JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ההרכב המבני של אלפא-סינוקלאין מונומרי משפיע על תפקודו הפיזיולוגי ועל תכונותיו הפיזיקוכימיות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבצע ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה וניתוחי נתונים מאוחרים יותר כדי לקבוע מידע קונפורמי על המונומר של חלבון זה בעל הפרעה פנימית בתנאים פיזיולוגיים.

Abstract

אלפא-סינוקלאין (aSyn) הוא חלבון בעל הפרעה פנימית, שאגרגטי הפיברילאר שלו מצויים בשפע בגופי לוי ובנוייריטים, שהם סימני ההיכר של מחלת הפרקינסון. עם זאת, חלק גדול מהפעילות הביולוגית שלו, כמו גם הצבירה שלו, כוללים באופן מרכזי את צורת המונומר המסיסה של החלבון. הבהרת המנגנונים המולקולריים של הביולוגיה והפתופיזיולוגיה של aSyn דורשת שיטות פתורות מאוד מבחינה מבנית והיא רגישה לתנאים ביולוגיים. המבנים המטא-יציבים שלה, המתגלגלים באופן מקורי, הופכים את ה-aSyn המונומרי לבלתי ניתן לתיקון לטכניקות רבות של ביולוגיה מבנית. כאן מתואר היישום של גישה אחת כזו: ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן/דאוטריום (HDX-MS) על ציר הזמן של אלפית השנייה לחקר חלבונים עם יציבות תרמודינמית נמוכה וגורמי הגנה חלשים, כגון aSyn. בקנה מידה של אלפית השנייה, נתוני HDX-MS מכילים מידע על נגישות הממס ועל המבנה הקשור למימן של aSyn, אשר הולכים לאיבוד בזמני תיוג ארוכים יותר, ובסופו של דבר מניבים רזולוציה מבנית עד לרמת חומצות האמינו. לכן, HDX-MS יכול לספק מידע ברזולוציות מבניות וטמפורליות גבוהות על דינמיקה קונפורמציה ותרמודינמיקה, אינטראקציות תוך-מולקולריות ובין-מולקולריות, וההשפעה המבנית של מוטציות או שינויים בתנאים הסביבתיים. למרות שהוא ישים באופן נרחב, הוא מודגם כיצד לרכוש, לנתח ולפרש מדידות HDX-MS של אלפיות השנייה ב- aSyn מונומרי.

Introduction

מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה נוירודגנרטיבית המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם1. הוא מאופיין על ידי היווצרות של תכלילים ציטופלסמיים הידועים בשם גופי לוי ונויריטים לוי באזור substantia nigra pars compacta של המוח. תכלילים ציטופלסמיים אלה נמצאו כמכילים אגרגטים של החלבון aSyn2 בעל הפרעה פנימית. ב-PD ובסינוקלינופתיות אחרות, aSyn הופך ממצב של הפרעה מסיסה למצב מחלה בלתי מסיס ומובנה מאוד. בצורתו המקורית, aSyn מונומרית מאמצת מגוון רחב של קונפורמציות המיוצבות על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות ארוכות טווח בין N ו-C-termini שלה לבין אינטראקציות הידרופוביות בין C-terminus שלה לבין רכיב בטא שאינו עמילואידי (NAC) באזור 3,4,5,6. כל שיבוש באותן אינטראקציות מייצבות, כגון מוטציות, שינויים לאחר תרגום ושינויים בסביבה המקומית, יכול להוביל לקיפול שגוי של המונומר, ובכך לעורר את תהליך הצבירה7.

בעוד שקיימת כמות עצומה של מחקר על הצורות האוליגומריות והפיברילאריות של aSyn 8,9,10,11, יש צורך מכריע לחקור את הצורה המונומרית של החלבון ולהבין טוב יותר אילו קונפורמרים מתפקדים (וכיצד) ואילו נוטים לצבור 8,9,10,11 . בהיותו בעל הפרעה פנימית, רק בגודל 14 kDa, וקשה להתגבש, המונומר aSyn אינו מקובל על רוב הטכניקות הביולוגיות המבניות. עם זאת, טכניקה אחת המסוגלת למדוד את הדינמיקה הקונפורמיונלית של aSyn מונומרית היא אלפית השנייה HDX-MS, אשר יצרה לאחרונה תצפיות מבניות חשובות שיהיו מאתגרות או בלתי אפשריות להשיג אחרת 12,13,14. אלפית השנייה HDX-MS מודדת ברגישות את הממוצע של ההרכב הקונפורמציה של החלבון על ידי ניטור ההחלפה האיזוטופית באמיד מימן, מה שמעיד על נגישות ממסים והשתתפות ברשת קשרי מימן של אזור חלבון מסוים על ציר הזמן של אלפית השנייה. יש צורך להדגיש את ההיבט של אלפית השנייה של HDX-MS שכן, בשל אופיו המטא-יציב, המתגלגל באופן מקורי, aSyn מציג קינטיקה מהירה מאוד של חילופי מימן המתבטאת הרבה מתחת לגבול התחתון של מערכות HDX-MS קונבנציונליות. לדוגמה, רוב מולקולת aSyn החליפה לחלוטין מימן עבור דאוטריום בתנאים תוך תאיים בפחות משנייה אחת. מספר מעבדות בנו כעת מכשור ערבוב מהיר; במקרה זה, אב טיפוס של מכשיר זרימת מרווה מהיר בערבוב מהיר המסוגל לבצע HDX-MS עם זמן מת של 50 אלפיות השנייה ורזולוציה זמנית של 1 אלפיות השנייה משמש15. בעוד אלפית השנייה HDX-MS היה לאחרונה חשוב מאוד במחקר של aSyn, זה עומד להיות בעל ערך בחקר חלבונים / אזורים מופרעים במהותם באופן נרחב יותר ומספר רב של חלבונים עם לולאות / אזורים שהם רק יציבים חלשה. לדוגמה, תרופות פפטידיות (למשל, אינסולין; GLP-1/גלוקגון; tirzepatide) וחלבוני היתוך פפטידים (למשל, מעכב ה- HIV FN3-L35-T1144) הם פורמטים עיקריים של תרופות שבהן מידע מבני ויציבות בשלב התמיסה יכול להיות קלט קריטי להחלטות פיתוח תרופות, ובכל זאת, הפפטיד מואטי הוא לעתים קרובות רק יציב חלש ובלתי ניתן לתיקון על ידי HDX-MS בלוח הזמנים של השניות 16,17,18,19,20 . שיטות HDX-MS מתפתחות עם תיוג בתחומים של שניות/דקות הוכחו כמפיקות מידע מבני עבור דנ"א G-quadxes, אך יש לאפשר להרחיב זאת למבנים אוליגונוקלאוטידים מגוונים יותר על ידי יישום של אלפית השנייה HDX-MS21.

ניסויי HDX-MS יכולים להתבצע בשלוש רמות שונות: (1) מלמטה למעלה (לפיה החלבון המסומן מתעכל באופן פרוטאוליטי), (2) אמצע-מטה (לפיו החלבון המסומן מתעכל באופן פרוטאוליטי, והפפטידים המתקבלים מקוטעים עוד יותר על ידי טכניקות פיצול רך), ו-(3) מלמעלה למטה (לפיהם טכניקות פיצול רך מפרקות ישירות את החלבון המסומן)22 . לפיכך, נתוני HDX-MS תת-מולקולריים מאפשרים לנו להתאים את התנהגות החליפין לאזורים ספציפיים של חלבון, מה שהופך את זה לחיוני שיהיה כיסוי רצפים הולם לניסויים כאלה. הרזולוציה המבנית של כל ניסוי HDX-MS מסתמכת על מספר הפפטידים או השברים הפרוטאוליטיים שמקורם בחלבון בעת העיכול או בפיצול רך, בהתאמה. בכל אחד משלושת סוגי הניסויים שתוארו לעיל, השינוי בחילופי האמיד בכל פפטיד/מקטע ממופה בחזרה למבנה הראשוני של החלבון כדי להצביע על התנהגותם של אזורים מקומיים של החלבון. בעוד שהרזולוציה המבנית הגבוהה ביותר מושגת באמצעות פיצול רך, התיאור של ניסויים אלה הוא מחוץ לתחום המחקר הנוכחי, המתמקד במדידת קונפורמציות מונומר aSyn. תוצאות מצוינות ניתן להשיג עם זרימת העבודה הנפוצה "מלמטה למעלה" המתוארת כאן.

כאן, ניתנים נהלים על (1) כיצד להכין ולטפל בדגימות aSyn ובמאגרי HDX-MS, (2) כיצד לבצע מיפוי פפטידים עבור ניסוי HDX-MS מלמטה למעלה, (3) כיצד לרכוש נתוני HDX-MS על aSyn מונומרי בתנאים פיזיולוגיים, במיוחד בתחום הזמן של אלפית השנייה (באמצעות מכשיר שנבנה בהתאמה אישית; תוארו גם מכשירים חלופיים לתיוג אלפיות השנייה), וכן (4) כיצד לעבד ולנתח את נתוני HDX-MS. שיטות המשתמשות ב- aSyn מונומרי ב- pH פיזיולוגי (7.40) בשני מצבי תמיסה מודגמות כאן. למרות שהם שימושיים באופן קריטי במחקר של aSyn, הליכים אלה יכולים להיות מיושמים על כל חלבון ואינם מוגבלים לחלבונים עם הפרעה פנימית.

Protocol

1. ביטוי חלבונים וטיהור של aSyn

  1. הכן aSyn בעקבות דו"ח9 שפורסם בעבר.
  2. דיאליזה למאגר אחסון בטוח (למשל, Tris, pH 7.2 ).
  3. במידת הצורך, רכזו את הדגימה (לדוגמה, צינורות מיקרו-צנטריפוג' של מסנן ספין באמצעות 3 kDa MWCO, 14,000 x g למשך כ-10-30 דקות, ראו טבלת חומרים).
    הערה: מומלץ לא להתרכז יתר על המידה. שלמות אנסמבל המונומרים לא אומתה מעבר ל-25 μM.
  4. Aliquot וחנות ב- −80 °C
    הערה: חלבון המונומר aSyn יציב עד שנה בתנאי אחסון אלה.

2. הכנת מאגר HDX

הערה: מכיוון שלטריס יש מקדם טמפרטורה גבוה, יש להתאים את מדידת ה- pH לטמפרטורה שבה תיעשה תגובת HDX, שהיא 20 מעלות צלזיוס בפרוטוקול זה.

  1. הכן חיץ שיווי משקל עבור מדינה A ומדינה B על ידי שקלול 0.002 מול של Tris לתוך 100 מ"ל של מים בדרגה LC-MS. עבור מצב B, הוסיפו 29.8 מ"ג של KCl, 14.2 מ"ג של MgCl2, 36.8 גרם CaCl2 ו-836 מ"ג של NaCl למאגר Tris. התאם את ה- pH ל- 7.40 ± 0.05.
    הערה: מאגר שיווי המשקל חייב להכיל את התנאים שבהם יש לחקור את aSyn. במקרה זה, זה 20 mM Tris ב pH 7.4 +/− מלחים.
  2. הכן את חיץ הסימון עבור מדינה A ומדינה B על ידי שקלול 0.002 מול של Tris לתוך 100 מ"ל של מים deuterated. עבור State B, יש להוסיף 29.8 מ"ג KCl, 14.2 מ"ג של MgCl2, 36.8 גרם CaCl2 ו-836 מ"ג NaCl למאגר הסימון Tris. ה-pD של מאגר הסימון מתאים ל-pH של מאגר שיווי המשקל. מכיוון ש- pH = pD - 0.41, התאם כך שמד ה- pH יקרא 6.99 ± 0.0523,24.
    הערה: מאגר הסימון צריך לכלול את אותם רכיבים כמו מאגר שיווי המשקל, למעט העובדה שהוא מוכן באמצעות מים מטוהרים.
  3. הכן חיץ מרווה על ידי שקילה של 0.010 מול של Tris ו- 0.050 מול של אוריאה ועשה עד 100 מ"ל עם מים בדרגה LC-MS. התאם את ה- pH ל- 2.50 ± 0.05 ב- 0.5 ° C .
    הערה: יש לבצע מסך מאגר מרווה לפני ניסויי HDX כדי לזהות את מאגר המרווה הטוב ביותר עבור החלבון המעניין. ריכוזים ושילובים שונים של דנטורנטים (למשל, אוריאה וגואנידיניום הידרוכלוריד) וחומרים מחזרים (למשל, tris(2-carboxyethyl)phosphine) נבדקים, יחד עם פרמטרים פיזיקליים כגון לכידת נפח וטמפרטורה, כדי לפתוח ולעכל ביעילות את החלבון המרווה. מאגר מרווה הכולל 100 mM Tris ו-0.5 M אוריאה ב-pH 2.50 הוא אופטימלי למחקר הנוכחי.
  4. הכינו את מאגר שטיפת עמודי העיכול על ידי שקילה של 0.125 מול של גואנידיניום הידרוכלוריד לבקבוק זכוכית דוראן. מוסיפים 25 מ"ל של מתנול ו-250 μL של חומצה פורמית. הוכנו עד 250 מ"ל עם מים בדרגה LC-MS.
    הערה: עבור עמודת הפפסין Enzymate BEH (ראה טבלת חומרים), השתמש במאגר שטיפת עמודים של 0.5 M guanidinium hydrochloride, 10% (v/v) מתנול ו-0.1% (v/v) חומצה פורמית.
  5. הכן את המזרק שטיפה חלשה על ידי צנרת 0.5 μL של חומצה פורמית לתוך 249.5 מ"ל של מים ברמה LC-MS.
  6. הכינו את המזרק חזק לשטוף על ידי ערבוב חלקים שווים של מים בדרגה LC-MS, מתנול, אצטוניטריל ואיזופרופנול. הוסיפו חומצה פורמית לריכוז סופי של 2% (v/v).
    הערה: כדי למנוע זיהום צולב בין המאגרים השונים לבין החלבון וכדי לאפשר ניקוי של יציאת ההזרקה, חשוב מאוד שיהיו מוכנים תמיסות שטיפת מזרקים ושנתיב הזרימה לשסתום (המכונה לעתים קרובות "תוחם הכביסה") יהיה מוכן במלואו בנוזל. החומצה הפורמית היא אופציונלית לשטיפת המזרק החלשה.

3. הליך מיפוי פפטידים

  1. הכן את המדגם לאחר השלב שלהלן.
    1. המסנן הפשיר את מלאי החלבון ASyn מהמקפיא של −80 °C עם מסנני מזרקים של 0.22 מיקרומטר. מדוד את הספיגה של חלבון הציר המסונן ב-280 ננומטר כדי לקבוע את הריכוז על ידי חוק באר-למברט. דיללו את החלבון לריכוז של 5 מיקרומטר במאגר שיווי המשקל (שלב 2.1).
      הערה: חוק באר-למברט: A = εcl, כאשר A הוא ספיגה, ε הוא מקדם ההכחדה של החלבון באורך הגל הנמדד (280 ננומטר כאן) עם יחידות M−1cm−1, c הוא ריכוז החלבון ב-M, ו-l הוא אורך הנתיב בס"מ. עבור aSyn26 מסוג פראי, ε = 5960 M−1ס"מ−1.
  2. הגדר את שיטת הכרומטוגרפיה הנוזלית.
    1. צור קובץ כניסה עם זמן טעינה/השמנה של 3 דקות בלחץ של 7000-9000 psi, ואחריו שיפוע של 5% אצטוניטריל ל-40% אצטוניטריל ב-7 דקות, ולאחר מכן שלבי שטיפה חוזרים ונשנים של 5%-95% אצטוניטריל-מים במשך 10 דקות.
    2. ודא שתרסיס המנעול (לדוגמה, לאוצין אנקפלין, ראה טבלת חומרים) זורם ב-2000 psi ומחובר לבדיקה של תרסיס נעילת המקור של ספקטרומטר המסה.
  3. הגדר את שיטות ספקטרומטריית המסות MSE .
    הערה: MSE היא שיטת רכישה בלתי תלויה בנתונים בפס רחב ללא בידוד המוני מבשר. לכן, כל היונים בטווח m/z שנבחר מקוטעים עוד יותר באמצעות דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID)27.
    1. בקובץ שיטת MS, בחר MSE Continuum והגדר זמן רכישה בין 2-10 דקות, מקור אלקטרוספריי ומצב רזולוציה חיובית. רכשו את MSE מעל 50-2000 Da, וסרקו כל 0.3 שניות.
    2. עבור פונקציה 1 (אנרגיה נמוכה), הגדר את המלכודת והעביר את אנרגיות ההתנגשות כך שיהיו 4 V. עבור פונקציה 2 (אנרגיה גבוהה), הגדר את אנרגיית ההתנגשות של העברת הרמפה כקבועה ב- 4V ואת אנרגיית התנגשות המלכודת כך שתהיה כאמור בטבלה 1 עבור כל רמת אנרגיה במיפוי.
      הערה: ניתן להשתמש גם בשיטות MSE של ניידות יונים. ניתן להשתמש בשיטות מיפוי חלופיות (לדוגמה, רכישה תלוית נתונים או DDA) לפי שיקול דעת המשתמש.
  4. הגדר את הרובוט autosampler (ראה טבלת חומרים).
    1. הוסף 50 μL של חלבון 5 μM לבקבוקון התאוששות כולל. מקם את הבקבוקון במיקום לדוגמה בתא הימני HDX. ודא שתא זה נמצא בטמפרטורה של 0 °C (5 °F).
    2. הוסף בקבוקון מגיב אחד של חיץ שיווי משקל ושני בקבוקונים מגיבים של מאגר תיוג למיקומי ריאגנטים אחד, שניים ושלושה בתא השמאלי HDX. ודא שתא זה נמצא בטמפרטורה של 20 °C (75 °F) על-ידי הגדרת בקר הטמפרטורה של Peltier (ראה טבלת חומרים). הוסף בקבוקון מגיב אחד של מאגר מרווה למיקום המגיב אחד בתא הימני HDX.
    3. הוסף שמונה בקבוקוני התאוששות כוללים במיקומי התגובה של התא השמאלי של HDX ושמונה בקבוקוני התאוששות מרביים במיקומי התגובה של התא הימני HDX.
      הערה: כדי להבטיח ניקוי מלא ושכפול מרבי של נפחים מחולקים, מומלץ לבצע שטיפת מזרק ושטיפה ראשונית על מזרקי ההדגה האוטומטית. לדוגמה, בצע רצף של (1) שטיפה חלשה, (2) שטיפה חזקה, (3) שטיפה חלשה לפני תחילת ניסויי המיפוי. ניתן לחזור על רצף זה בהרחבה, ומומלץ לעשות זאת עד פי 20 או עד שהמזרק נרטב במלואו.
    4. הגדר רשימה לדוגמה עם שיטות LC ו- MS מתאימות בתוכנת התזמון והתחל את לוח הזמנים.
      הערה: עבור המחקר הנוכחי, Chronos משמשת כתוכנת התזמון (ראה טבלת חומרים).
  5. לעבד את נתוני המיפוי.
    1. זהה פפטידים מקבצי ניסוי המיפוי באמצעות תוכנה מתאימה (ראו טבלת חומרים).
    2. ייבוא נתוני זיהוי פפטידים ל- DynamX (ראה טבלת חומרים) באמצעות הפרמטרים הבאים של סף הפפטיד: עוצמה מינימלית = 5000, אורך רצף מינימלי = 0, אורך רצף מרבי = 40, מוצרים מינימליים = 1, מוצרים מינימליים לכל חומצת אמינו = 0.25, מוצרים עוקבים מינימליים = 2, עוצמת סכום מינימלית למוצרים = 0, ציון מינימלי = 0, ומקסימום MH + שגיאה (ppm) = 0.
      הערה: לחלופין, גזור את ההגדרות הממוטבות בהתאם לזרימת עבודה מומלצת28.
    3. בחר נתונים מהתפריט ולחץ על ייבוא תוצאות PLGS. לחץ על הוסף כדי לבחור את קבצי הנתונים הרלוונטיים עבור ההקצאה הספקטרלית. לאחר שכולם נוספו, לחץ על הבא והזן את הגדרות המסנן לעיל. לאחר מכן, לחץ על סיום.
    4. אצור באופן ידני משימות איזוטופיות כדי לקבל את מפת הכיסוי הפפטידית הסופית של aSyn ב- DynamX.

4. מחקר חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה

  1. נקו את אב הטיפוס של מכשיר הטיפוס FastHDX (ראו טבלת חומרים) לפני שתתחילו בניסויי HDX.
    1. פתח את ממשק המשתמש הגרפי התואם של תוכנת HDX ואפשר למערכת לאתחל.
    2. הזן את טמפרטורת תא הדגימה כ - 20 ° C ואת תא המרווה כ - 0.5 ° C . לחץ על הגדר כדי להחיל את הטמפרטורות החדשות.
    3. הגדר את צינורות הצנטריפוגה עם מים ברמת LC-MS בכל הכניסות.
    4. בכרטיסייה Titrator Plumbing Delivery , בדקו את המזרקים השמאלי והימניים ולחצו על Prime כדי להסיר בועות אוויר סמויות בצינורות. חזרו על הפעולה עד שכל הבועות נעלמו.
    5. בכרטיסיה פקודות מאקרו , סמן את כל התיבות עבור המזרקים. לחץ על כיול מזרקים מיקום הבית. לחץ על שטיפת מזרק לולאת טעינה. לחץ על שטף את כל אמצעי האחסון של לולאת הערבוב.
    6. חזור על שלב 4.1.5. פי 1 יותר.
    7. אם מופיעות בועות כלשהן במזרקי החיץ, דגה על ידי ניתוק המזרק ופליטת הבועה אנכית. החלף את המזרק וכייל מחדש למצב אפס.
  2. הגדר את אב הטיפוס של מכשיר אב הטיפוס FastHDX לניסויים ב-HDX.
    1. הוסיפו 500 uL של 5 μM aSyn מסוננים בבקבוקון התאוששות כולל והניחו בתוך מקרר שולחני כדי למנוע אוליגומריזציה וצבירה הנגרמות על ידי טמפרטורה.
    2. הוסיפו 50 מ"ל של מאגרי שיווי משקל, תיוג ומרווה לכל מאגר (2). שלבי הכנת מאגר HDX 1-3) כניסה בתאים השמאלי והימני.
    3. הוסף 50 מ"ל של מאגר שטיפת עמודים (2). שלב הכנת חיץ HDX שלב 4) לכניסת הכביסה של פפסין.
    4. כדי להכין את קווי שטיפת החלבון והעמודה 1x, בדקו את המזרקים השמאליים והימניים בכרטיסייה Titrator Plumbing Delivery ולחצו על Prime פעם אחת.
      הערה: כל לחיצה נוספת על Prime תגרום לחזרות נוספות של התהליך הראשוני, וכתוצאה מכך לצריכה של כמויות גדולות של דגימת חלבון. מומלץ להימנע מכך, גם כאשר יש עיכוב בתוכנה לאחר ניסיון ללחוץ על כפתור.
    5. חזור על שלבים 4.1.5. פי 1.
    6. בכרטיסיה זרימת מרווה ידנית , הזן את ההגדרות הנדרשות, המוסברות בשלבים 4.2.7.-4.2.10.
    7. לניסוי במסלול זמן, הזן את הזמנים באלפיות השנייה באמצעות לחצן נקודות סימבוליות . אם נדרשים משכפלים, הוסף את אותה נקודת זמן מספר פעמים, למשל, עבור משולש של 50 אלפיות השנייה, יש להזין 50 50 50 50. רשימת הדגימות בתוכנת ספקטרומטר המסה (MassLynx משמש כאן, ראה טבלת חומרים) צריכה להתאים בדיוק לנקודות זמן אלה.
      הערה: יש להשתמש בשמות הקבצים ו/או בטקסט לדוגמה של ספקטרומטר המסה כדי להבטיח תיעוד קבוע של זמני תיוג HDX המתאימים לאלה שהוזנו בממשק המשתמש הגרפי של תוכנת FastHDX. זמני תיוג עבור כל הרצה לדוגמה לא יאוחסנו בשום מקום אחר.
    8. הגדר את זמן המלכודת (mins) כאורך זמן ההשמנה. הנה, השעה 3.00.
    9. הגדר המתנה עבור HPLC (דקות) = (זמן השמנה + זמן ריצה + 1.5 דקות).
      הערה: לדוגמה, עבור ניסוי עם לכידה של 3 דקות ושיפוע של 17 דקות, זה יהיה 21.50 דקות.
    10. לחץ על התיבה הפעל ריק רק אם אתה מפעיל ניסויים ריקים בין ריצות לדוגמה. אם כן, ודא ערך (כלומר, שורה חוקית ברשימה לדוגמה) בתוכנה עבור הריצה הריקה לאחר כל הפעלה לדוגמה.
    11. לאחר שהרשימה לדוגמה מוכנה בתוכנה, הדגש את הערכים המתאימים והתחל את הריצה בתוכנה על ידי לחיצה על לחצן הפעל ו - FastHDX בתוכנה.
      הערה: בשל ערבול מימן/דאוטריום, שיטות MS בלבד או טכניקות פיצול רך (דיסוציאציה של העברת אלקטרונים, דיסוציאציה של לכידת אלקטרונים ופוטו-דיסוציאציה אולטרה-סגולה) יכולות לשמש רק29. עבור aSyn ב-pH פיזיולוגי של 7.40, נקודות זמן הנעות בין 50 אלפיות השנייה ל-300 שניות הן הישימות ביותר מכיוון שהן מכסות את כל עקומת ספיגת הדאוטריום8.

5. עיבוד נתונים

  1. טען את קובץ הפפטידים שהוקצו באופן ספקטרלי מניסויי מיפוי הפפטידים. פתח את תפריט הקובץ ולחץ על פתח בתוכנת DynamX (ראה טבלת חומרים).
  2. ייבא קבצים גולמיים לתוכנת מדידת המסה המועדפת (למשל, DynamX, HDExaminer וכו '). פתח את תפריט "נתונים" ולחץ על קבצי MS. לחץ על מצב חדש כדי ליצור מצבים עבור כל מצב חלבון שנחקר.
    1. לחץ על חשיפה חדשה כדי להוסיף כל נקודת זמן של HDX. לחץ על Raw חדש כדי לייבא את הקבצים .raw. גרור כל קובץ .raw למיקום הנכון. לחץ על אישור בסיום.
  3. תחילה הקצה איזוטופים באופן אוטומטי (זה אוטומטי לאחר שלב 5.2. לעיל), ולאחר מכן אצור ידנית את ההקצאה האיזוטופית כדי להבטיח איכות נתונים גבוהה.
  4. ייצא את נתוני האשכול לקובץ .csv עם עמודות בסדר הבא: שם חלבון, מספר התחלת רצף, מספר סיום רצף, רצף, שינוי, קטע, קליטה אפשרית מקסימלית, מסה של מינים מונואיזוטופיים, שם מדינה, זמן חשיפה, שם קובץ, מטען, זמן שמירה, עוצמה וצנטרואיד.
  5. פתח את תפריט הנתונים בתוכנת מדידת המונים ולחץ על ייצוא נתוני אשכולות.

6. ניתוח נתונים

  1. טען את נתוני האשכול המיוצאים לתוכנת ניתוח HDX המועדפת. כאן, HDfleX משמש30 (ראה טבלת חומרים).
  2. התאם את הנתונים הניסיוניים עבור כל הפפטידים והמצבים, ובחר את שיטות התיקון המתאימות להחלפה חוזרת כדי לקבל קבועי קצב נצפים עבור תגובת HDX.
  3. חשב סף מובהקות גלובלי בשיטה המועדפת (HDfleX תומך במספר אפשרויות לכך) ובצע בדיקות מובהקות היברידית כדי לקבוע את ההבדלים המשמעותיים בין המדינות לעומת31,32.
    הערה: אם ההפרש שנצפה גדול מהסף הגלובלי וערך ה-p קטן מרמת הביטחון שנבחרה (למשל, 95%), ההפרש נחשב משמעותי.

תוצאות

בשל אופיו המופרע במהותו, קשה ללכוד את השינויים המבניים המורכבים ב- aSyn ב- pH פיזיולוגי. HDX-MS מנטרת חילופי איזוטופים במימן אמיד בעמוד השדרה, וחוקרת את הדינמיקה הקונפורמציה של החלבון ואת האינטראקציות. זוהי אחת הטכניקות הבודדות לרכוש מידע זה ברזולוציות מבניות וזמניות גבוהות. פרוטוקול זה ישים בא...

Discussion

במאמר הנוכחי מתוארים ההליכים הבאים: (1) ביצוע ניסויי מיפוי פפטידים על aSyn מונומרי כדי לקבל את כיסוי הרצף הגבוה ביותר, (2) רכישת נתוני HDX-MS של אלפיות השנייה על aSyn מונומרי בתנאים פיזיולוגיים, ו-(3) ביצוע ניתוח נתונים ופרשנות של נתוני HDX-MS המתקבלים. ההליכים המסופקים הם בדרך כלל פשוטים לביצוע, כל ניסו...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

NS ממומן על ידי מלגת יובל היהלומים של מועצת האוניברסיטה. JJP נתמך על ידי מלגת מנהיגי העתיד של UKRI [מספר מענק: MR/T02223X/1].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column Waters Corporation186002346Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolvVWR20060.420For LC mobile phases
CaCl2Sigma AldrichC5670Salt for HDX buffers
ChronosAxel Semrau (Purchased from Waters Corporation)667006090Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chlorideGoss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-2-50For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-4Deuterated water
DynamX 3.0Waters Corporation176016027Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin ColumnWaters Corporation186007233Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS GradeFisher Scientific10596814For LC mobile phases
Guanidinium hydrochlorideSigma AldrichRDD001-500GChaotrope/Denaturant
HDfleXUniversity of ExeterN/Ahttps://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KClSigma AldrichP3911Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robotWaters Corporation725000637Autosampler robot
Leucine enkephalinWaters Corporation186006013For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynxWaters Corporation667004007Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vialsWaters Corporation600000670CV100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2Sigma AldrichM8266Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filtersMilliporeN9CA7069BSyringe filters
ms2minApplied Photophysics LtdN/Afast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaClSigma AldrichS9888Salt for HDX buffers
Peltier temperature controllerLEAP Technologies Inc.HP115-COOL/DPeltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0Waters Corporation715001030Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot capsWaters Corporation186004632100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2Waters Corporation186001420100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-57For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)Amicon (Merck Sigma Aldrich)UFC5003Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometerWaters Corporation176850035Mass spectrometer
Total recovery vialsWaters Corporation600000671CV100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HClSigma AldrichT3253-250GBuffer
Trizma baseSigma AldrichT60040-B2005Buffer
UreaSigma AldrichU5378-1KGChaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column Waters Corporation186004623Trap desalting column

References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved