ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

Summary

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

Abstract

גרורות נותרו הגורם העיקרי למוות הקשור לסרטן. רצף האירועים המאפיינים את המפל הגרורתי מציג הזדמנויות רבות להתערבות טיפולית, והיכולת למדל אותם במדויק בעכברים היא קריטית להערכת השפעותיהם. כאן, מוצג פרוטוקול שלב אחר שלב להקמת גידולי שד ראשוניים אורתוטופיים ומעקב אחר התבססות וצמיחה של נגעים גרורתיים בריאה באמצעות הדמיה ביולומינסנציה in vivo . מתודולוגיה זו מאפשרת להעריך את הטיפול או את השפעותיו הביולוגיות לאורך כל טווח ההתפתחות הגרורתית, החל מבריחת הגידול הראשונית ועד לצמיחת יתר בריאות. גידולים אורתוטופיים בשד נוצרים בעכברים באמצעות הזרקה של תרחיף תאים המסומן בלוציפראז בבלוטת החלב הרביעית. גידולים מורשים לגדול ולהתפשט למשך פרק זמן מסוים ולאחר מכן מועברים בניתוח. עם הכריתה מתגלה גרורות ריאה ספונטניות, והגידול לאורך זמן מנוטר באמצעות הדמיית ביולומינסנציה in vivo . בנקודת הסיום הרצויה של הניסוי, ניתן לאסוף רקמת ריאה לניתוח במורד הזרם. הטיפול בגרורות מבוססות וברורות קלינית הוא קריטי לשיפור התוצאות עבור חולי סרטן בשלב IV, וניתן להעריך אותו באמצעות מודלים של גרורות ריאה ניסיוניות. עם זאת, הפצה גרורתית מתרחשת בשלב מוקדם של סרטן השד, וחולות רבות סובלות ממחלה סמויה, תת-קלינית מפושטת לאחר הניתוח. שימוש במודלים ספונטניים כמו זה מספק הזדמנות ללמוד את כל הספקטרום של המחלה, במיוחד את ההשפעות המערכתיות המונעות על ידי טיפול בגידול הראשוני כגון פרימת נישה טרום גרורתית, ולהעריך טיפולים במחלה רדומה ותת קלינית לאחר הניתוח.

Introduction

גרורות - התפשטות תאים סרטניים מהגידול הראשוני לחלקים אחרים של הגוף - נותרה סיבת המוות ביותר מ -90% מחולי הסרטן. תהליך זה מורכב, וכולל נדידה של תאי הגידול אל מחוץ לגידול הראשוני ואינטרוואסיציה למחזור הדם, הישרדות בדם, אקסטרווסציה והישרדות באיבר המטרה, השבה מחדש של מצב השגשוג וצמיחה¹. מודלים ספונטניים ומושתלים של סרטן מורין שימשו לחקר שלבים מוקדמים או מאוחרים של גרורות, כל אחד מהם מציג יתרונות וחסרונות משלו, שנדונו ביסודיות ^2,3,4.

בניגוד למה שחשבו בעבר, תאי הגידול נוטשים את הגידול הראשוני בשלבים מוקדמים במהלך התפתחות הגידול, ולעיתים נשארים רדומים ברקמות מרוחקות לפרקי זמן ארוכים 5,6,7,8. בנוסף, ישנן עדויות מצטברות להשפעות המערכתיות החזקות שיש לגידול הראשוני על תוצאות המחלה, המתבטאות לעיתים קרובות בהפרשת גורמים מסיסים ואקסוזומים המרככים את הקרקע הגרורתית או מעוררים בזבוז שרירים במהלך קכסיה 9,10,11,12. מסיבות אלה, מידול אורך התהליך הגרורתי בנוכחות הראשונית של הגידול הראשוני הפך חיוני להשגת הבנה מלאה יותר של הביולוגיה המניעה תהליכים אלה ולבחינת התערבויות חדשות פוטנציאליות שמטרתן לשבש או לעכב את התהליך.

בעבודה זו מתואר פרוטוקול לכימות גרורות ריאה הנובעות באופן ספונטני מקווי תאים הניתנים למעקב המוזרקים אורתוטופית בבלוטת החלב, תהליך המודל את כל השלבים הנ"ל במפל הגרורתי. מודלים להשתלה של גרורות ידועים כמייצגים יותר גרורות אנושיות בהשוואה למודלים ספונטניים של סרטן המונע גנטית, ובכך משפרים את יכולת התרגום הקליני². יתר על כן, פרוטוקול זה משתמש בהדמיית ביולומינסנציה כדי לחקור את הצמיחה וההתקדמות של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד ראשוניים בזמן אמת בבעלי חיים חיים, ובכך משפר את היעילות לעומת הערכות מסורתיות יותר המבוססות על היסטולוגיה של הפצה גרורתית. פרוטוקול זה כולל גם הערכה של גרורות ספונטניות לאחר הסרה כירורגית של הגידול הראשוני, שהוא גם רלוונטי קלינית וגם מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעה של מחלה שיורית מינימלית על התהליך הגרורתי. לבסוף, השימוש בעכברים בעלי יכולת חיסונית מעניק יתרון בכך שהוא מאפשר למערכת חיסון שלמה לעצב את התהליך הגרורתי, כפי שקורה בביולוגיה האנושית^10,11.

Protocol

כל הנהלים והפרוטוקולים של בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וירג'יניה.

1. הכנת תאים להזרקה

1. הפשרת תאי EO771 מותמרים של לוציפראז¹³ מאחסון חנקן נוזלי וצלחת 1 x 10⁶ תאים בצלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ בתווך תרבית תאים שלמה (RPMI1640 + 10% FBS + 1% פניצילין/סטרפטומיצין + 1% אמפוטריצין B).
2. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 עד למפגש של 80%-90%, עם שינויים בינוניים כל 2-3 ימים לפי הצורך.
3. כדי לקצור תאים, שאפו תרבית תאים בינונית ושטפו עם 1x PBS. לדגור עם 2 מ"ל של 0.25% תמיסת טריפסין-EDTA במשך כ 2-3 דקות ב 37 ° C עד התאים להתנתק ולאחר מכן לשטוף עם 8 מ"ל של מדיום מלא כדי להרוות את התגובה.
   הערה: חשיפה ממושכת של התאים לטריפסין תגרום להפשטת חלבוני פני השטח של התא מהממברנה, ובסופו של דבר תגרום למוות תאי.
4. מעבירים את התוכן לצינור צנטריפוגה של 10 מ"ל ומטילים את התאים על ידי סיבוב ב 350 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים ב 10 מ"ל של 1x PBS.
5. אספו דגימה של 50 μL לספירה ולאחר מכן כפו מחדש את התאים על ידי סיבוב ב 350 x גרם במשך 5 דקות.
   1. בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה, הוסיפו 50 μL של טריפאן כחול לדגימה של 50 μL וספרו את מספר התאים הקיימים באמצעות המאציטומטר. תאים בני קיימא עם קרומי תאים שלמים יוציאו את הצבע ויישארו צלולים לאחר הוספת כחול טריפאן, בעוד שתאים גוססים/מתים יאפשרו לצבע להיכנס לציטופלסמה ולהפוך לכחול.
   2. קבע את אמצעי האחסון הדרוש להשעיה מחדש של תאים ב- 6 x 10⁶ תאים בני קיימא/מ"ל (ריכוז תאים ברי קיימא [תאים ברי קיימא/מ"ל]) באמצעות הנוסחה הבאה:
      מספר ממוצע של תאים קיימא ב 4 קבוצות של 16 ריבועים × גורם דילול × 1 x 10⁴ תאים / מ"ל
6. לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את התאים סטרילי 1x PBS בנפח המחושב הדרוש כדי לדלל תאים ל 6 x 10⁶ תאים / מ"ל. מעבירים את תרחיף התא לצינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל ושומרים על קרח עד שהוא מוכן להזרקה.

2. זריקות כרית שומן חלב

הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול הנוכחי עם כל זן עכבר, אך בהתחשב בעניין שלנו במיקרו-סביבה החיסונית, אנו משתמשים בעכברי C57BL6. נקבות, עכברים בתולים בני 6-8 שבועות משמשים בדרך כלל למחקרי סרטן השד, מכיוון שזוגיות משפרת תהליכי גידול.

1. הפשירו את מטריצת קרום המרתף מופחתת גורם גדילה על קרח ושמרו על קרח עד להזרקה.
2. מרדימים עכברים בתא זירוז באמצעות איזופלורן 4%-5%. אשר מישור מספיק של הרדמה על ידי הערכה של חוסר רפלקס צביטת הבוהן ולהוריד את הגז ל 2% isoflurane לתחזוקה במהלך ההליך.
   זהירות: איזופלורן הוא חומר הרדמה בשאיפה חסר ריח הידוע כמגרה לעיניים ולעור ורעיל למערכת העצבים המרכזית. יש להשתמש בו בסביבה עם אוורור הולם. חשיפה ארוכת טווח או כרונית לאיזופלורן עלולה להיות בעלת השפעות בריאותיות שליליות. יש להשתמש בציוד הרדמה וטרינרי המכויל כראוי, משתמש במערכות ניקור גזים ומתוחזק לעיתים קרובות על ידי צוות וטרינרי.
3. יש לגלח את השיער על בטנו של העכבר באמצעות קוצץ חשמלי ולאחר מכן להניח במצב שכיבה בחרוט אף המחובר למכונת הרדמה באמצעות שיעור איזופלורן תחזוקה של 2%. החל משחה אופתלמית על כל עין של החיה כדי למנוע פגיעה הקרנית.
4. יש לשפשף בניתוח את אזור הבטן שלוש פעמים בתנועה מעגלית באמצעות סבבים מתחלפים של 70% אתנול ותמיסת פובידון-יוד. אשר מישור מספיק של הרדמה על ידי הערכה של חוסר רפלקס צביטת הבוהן.
5. באמצעות מספריים, לבצע חתך קטן קו האמצע (בדרך כלל ~ 1 ס"מ) דרך עור הבטן ברמה של רקמת החלב 4, לחשוף אבל לא חודר דרך הצפק הבסיסי.
   הערה: ניתן להשתמש בפרוצדורות אחרות להשתלת תאי גידול בבלוטת החלב, כגון זריקה תת עורית או חיסון תוך צינורי. בעוד פולשני במקצת, הליך כירורגי זה הוא פשוט ללמוד ולשלוט, ויזואליזציה של כרית השומן משפר באופן משמעותי את הדיוק, עם סיכון קטן של הזרקה מחוץ בלוטת החלב, אשר קריטי להסרה יעילה לאחר מכן של הגידול.
6. באמצעות מלקחיים, להחזיק את העור הרחק הצפק. השתמשו במקלוני צמר גפן סטריליים טבולים במי מלח כדי להפריד את העור מהצפק, לנוע לרוחב כדי לחשוף את כרית שומן החלב הימנית. חזור על הפעולה בצד שמאל כדי לחשוף את כרית שומן החלב השמאלית.
7. השהה מחדש את מתלה התאים EO771 באמצעות פיפטה ידנית והעבר 100 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל. מוסיפים נפח שווה של תמיסת מטריצת קרום מרתף ומערבבים היטב, תוך הקפדה לא להכניס בועות, ולשמור על קרח. תרחיף התאים הסופי יכיל כעת 150,000 תאים לכל 50 מיקרוליטר.
8. ציירו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך מזרק אינסולין U-100 28G 0.5 מ"ל ושמרו על קרח.
9. בעזרת מלקחיים, הרימו את העור ותפסו וחשפו בעדינות את כרית שומן החלב הנכונה. הזריקו 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך כרית שומן החלב והמתינו 3-5 שניות לפני הסרת המזרק מכרית שומן החלב כדי לאפשר למטריצה להתחיל להתמצק ולהקטין את הסיכוי שתרחיף התא יזרום חזרה דרך אתר ההזרקה. בסוף ההזרקה תיווצר בועה קטנה.
10. שחררו את העור מהמלקחיים, ואפשרו לכרית שומן החלב לחזור באופן טבעי למקומו הרגיל. חזור על ההליך עם כרית שומן החלב השמאלית, והצבת המזרק המכיל את השעיית התא בחזרה על קרח בין הזרקות.
11. יש לסגור את החתך בעור, תוך מריחת סיכות עור. אורך החתך יקבע את מספר סיכות העור הנדרשות, כאשר רוב ההליכים דורשים סיכות אחד עד שניים לכל חתך. יש לוודא שיש מרחק מינימלי של 0.5 ס"מ בין הסיכות.
12. עם סגירת הניתוח, להעביר את העכבר לכלוב התאוששות נקי. יש לפקח לפי הצורך עד לזכויות בעלי החיים עצמם ולחזרה להתנהגות רגילה. מתן 40 μL של meloxicam (2 מ"ג / מ"ל) תת עורית לשליטה בכאב כל 24 שעות במשך 3 ימים. לחלופין, מינון פורמולציה בשחרור איטי של אופיואיד כמו buprenorphine יכול להינתן בזמן ההליך, אשר יימשך 72 שעות.
13. יש לעקוב אחר בעלי החיים מדי יום במשך 5 הימים הראשונים לאחר הניתוח, להעריך את משקל בעלי החיים ואת כל סימני המצוקה, כגון פרווה לא מטופחת, גב כפוף והפרשות אף או עיניים בצבע חום-אדמדם.
14. בדקו את בעלי החיים לאיתור סימנים לזיהום בפצע, כגון אריתמה או נמק באתר הניתוח ושמירה על מקום החתך, והקריבו באופן הומני בעלי חיים המאבדים >20% ממשקל גופם ההתחלתי או העומדים בקריטריונים למצוקה חמורה, כפי שמתואר בהנחיות IACUC הספציפיות למוסד.

3. כריתות גידול

1. השתמש בקליפרים כדי לעקוב אחר צמיחת הנגע האורתוטופי של גידול השד 3 פעמים בשבוע על ידי מדידות של אורך הגידול הראשוני (L) ורוחבו (W). חישוב נפח הגידול באמצעות הנוסחה:
   πLW²/6
   1. לקבוע כריתה של הגידול באופן אמפירי בהתאם לקו התאים הספציפי שהוזרק. תמיד להסיר גידולים בגודל הקטן ביותר האפשרי כדי להפחית את הסיכויים לצמיחה מחדש. עבור תאי EO771 המתוארים בפרוטוקול זה, בצע כריתה של הגידול כאשר הגידולים מגיעים לנפח^{של 150} מ"מ 3.
      הערה: הזמן האופטימלי של כריתות צריך להיקבע עבור שורות תאים בודדים, אבל 150 מ"מ³ היא נקודת התחלה טובה, כמו ההליך יכול ביעילות להסיר את כל הגידול ברגע המשתמש הוא חווה.
2. מרדימים את העכברים בתא אינדוקציה באמצעות איזופלורן 4%. יש לתת 40 μL של meloxicam (2 מ"ג/מ"ל) תת עורית לשליטה בכאב, ולאחר מכן להניח את העכבר במצב שכיבה בתוך חרוט אף המחובר למכונת הרדמה באמצעות שיעור איזופלורן תחזוקה של 2%. החל משחה אופתלמית על כל עין של החיה כדי למנוע פגיעה הקרנית.
   הערה: משכך כאבים צריך להיות מנוהל כל 24 שעות במשך 3 ימים. לחלופין, מינון פורמולציה בשחרור איטי של אופיואיד כמו buprenorphine יכול להינתן בזמן ההליך, אשר יימשך 72 שעות.
3. הסר סיכות כירורגיות קודמות, במידת הצורך, וקרצף בניתוח את אזור הבטן שלוש פעמים בתנועה מעגלית באמצעות סבבים מתחלפים של 70% אתנול ותמיסת פובידון-יוד. אשר מישור מספיק של הרדמה על ידי הערכה של חוסר רפלקס צביטת הבוהן. באמצעות מספריים, לבצע חתך קטן קו האמצע (בדרך כלל ~ 1 ס"מ) דרך עור הבטן ברמה של רקמת החלב 4, לחשוף אבל לא חודר דרך הצפק הבסיסי.
4. השתמש בדיסקציה קהה כדי להפריד את הגידול האורתוטופי מהצפק ומהעור שמעליו. הסר את הגידול האורתוטופי על ידי חיתוך דרך רקמת החלב הרגילה הממוקמת בסמיכות ובאופן מרוחק לגידול באמצעות מספריים והשלך את רקמת הגידול לשקית מסוכנת ביולוגית. חזור על הפעולה עם הגידול הנגדי. אם מתרחש דימום, במהירות לצרוב את כלי הדם.
   הערה: אם גידולים אורתוטופיים חדרו לצפק, עדות לכך היא גידול שאינו מוגבל היטב או ניתן להפרדה קלה מהצפק על ידי דיסקציה קהה, יש להקריב בעלי חיים, שכן הסרת הגידול לא תהיה שלמה, והוא יצמח מחדש, מה שיוביל לבלבול של אות ביולומינסנציה ברקע ותחלואה.
5. השתמש באחד עד שלושה סיכות כדי לסגור את אתר הניתוח ולהעביר את העכבר לכלוב התאוששות נקי עם כרית חימום חמה מתחתיו כדי לשפר את ההתאוששות של בעל החיים לאחר הליך כריתת הגידול. יש לפקח לפי הצורך עד לזכויות בעלי החיים עצמם ולחזרה להתנהגות רגילה.
   1. עבור בעלי חיים שאיבדו קצת דם במהלך ההליך, לתת זריקה 300 μL של מי מלח סטריליים 0.9% נורמלי מנוהל intraperitoneally לאחר סגירת אתר הניתוח.
   2. במידת הצורך, צלם את בעלי החיים בשלב זה עבור אות ביולומינסנציה, כמתואר בשלב 4., כדי להעריך את שלמות כריתת הגידול ואת המחלה השיורית המינימלית הבסיסית. אם הכריתה לא הושלמה ונותר אות ביולומינסנציה באזור הגידול הראשוני, יש להקריב את בעל החיים באופן הומני, שכן גדילת תאי הגידול הנותרים עלולה לגרום לבלבול של אות הביולומינסנציה ברקע.
6. יש לעקוב אחר בעלי החיים מדי יום במשך 5 הימים הראשונים לאחר הניתוח, להעריך את משקלם של בעלי החיים ואת כל סימני המצוקה, כגון פרווה לא מטופחת, גב כפוף והפרשות אף או עיניים בצבע חום-אדמדם.
7. בדוק את בעלי החיים עבור סימנים של זיהום הפצע, כגון אריתמה באתר כירורגי או נמק ושמירה על אתר החתך. הקרבת בעלי חיים המקריבים באופן הומני המאבדים >20% ממשקל גופם ההתחלתי או העומדים בקריטריונים למצוקה חמורה, כפי שמתואר בהנחיות IACUC הספציפיות למוסד.

4. כימות In vivo של גרורות ריאה ספונטניות

1. בצע הדמיה in vivo של בעלי החיים ביום כריתת הגידול כדי לקבוע אות בסיסי, ולאחר מכן 2-3 פעמים בשבוע לאחר מכן כדי להעריך את הצמיחה של נגעים ספונטניים של גידולי ריאה גרורתיים.
2. לחץ על Initialize כדי להפעיל את מכשיר ההדמיה לחימום בזמן שבעלי החיים מוכנים להליך.
3. מרדימים את העכברים בתא אינדוקציה באמצעות 4% איזופלורן ומאשרים מישור מספיק של הרדמה על ידי הערכה להיעדר רפלקס צביטת בוהן. ודא כי חמצן והרדמה isoflurane זורם למכשיר ההדמיה.
4. הזריקו לבעלי החיים 100 מיקרוליטר של תמיסת D-לוציפרין (15 מ"ג/מ"ל ב-PBS סטרילי) באמצעות הזרקה רטרו-אורביטלית על ידי החדרת המחט לקנטוס המדיאלי של העין בזווית של 45° מהאף. הכנס את המחט עד שתורגש התנגדות גרמית, ואז משוך את המחט ב~1 מ"מ לפני הזרקת תמיסת D-luciferin כדי להבטיח שהמחט ממוקמת בתוך הסינוס הוורידי הרטרואורביטלי.
   הערה: פתרון D-luciferin יכול להיות מועבר על ידי מסלולים אחרים, כגון הזרקה intraperitoneal או תת עורית, עם זאת, הקינטיקה של מטבוליזם המצע יהיה ארוך יותר ואת ההתפלגות לאיברים שונים הטרוגנית.
5. יש לוודא הזרקה מוצלחת על ידי חוסר שטיפה של נוזל כלשהו עם הלידה ולהמתין 2 דקות לפני ההדמיה. בזמן ההמתנה, העבירו את בעלי החיים לקונוסים הממוקמים בתוך ההדמיה הביולומינסנטית במצב שכיבה והפחיתו את האיזופלורן לשיעור תחזוקה של 2%.
6. לפני רכישת תמונת ביולומינסנציה של החיה, ודא שתיבת הסימון שליד תצלום מסומנת כדי להשיג בו זמנית תצלום של בעל החיים באמצעות קשירה בינונית ו- f/stop 8. ודא שתיבת הסימון לצד שכבת-על מסומנת כדי לכסות את התצלום בתמונת ביולומינסנציה. הגדר את זמן החשיפה לדקה אחת, עם binning בינוני, f/stop = 1, וצלם תמונה על ידי לחיצה על Acquire.
7. מדוד שטף פוטונים באופן הבא. צור ROI ריבועי באמצעות התפריט הנפתח של כלי החזר ההשקעה עבור כל חיה המתוארת בתמונה, על ידי לחיצה על כפתור החזר ההשקעה בריבוע . מקם מחדש את החזר ההשקעה שנוצר באופן אוטומטי על בית החזה של כל חיה על ידי לחיצה וגרירה עם העכבר.
8. לחץ על הלחצן Measure ROIs וודא שהנתונים מוצגים כרדיאנס (פוטונים/ים) ולא נספרים, כך שניתן יהיה להשוות תמונות שנרכשו עם זמני חשיפה שונים.

5. איסוף רקמות ריאה לניתוח היסטולוגי

הערה: ניתן להקריב בעלי חיים כמתואר להלן בכל נקודת זמן ניסיונית או כאשר בעלי חיים עומדים בקריטריונים להקרבה הומנית, בהתאם להנחיות IACUC ספציפיות למוסד. מניסיוננו, עכברים מגיעים לנקודת הקצה ההומנית כ-21-28 ימים לאחר כריתת הגידולים הראשוניים.

1. מרדימים את העכברים בתא אינדוקציה באמצעות 4% איזופלורן ומאשרים מישור מספיק של הרדמה על ידי הערכה להיעדר רפלקס צביטת בוהן. לאחר מכן, הרדימו את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם.
2. השתמש מספריים כדי לבצע חתך קו האמצע מתחת לתהליך xyphoid, לחתוך דרך העור, שרירים, פריטוניום לחשוף את החלק התחתון של חלל החזה, עד הסרעפת גלוי. נקב את הסרעפת כדי למוטט את הריאות ולאחר מכן לחתוך דרך הסרעפת.
3. חותכים דרך כלוב הצלעות בצד ימין ושמאל ולאחר מכן משתמשים בהמוסטאט כדי לתפוס את תהליך הקסיפואיד ולהזיז את כלוב הצלעות מהדרך, לחשוף את הלב והריאות. גזור את האטריום הימני באמצעות מספריים.
4. לערבב את החיה עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח דרך החדר השמאלי ולהעריך את שלמות הזילוח על ידי אישור כי נוזל זורם מן האטריום הימני הופך ברור וכי הכבד הופך צבע צהוב חיוור.
5. זהה את קנה הנשימה והכנס מזרק מחט 22G עם 3 מ"ל של 4% paraformaldehyde, מחזיק אותו במקביל קנה הנשימה. לספק את הפתרון בקצב איטי עד שהריאות מנופחות לחלוטין. החזיקו את קנה הנשימה עם מלקחיים מעל המחט, והסירו לאט את המחט כדי למנוע זרימה חוזרת.
   הערה: קשירת תפר מתחת לקנה הנשימה לפני הזרקת הקיבוע, ולאחר מכן קשירת התפר סביב קנה הנשימה לאחר ההזרקה, עשויה להיות אפשרות נוספת למניעת זרימה חוזרת של הקיבוע.
6. ממשיכים להחזיק בעדינות את קנה הנשימה, חותכים אותו במספריים מעל המלקחיים, ומתחילים להרים בזהירות את הרקמה תוך הסרת כל רקמת החיבור. נתחו את הלב הרחק מהריאות.
7. הניחו את רקמת הריאה ב-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך הלילה ואחסנו בטמפרטורה של 4°C לצורך קיבוע. העבר את הרקמה ל- PBS המכילה 0.05% נתרן אזיד לאחסון לטווח ארוך או תהליך נוסף לניתוח היסטולוגי, לפי הצורך.

תוצאות

הזרקה אורתוטופית של שורות תאי סרטן עכבר לתוך כרית שומן החלב הרביעית של עכברים היא הליך ניתן לשחזור ואמין לגרימת גידולים ראשוניים בעכבר. באמצעות שימוש בקו התאים EO771 שהומר עם לוציפראז בתנאים המתוארים בפרוטוקול זה, גידולים ראשוניים הופכים למוחשיים וניתן למדוד אותם באמצעו?...

Discussion

ככל שמכירים יותר ויותר באופי המוקדם של הפצה גרורתית ובהשפעות המערכתיות של סרטן, הצורך במודלים שבהם נלקחים בחשבון שני הגורמים הקריטיים הללו הופך להכרח. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר שאריות מזעריות של מחלה וצמיחה של גרורות ריאה המתרחשות באופן ספונטני מגידולי שד רא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061