפור חדרים¹⁰.

תוצאות

ייצור ואפיון אלקטרודות
אימונו-פרוב קיבולי גמיש (בדיקות CI) יוצר, ותמונה מייצגת מתוארת באיור 1A. פוטנציאל האלקטרודה נקבע על ידי מעגל מהדק מתח מבוקר מחשב (איור 1B), והאלקטרודה הייתה שקועה בתמיסת פולידופאמין המיוצרת ב-PBS. פולידופאמין הוצמד לאלקטרודפוזי...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר ייצור ובדיקה של אימונו-פרוב קיבולי (CI probe) המסוגל לזהות ולמדוד סמנים ביולוגיים בעלי עניין הן במבחנה והן בסביבה in vivo . הגילוי מושג על ידי לכידת הסמן הביולוגי בקצה האלקטרודה. אירוע הלכידה משנה את הצומת הקיבולי בין אימונופרוב קיבולי של חוט פלטינה לבין סביבת הנו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654