מודל חדשני של פצעי עור Ex Vivo Ovine בתפוקה גבוהה לבדיקת אנטיביוטיקה מתפתחת

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב להגדרת מודל עור פצוע ex vivo ovine הנגוע בסטפילוקוקוס אאורוס. מודל תפוקה גבוהה זה מדמה טוב יותר זיהומים in vivo בהשוואה לטכניקות מיקרוביולוגיה קונבנציונליות ומציג לחוקרים פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לבדיקת היעילות של מיקרוביאלים מתפתחים.

Abstract

פיתוח של מיקרוביאלים הוא תהליך יקר עם שיעורי הצלחה נמוכים יותר ויותר, מה שהופך את ההשקעה הנוספת במחקר גילוי מיקרוביאלי לפחות אטרקטיבית. גילוי תרופות אנטי-מיקרוביאליות והמסחור שלאחר מכן יכולים להיות משתלמים יותר אם ניתן ליישם גישה של כישלון מהיר ונכשל בזול בשלבי אופטימיזציה של עופרת שבהם לחוקרים יש שליטה רבה יותר על תכנון וניסוח תרופות. במאמר זה, ההגדרה של מודל עור פצוע ex vivo ovine נגוע Staphylococcus aureus מתואר, שהוא פשוט, חסכוני, תפוקה גבוהה, וניתן לשחזור. הפיזיולוגיה החיידקית במודל מחקה שבזמן ההדבקה התפשטות חיידקית תלויה ביכולתו של הפתוגן לפגוע ברקמה. הקמת זיהום הפצע מאומתת על ידי עלייה בספירת חיידקים קיימא בהשוואה לאינוקולום. מודל זה יכול לשמש כפלטפורמה לבדיקת היעילות של מיקרוביאלים מתפתחים בשלב אופטימיזציה של עופרת. ניתן לטעון כי זמינותו של מודל זה תספק לחוקרים המפתחים חומרים אנטי-מיקרוביאליים מודל של כישלון-מהיר-וכישלון-זול, אשר יסייע להגדיל את שיעורי ההצלחה בניסויים הבאים בבעלי חיים. המודל גם יאפשר הפחתה ועידון של השימוש בבעלי חיים למחקר ובסופו של דבר יאפשר תרגום מהיר וחסכוני יותר של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים לזיהומים בעור וברקמות רכות למרפאה.

Introduction

זיהומי עור הם נושא עולמי חשוב, עם עלויות כלכליות גדולות לספקי שירותי בריאות ברחבי העולם. הפיתוח של עמידות רב-תכליתית ויצירת ביופילם על ידי פתוגנים ממלא תפקיד מפתח בשכיחות של פצעים שאינם מחלימים 1,2,3,4. כתוצאה מכך, זיהומים בעור וברקמות רכות הם אחת הסיבות השכיחות יותר לאשפוז ממושך ולאחר מכן לאשפוז חוזר⁵. עיכובים בריפוי פצעים עולים ביוקר הן למטופלים והן לספקי שירותי הבריאות, כאשר חלק מההערכות גורסות כי כ-6.5 מיליון מטופלים נפגעים מדי שנה בארה"ב. בבריטניה, זיהומי עור וסיבוכים נלווים גורמים לכ-75,000 מקרי מוות בשנה ^2,4,6.

סטפילוקוקוס אאורוס (S. aureus) הוא פתוגן פצע אימתני המבודד לעתים קרובות מפצעי מטופלים ^2,7. קצב הופעתה של עמידות multidrug גדל באופן דרסטי בשנות ה -2000. במהלך תקופה זו, כ-60% מהזיהומים החריפים בעור ובמבנה העור היו חיוביים לתרבית עבור S. aureus¹ העמיד למתיצילין. המספר ההולך וגדל של זנים עמידים למולטי-דרוג בקרב סטפילוקוקים, ואכן פתוגנים אחרים, במהלך 2 העשורים האחרונים מצביע על צורך דחוף בפיתוח מהיר של אנטיביוטיקה עם דרכי פעולה חדשות שיכולות להתגבר על עמידות.

עם זאת, מאז תחילת שנות ה-2000, תוכניות גילוי אנטיביוטיקה נשלטו על ידי זמני התפתחות ארוכים יותר ושיעורי הצלחה נמוכים, כאשר רק 17% מהאנטיביוטיקה החדשנית שנכנסה לניסויים קליניים בארה"ב השיגה אישור שוק⁸. זה מצביע על פער בין התוצאות של בדיקות חוץ גופיות של אנטיביוטיקה מתפתחת לבין התוצאות הקליניות שלהן. ניתן לטעון כי פער זה נובע במידה רבה מהבדלים בפיזיולוגיה של חיידקים במהלך זיהומים in vivo ובמהלך שיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונליות בעת בדיקת היעילות של אנטיביוטיקה בשלבים הפרה-קליניים במבחנה . לכן, יש צורך בשיטות מעבדה חדשניות המייצגות יותר את הפיזיולוגיה של חיידקים במהלך ההדבקה כדי לשפר את שיעורי ההצלחה בתוכניות גילוי אנטיביוטיקה.

השיטות הנוכחיות לחקר זיהומי עור כוללות מחקרים בחיות חיות (למשל, עכברים), מודלים של עור ex vivo (למשל, חזיר), ומודלים תלת-ממדיים של עור מהונדסים על ידי רקמות (למשל, בני אדם)9,10,11,12. מחקרים בבעלי חיים חיים מוסדרים בקפדנות ובעלי תפוקה נמוכה יחסית. במודלים של בעלי חיים, פציעות וזיהומים גורמים למצוקה משמעותית לבעלי החיים ומעוררים חששות אתיים. מודלים של עור אנושי, ex vivo או מהונדסים רקמות, דורשים אישור אתי, עמידה בחקיקה מקומית ועולמית (חוק הרקמות האנושיות, הצהרת הלסינקי), ויש קושי ברכישת רקמות, כאשר חלק מהבקשות לוקחות שנים כדי למלא^13,14. שני סוגי המודלים הם עתירי עבודה ודורשים מומחיות משמעותית כדי להבטיח הצלחה ניסיונית. חלק מהמודלים הנוכחיים של זיהום עור ex vivo דורשים דיסקים ותוספים מחוסנים מראש למיטת הפצע כדי לאפשר זיהום; למרות שמודלים אלה שימושיים להפליא, ישנן מגבלות בתהליך ההדבקה שכן תוספים מגבילים את השימוש במיטת הפצע כמקור תזונתי^10,15,16,17. המודל המתואר במחקר זה אינו משתמש בתוספים למיטת הפצע, מה שמבטיח כי הפתולוגיה של זיהום וספירת תאים בת קיימא הם תוצאה של ניצול ישיר של מיטת הפצע כמקור ההזנה היחיד.

לאור הצורך בשיטות מעבדה חדשות, פותח מודל ex vivo ovine חדשני בעל תפוקה גבוהה של זיהומי עור לשימוש בהערכת היעילות של אנטיביוטיקה מתפתחת. מחקרים על דלקות עור מתמודדים עם אתגרים רבים - עלויות גבוהות, חששות אתיים ומודלים שאינם מראים תמונה מלאה^20,21. מודלים של Ex vivo ומודלים תלת-ממדיים מאפשרים הדמיה טובה יותר של תהליך המחלה וההשפעה שיכולה להיות לטיפולים ממודל רלוונטי יותר מבחינה קלינית. כאן מתוארת ההגדרה של מודל עור שחלות חדשני, שהוא פשוט, ניתן לשחזור, ורלוונטי מבחינה קלינית ובעל תפוקה גבוהה. עור הביצית נבחר מכיוון שכבשים הן אחד היונקים הגדולים המשמשים בדרך כלל למודלים של תגובות לזיהומים in vivo. יתר על כן, הם זמינים בקלות מ abattoirs, הבטחת אספקה קבועה של העור למחקר, ואת הפגרים שלהם הם לא צרוב, מה שמבטיח איכות רקמות טובה. מחקר זה השתמש ב- S. aureus כפתוגן המופתי; עם זאת, המודל עובד היטב עם מיקרואורגניזמים אחרים.

Protocol

ראשיהם של כבשים מ-R.B אליוט וסון אבטויר שימשו כמקור לדגימות עור בפרויקט זה. כל הטלאים נשחטו לצריכה כמזון. במקום להשליך את הראשים, אלה שימשו מחדש למחקר. לא היה צורך באישור אתיקה מכיוון שהרקמה מקורה בפסולת שהושלכה מאבטוארים.

1. עיקור

1. יש לחטא מלקחיים לפני איסוף הראשים על ידי לקיחת מלקחיים נקיים וביצוע עיקור בחום יבש בתנור בטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס למשך שעה. יש להשתמש בכל כלי הזכוכית בטמפרטורה של 121°C למשך 15 דקות לפני השימוש.
2. לבצע את כל העבודות המתוארות בתוך ארון מיקרוביולוגיה בכיתה 2. הכינו את כל הריאגנטים בהתאם להוראות היצרן.

2. איסוף דגימות

1. באבטואר, כבשי סוואלדייל נטבחו על ידי מהמם באמצעות חשמל או אקדח בשבי והוצאו. לאסוף ראשי כבש לא יותר מ 4 שעות לאחר השחיטה.

3. הכנת הראשים

1. יש לחטא את חלק המצח של הכבש על ידי שפיכת כ-100 מ"ל של תמיסת כלור דו-חמצני של 200 ppm על אזור הדגימה. לגלח את החלק המצח של הראש באמצעות קוצץ חשמלי לשטוף את האזור עם 200 מ"ל של 200 ppm כלור דו חמצני פתרון.
2. נגבו את האזור באתנול ובגליל כחול וכסו את אזור הדגימה בקרם להסרת שיער למשך 35 דקות. יש לגרד בעדינות את הקרם להסרת שיער באמצעות כלי גירוד ולהעריך את אזור הדגימה. אם נותרה כמות משמעותית של שיער, חזור על תהליך הסרת השיער.
3. השתמש עוד 200 מ"ל של תמיסת כלור דו חמצני כדי לשטוף את האזור, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול ולנגב עם גליל כחול.
4. באמצעות אגרוף ביופסיה סטרילי בקוטר 8 מ"מ, יש לגזור דגימות עור בקוטר 8 מ"מ מהאזור המוכן. הסר את הדגימות באמצעות מלקחיים סטריליים ואזמל בעל 15 להבים, כדי להבטיח שכל השומן העורי יוסר.
5. מניחים את הדגימות בצנצנת סטרילית של 0.5 ליטר מלאה בתמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS), ולאחר מכן מעבירים אותן לצינורות סטריליים של 50 מ"ל עם תמיסת 50 מ"ל של 200 ppm כלור דו-חמצני, הופכים פעמיים ומשאירים לעיקור למשך 30 דקות.
6. הסר את הדגימות מתמיסת הכלור הדו-חמצני ושטוף אותן על ידי הצבתן בצינור של 50 מ"ל מלא ב-40 מ"ל של PBS סטרילי. לאחר השטיפה, יש להניח כל דגימת עור בנפרד בבאר נפרדת של צלחת בת 24 בארות.
7. הוסף 350 μL של מדיום מחומם מראש תוך שמירה על הדגימה בממשק אוויר-נוזל. הרכב המדיה הוא כדלקמן: מדיה MK (בינוני 199 עם מלחי הנקס, L-גלוטמט, ו-1.75 מ"ג/מ"ל נתרן ביקרבונט) ו-F12 של Ham ביחס של 1:1, עם תוספת FBS (10% v/v), EGF (10 ננוגרם/מ"ל), אינסולין (5 מיקרוגרם/מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL) ואמפוטריצין B (2.5 מיקרוגרם/מ"ל).
8. אטמו את 24 לוחות הבאר עם אטם צלחת חדיר גז ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רקמות לחות של 5% CO₂ למשך עד 24 שעות.

4. תחזוקת דגימות עור

1. לאחר הדגירה, להסיר את מדיום התרבית ולשטוף את הדגימות ב 500 μL של PBS סטרילי. הוסיפו מדיה נטולת אנטיביוטיקה לכל דגימה ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רקמות לחות של 5% CO₂ למשך 24 שעות כדי להסיר שאריות אנטיביוטיקה בדגימה.
2. אם עכירות או זיהום פטרייתי מתפתחים במדיה נטולת אנטיביוטיקה לאחר 24 שעות, יש להשליך את הדגימה.

5. הכנת האינוקולום

1. הכינו צינור 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מרק סויה טריפטי סטרילי. קח צלחת אגר טרייה של S. aureus והשתמש במטוש כדי להעביר כמה מושבות לתוך המרק. דגירה במשך 18 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ב-150 סל"ד.
2. צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 3 דקות. הסר את supernatant ו להשעות את גלולת התא ב 10 מ"ל של PBS סטרילי. חזרו על הפעולה פעמיים כדי להבטיח שטיפה מספקת של התאים.
3. התאם את האינוקולום ל- 0.6 OD₆₀₀ ב- PBS סטרילי. אשר את עומס האינוקולום על ידי ביצוע ספירת צלחות ידנית בת קיימא.

6. זיהום של דגימות עור

1. הכינו צלחת טרייה של 24 בארות עם 400 מיקרוליטר של מדיה נטולת אנטיביוטיקה שחוממה מראש והוסיפו את 24 הבארות באמצעות מלקחיים סטריליים.
2. הסר את המדיה מדגימות העור, לשטוף עם 500 μL של PBS סטרילי, ולהסיר את הכביסה. השתמש מלקחיים סטריליים כדי להחזיק בעדינות את הדגימה בתחתית הבאר.
3. השתמש בביופסיית אגרוף בקוטר 4 מ"מ כדי ליצור דש פצע מרכזי, החודר לעומק גס של 1-2 מ"מ. לאחר מכן, השתמש באזמל בעל 15 להבים ומלקחיים של רקמת allis שיניים סטריליות כדי להסיר את השכבה העליונה של דש הפצע. השתנות בממדי הפצע עשויה להשפיע על תוצאות הזיהום ועל היחידות היוצרות את מושבת הקצה (CFU).
4. לאחר שכל הדגימות נפגעו, העבירו אותן לתוספות 24 הקידוחים באמצעות מלקחיים סטריליים. פיפטה 15 μL של האינוקולום החיידקי לתוך מיטת הפצע. לאחר מכן, דגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רקמות לחות 5% CO₂ .
5. אם יש צורך בתקופות דגירה ארוכות יותר, מוציאים את המדיה ומחליפים אותה במדיה טרייה כל 24 שעות ודוגרים באותם תנאים.

7. קביעת העומס החיידקי

1. הסר את המדיה מתחתית הבארות. עם מלקחיים סטריליים, להעביר כל דגימה לתוך צינור נפרד 50 מ"ל מלא 1 מ"ל של PBS סטרילי.
2. השתמש בהומוגנייזר בעל קצה דק כדי ליצור הומוגניזציה של פני השטח של הדגימה. היזהר כדי להבטיח כי המיטה הפצע הוא במגע ישיר עם קצה של homogenizer.
3. הומוגני כל דגימה במשך 35 שניות על בינוני/גבוה. ההומוגנייזר מנתק את החיידקים מפני השטח של מיטת הפצע כדי לאפשר ספירה של עומס החיידקים.
4. לאחר עיבוד כל הדגימות, מערבלים כל דגימה, בתורו, לפני הפיפטה. זאת כדי להבטיח שההומוגנט החיידקי מעורבב.
5. פיפטה 20 μL של הומוגנט מערבולת לתוך הבאר המקבילה של צלחת 96 באר המכילה 180 μL של PBS סטרילי.
6. יש לדלל באופן סדרתי כל דגימה הומוגנית ל-1 x 10⁻⁷ ופיפטה 10 μL של ההומוגנט המדולל על צלחת אגר סויה טריפטית במשולש.
7. דגירה צלחת אגר במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ספור את מספר המושבות כדי לקבוע את CFU עבור כל דגימה.

תוצאות

זיהוי מסלול לעיקור העור לפני הגדרת מודל זיהום הפצע היה מאתגר. האתגר היה לעקר את העור מבלי לפגוע בשכבות העור השונות, מה שעלול לגרום להשלכות לא מכוונות על תוצאות הזיהום. כדי לזהות משטר עיקור מתאים, נוסו טיפולים שונים לפרקי זמן משתנים, כמפורט בטבלה 1. זיהום נרשם כהתפתחות עכירות לאחר 48 ...

Discussion

פיתוח מיקרוביאלים הוא מיזם חשוב אך יקר, שעלותו מוערכת בכמיליארד דולר ונמשכת כ-15 שנה. מעל 90% מגילוי תרופות אנטי-מיקרוביאליות ומחקרים פרה-קליניים של יעילות תרופות אנטי-מיקרוביאליות מתבצעים על ידי חוקרים אקדמיים וחברות קטנות עד בינוניות עם בדרך כלל פחות מ-50 עובדים²². צוותים אלה מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX