ייצור מיקרוספרות נקבוביות פתוחות במיוחד (HOPMs) באמצעות טכנולוגיה מיקרופלואידית

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר ייצור של מיקרוספרות נקבוביות פתוחות מאוד (HOPMs) המבוססות על פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) באמצעות טכנולוגיית מיקרופלואידית מבוססת תחליב יחיד. למיקרוספרות אלה יש יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות ובבדיקת תרופות.

Abstract

בהשוואה לפיגומים בתפזורת והזרקה ישירה של תאים בלבד, היחידות המודולריות הניתנות להזרקה זכו לעניין עצום בתיקון רקמות לא תקינות בשל הנוחות באריזות התאים, שימור תאים משופר ופולשניות מינימלית. יתר על כן, הקונפורמציה הנקבובית של נשאים זעירים אלה יכולה לשפר את חילופי הבינוניים ולשפר את רמת חומרי המזון ואספקת החמצן. המחקר הנוכחי ממחיש את הייצור הנוח של מיקרוספרות נקבוביות פתוחות מאוד (PLGA-HOPMs) המבוססות על פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) על ידי הטכנולוגיה המיקרופלואידית של facile עבור יישומי העברת תאים. ה- PLGA-HOPMs החד-ממדיים שהתקבלו היו בעלי גודל חלקיקים של ~ 400 מיקרומטר ונקבוביות פתוחות של ~ 50 מיקרומטר עם חלונות מחוברים. בקצרה, טיפות השמן המתחלבות (תמיסת PLGA בדיכלורומתאן, DCM), עטופות בפאזה המימית של ג'לטין 7.5% (w/v), הוכנסו לתמיסה המימית של 1% (w/v) פולי(ויניל אלכוהול) (PVA) הזורם באופן רציף דרך הזרבובית הקואקסיאלית במערך המיקרופלואידי המותאם אישית. לאחר מכן, המיקרוספרות היו נתונות להליכי מיצוי ממסים וליופיליזציה, וכתוצאה מכך לייצור HOPMs. יש לציין כי פורמולציות שונות (ריכוזים של PLGA ופורוגן) ופרמטרים לעיבוד (כוח תחליב, מד מחט וקצב זרימה של פאזה מפוזרת) ממלאים תפקידים מכריעים באיכויות ובמאפיינים של ה- PLGA HOPMs המתקבלים. יתר על כן, ארכיטקטורות אלה עשויות לתמצת רמזים ביוכימיים שונים אחרים, כגון גורמי גדילה, לגילוי תרופות מורחב וליישומים של התחדשות רקמות.

Introduction

מיקרוספרות עמוסות תאים מציעות יתרונות חיוביים, כגון יכולת שימור תאים משופרת באתרה, אספקה יעילה של תאים, ויכולת נוספת של התפשטות תאים in vivo¹. עד כה, נערכו מחקרים רבים לפיתוח מבנה פיגומים מוצלח לתמיכה בסביבה תורמת לתאים להתחדשות רקמות או ליישומי סינון תרופות². עם זאת, סביבת היפוקסיה היא לעתים קרובות בלתי נמנעת בפנים עקב אספקה מספקת של חומרים מזינים / חמצן והצטברות פסולת מטבולית³. כדי להתגבר על בעיות אלה, מיקרוספרות נקבוביות מאוד (PMs) פותחו באמצעות ביו-חומרים^{שונים 4,5,6}. בנוסף, בתרבות דינמית, הפיגומים סובלים מלחץ גזירה מוגזם⁷, והמצב הלא יציב של מדיום התרבית עלול לשבור את הנאמנות של PMs. לחלופין, ניתן להשתמש בפולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) לעיבוד PMs עם חוזק מכני טוב לתרבית דינמית¹. לדוגמה, הדגמנו הזרקה משותפת של מיובלסט עכבר (C2C12) עמוס PLGA פתוח מאוד PMs (HOPMs) ותאי אנדותל של ורידים אנושיים (HUVEC) עמוסי פולי(אתילן גליקול) מיקרורודים חלולים כדי לרפא אובדן שריר נפחי, ולהשיג שיפור מדהים של התחדשות שרירי השלד באתרו ⁸.

יש לציין כי PMs מאופיינים בשטחי פנים גדולים ונקבוביות גבוהות, וזה עניין ספציפי להידבקות תאים וצמיחה לקראת אספקת תאים זעיר פולשנית⁹. לאור היבטים אלה, נעשה שימוש בחומרים שונים בעלי תאימות ביולוגית כדי לייצר את^{ה-PMs 10,11.} ה-PMs הניתנים לתכנון יחד עם תאים מציעים הידבקות מצוינת, חוזק מכני ניכר וחלונות מחוברים מאוד, שיכולים לשפר את התפשטות התאים לתיקון רקמות פגומות¹². בהקשר זה, טכנולוגיות שונות פותחו גם כדי לייצר כדורים נקבוביים^13,14. מצד אחד, PMs הופקו באמצעות חומרים יוצרי גז, כגון NH₄HCO₃, אשר רוסנו עקב קישוריות^{מספקת 15,16,17}. מאידך גיסא, PMs נגזו ישירות לאחר אמולסיפיקציה, מה שהוביל לפולידיספרס PMs¹⁸. בסופו של דבר, הטכנולוגיה המיקרופלואידית של הטיפות המבוססת על גישת האמולסיה-טמפלציה היא אולי שיטה יעילה לבניית PMs, מכיוון שלעתים קרובות היא גורמת לחלקיקים בגודל אחיד¹⁹. יש לציין כי התכונות המורפולוגיות של המיקרוספרות תלויות לעתים קרובות באיכות טיפות האמולסיה הנוצרות (כלומר, מים בשמן, W/O, או שמן במים, O/W), אשר עשויות להשפיע באופן משמעותי על תכונות הביו-חומרים²⁰. ראוי לציין כי ניתן ליישם את הפלטפורמה המיקרופלואידית שתוכננה מראש כדי ליצור את המיקרופייברים או המיקרוספרות. לדוגמה, Yu et al. הדגימו ייצור של מבנים מיקרו-פיסיביים עמוסי תאים המבוססים על פלטפורמות מיקרופלואידיות מבוססות נימים, אשר יכולות לשמש להרכבת רשתות תאיות לחיקוי רקמות טבעיות²¹. במקרה אחר, Ye et al. ייצרו מיקרו-קפסולות גבישים פוטוניים על ידי שכפול תבנית של חרוזי גביש קולואידיים סיליקה באמצעות טכנולוגיות מיקרופלואידיות, שיכלו להתגבר על מגבלות רבות של טכניקות עכשוויות הדורשות תיוג מורכב ומנגנון ספציפי²².

ואכן, הרציונל מאחורי השימוש בטכניקה זו נובע מיתרונות שונים, כגון היותה נוחה באופיה, שאינה דורשת ציוד מתוחכם, והנוחות שלה בסינתזה של PMs בגודל אחיד ליישומי אספקת תאים ורפואה רגנרטיבית. בהקשר זה, עם רכיבים שתוכננו מראש של תחליב-טמפלאט, ניתן לקבל בנוחות PMs עם נקבוביות גבוהות וקישוריות מהתקן מיקרופלואידי המורכב מצינורות פולי(ויניל כלוריד) (PVC), נימי זכוכית ומחט. תחליב-מבשר W/O מוכן על ידי הומוגניזציה של תמיסה מימית של ג'לטין ותמיסה אורגנית של PLGA. על ידי הזרקה סלקטיבית של החלק הישים של האמולסיה לתוך הפלטפורמה המיקרופלואידית, ה- PMs עם גדלי חלקיקים אחידים ונקבוביות מחוברות זו לזו לאורך פני השטח לפנים מפוברקים. הפרוטוקול הנוכחי נועד לייצר את ה-PLGA-HOPMs על ידי תחליב-טמפלינג בפלטפורמה המיקרופלואידית. ההערכה היא כי פרוטוקול זה מאפשר ייצור ניתן לשחזור של PLGA-HOPMs ועשוי להיות ישים בתחומים הקשורים שלהם של הנדסת רקמות ובדיקת תרופות.

Protocol

1. הכנת פתרונות

1. הכינו את תמיסת מלאי ה-PVA מראש על ידי חימום תמיסת ה-PVA באמבט מים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הכנסתה למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש לקרר לטמפרטורת החדר (RT) לשימוש ניסיוני.
2. הכן את תחליב-מבשר על ידי הוספת תמיסת הג'לטין המימית (1 מ"ל, 7.5%, w/v) לשלב האורגני של PLGA (2 מ"ל, 2%, w/v בדיכלורומתאן, DCM) (ראה טבלת חומרים).
   הערה: באופן כללי, טכנולוגיה מיקרופלואידית כוללת שלבים שונים ליצירת המיקרוספרות. השלב הרציף או האיסוף מורכב מפולי מימי (אלכוהול ויניל) (PVA, 600 מ"ל, 1%, w/v).

2. הרכבה וייצור של מכשירים מיקרופלואידיים טיפתיים של PLGA-HOPMs

הערה: הפריטים המתכלים הדרושים להרכבה זו מפורטים בטבלת החומרים.

1. התאם אישית את מכלול מחולל הטיפות.
   1. בנה גנרטור מיקרופלואידי בזרימה משותפת באמצעות נימי זכוכית (OD, 1 מ"מ), צינורות PVC (ID, 1 מ"מ) ומחט חלוקה של 26 גרם.
   2. חבר את נימי הזכוכית לקצה צינור ה- PVC ולאחר מכן נקב עם מחט בחיבור של המבנה הנ"ל.
   3. מניחים את הקצה השני של צינור ה-PVC בפאזה הרציפה במהלך יצירת הטיפות. באמצעות דבק UV, יש לאטום את המרווחים במפרק לאחר הריפוי.
      הערה: יש לכופף את המחט בצורה מעוקלת כ-45° לצורך פירסינג נוח בצינור ה-PVC, ונקודת המחט נמתחה לתוך הצינור הנימי כדי ליצור את המבנה הקואקסיאלי.
2. הכינו את הפלטפורמה המיקרופלואידית הטיפה.
   1. השתמשו בשתי משאבות מזרק, כפי שמוצג באיור 1. השתמש במזרק של 50 מ"ל כדי לטעון את הפאזה הרציפה ובמזרק של 5 מ"ל ליצירת תחליב.
   2. הגדר את קצבי הזרימה של שלבי הרציף והפיזור ב-2 מ"ל/דקה ו-0.08 מ"ל/דקה, בהתאמה.
   3. הניחו בגודל 500 מ"ל באמבט קרח ומלאו אותה בתמיסה מימית PVA מקוררת מראש (שלב 1.1).
      הערה: קצה נימי הזכוכית חייב להיות שקוע בשלב האיסוף. מומלץ לערבב (שעה, 60 סל"ד) את הסופר-נטנט של שלב האיסוף עם מוט הזכוכית לאחר היווצרות טיפות האמולסיה בפלטפורמה. טיפות תחליב מיוצרות בקצה נקודת המחט. באופן כללי, מד המחט משפיע על גודל ה- PMs, שבו המד הקטן יותר מתאים לגודל הקטן יותר של PMs. יתר על כן, קוטר הנקבוביות מתואם בעיקר לריכוז הפורוגן, המסוגל לעלות עם ריכוז הג'לטין^{המתאים 1}.
3. בצע את התחליב ואת יצירת טיפות.
   1. הכן את האמולסיה לפי השלבים הבאים.
      1. הכן את התחליב על ידי פירוק מיידי של תמיסת הג'לטין המימית לתמיסת DCM של PLGA (שלב 1.2) ותחליב באמצעות ההתקן העל-קולי (ראה טבלת חומרים).
      2. התאם את ההספק העל-קולי ל-400 W, והגדר את זמן העיבוד הכולל כ-90 שניות (מרווח 2 שניות, טיפול על-קולי 1 שניות), בליווי שינוי מתמיד של מיקום הבדיקה באופן ידני.
      3. ייצוב התחליב המתקבל עבור יניקה מזרק ויצירת טיפות תוך כ-20 דקות.
         הערה: מקם את הבדיקה של מפסק התאים העל-קוליים בממשק שמן-מים. מומלץ לא לתת לבדיקה הקולית ליצור קשר עם המיכל.
   2. בצע את יצירת הטיפות.
      1. טען את האמולסיה המוכנה (שלב 2.3.1) במהירות במזרק 5 מ"ל של הפלטפורמה המיקרופלואידית לאחר טיפול קולי.
      2. הכנס את תחליב ה-W/O הלא יציב (שנמצא במהלך הפרדת פאזה) לתוך ההתקן המיקרופלואידי כפאזה הלא רציפה. יחד עם זאת, השתמש בתמיסה המימית של PVA כפאזה הרציפה.
      3. לאסוף את המיקרוספרות המכילות את האמולסיה בתחתית האיסוף (PVA, 1%, w/v) לאחר הזרקת חלקים מתאימים של האמולסיה לתוך המכשיר המיקרופלואידי.
      4. מניחים את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לייצוב נוסף.
   3. שטפו וליאופיליזציה את המיקרוספרות המוכנות (PLGA-HOPMs) בהתאם לשלבים הבאים.
      הערה: ה- PLGA-HOPMs שנוצרו מכילים נקבוביות שרירותיות על הפנים ועל פני השטח.
      1. אחסנו את המיקרוספרות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הנרמול ל-RT וערבבו במוט זכוכית (שעה, 60 סל"ד) כדי לחסל את שאריות ה-DCM.
      2. סננו בזהירות את שלב האיסוף בכוס של 500 מ"ל, ושטפו את המיקרוספרות שנאספו שלוש פעמים במים שעברו דה-יוניזציה כדי לשטוף את שאריות ה-PVA על פני השטח של PMs.
      3. הניחו את המיקרוספרות של PLGA באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להמיס את הג'לטין העטוף בעמוד השדרה של PLGA.
      4. יש לשטוף את ה-PLGA-HOPMs המתקבלים פעמיים במים שעברו דה-יוניזציה כדי להסיר את שאריות הג'לטין ולקרר מראש לליופיליזציה בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות.
      5. אחסנו את ה-PLGA-HOPMs היבשים בטמפרטורה של -20°C לניסויים נוספים.

3. הדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)

1. הפקידו PLGA-HOPMs על שלב הדגימה של SEM (ראו טבלת חומרים) ב-RT והכניסו את שלב הדגימה לתא הפיזור של מפזר המגנטרון. הפעל את השנאי והמגנטרון בזה אחר זה. הציגו את הדגימה ל-SEM לאחר שהייתה מצופה בזהב למשך דקה אחת.
2. השג את תמונות ה- SEM על ידי הגדרת מתח התאוצה ב- 5 kV.
3. בנוסף, כמת את גודל החלקיקים של PLGA-HOPMs באמצעות 100 PMs בשדה המשתנה של הדמיית SEM. מדוד את התוצאה המייצגת כדי לכמת את התפלגות גודל הנקבוביות.
   1. פתח את הגרפיקה עם תמונה J והשתמש ב"קו ישר "כדי להתאים לסרגל קנה המידה של תמונת ה- SEM, מה שגורם לתוכנה לזהות פיקסל לאורך.
   2. לחץ על נתח > להגדיר קנה מידה, להגדיר את "מרחק ידוע" לסרגל קנה המידה של התמונה SEM, ולחץ על > הכללית אישור.
   3. לחץ על נתח > כלים > מנהל ROI ... כדי למדוד את גודל הנקבובית או החלקיקים של PLGA PMs ולחץ על הוסף אותו. מדוד את מספר הדגימות בהתבסס על הדרישה.
   4. לחץ על מדידה כדי לקבל את הנתונים הכמותיים של הגרפיקה לחישוב נוסף.

4. תרבית תאים והדמיית פלואורסצנציה

הערה: תאי גזע מזנכימליים של מח עצם חולדה (BMSCs) שימשו לעבודה הנוכחית. התאים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. תרבית את התאים במדיום הנשר המהונדס של דולבקו בתוספת L-גלוטמין (DMEM/F-12), סרום בקר עוברי 10% (v/v) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה של התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
2. מעבירים את ה-BMSCs של החולדות ביחס של 1:2 לאחר שהגיעו ל-90% מהמפגש.
3. בצע הידבקות תאים בהתאם לשלבים הבאים.
   1. דגרו את ה-PLGA-HOPMs עם אלכוהול אתילי (5 מ"ל, 70%, v/v) וצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 10 דקות ב-RT כדי לעקר.
   2. שטפו את ה-PLGA-HOPMs המעוקרים פעמיים בתמיסת חיץ פוספט.
   3. דגירה של ה-HOPMs (חמישה במספר) עם מתלה התא (5 מ"ל, 1 x 10^{5 תאים} /מ"ל) בצינור צנטריפוגה סטרילי (50 מ"ל) תחת תרבית דינמית להידבקות BMSCs ל-PLGA-HOPMs.
   4. בצע את התרבית הדינמית בשייקר אספטי תרמוסטטי (37 °C, 90 סל"ד) על ידי הצבת צינור צנטריפוגה אטום של 50 מ"ל בשייקר (ראה טבלת חומרים).
      הערה: התרבית הדינמית מתכוונת לשפר את קצב ההיצמדות של BMSCs על הפיגומים, במקום לדגור ישירות את ה- PMs והתאים על צלחת הפלסטיק. התאים ו- PLGA PMs מתווספים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל, דגירה של הצינור בשייקר אספטי תרמוסטטי (37 מעלות צלזיוס, 90 סל"ד) והחלפת המדיה כל יומיים.
4. בצע את בדיקת הכתם הכפול החי והמת.
   1. שטפו את ה-PMs עמוסי התאים שלוש פעמים כדי להפוך את ה-BMSCs ללא חיבור ל-PLGA-HOPMs.
   2. הנח את ה-PMs עמוסי התאים על צלחת תחתית הזכוכית בקוטר 35 מ"מ. הוסף 1 מ"ל של חיץ צביעה (ראה טבלת חומרים), כולל 1 μL של calcein-AM ופרופידיום יודיד (PI), בהתאמה, לדגימה שטופה מראש על-ידי PBS.
   3. הערך את הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית (ראו טבלת חומרים). הפעל את אור העירור של 488 ננומטר ו-552 ננומטר בגלאי המתאים. לניתוח שכבת-על z, הגדר את ה-z-wide כדי ללכוד את השכבות השונות של הדגימה על ידי תנועת ציר z של המיקרוסקופ.
      הערה: ראוי לציין כי ניתן להשתמש בכתמים האחרים כראוי לניתוח.

תוצאות

בהתבסס על עבודה קודמת שביצעה אופטימיזציה של הפרמטרים העיקריים¹, PLGA הומסה בממס DCM הניתן לאידוי. תחליב ה- W/O הראשוני הוכן על ידי הומוגניזציה עם ג'לטין תחת טיפול בדיקה קולי. המבנה הזורם המשותף המותאם אישית הורכב בצורה פשטנית, שבה נעשה שימוש במזרק כדי להציג את הזרימות ללא הרף. יתר על...

Discussion

מאמר זה מתאר אסטרטגיה יעילה לייצור ארכיטקטורות מבוססות PLGA, כלומר PLGA-HOPMs. יש לציין כי יש לנקוט בזהירות במספר צעדים קריטיים, כולל הימנעות מהתנשאות ממס של PLGA והתאמה עדינה של הכוח הקולי למצב המטרה במהלך הכנת התחליב. בנוסף, מוצא נוזלי של מזרק 20 מ"ל יכול להיות מותאם במידה מסוימת כדי לפתור את הפרדת ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100