בידוד תאי שושלת מונוציטים-מקרופאגים מעצמות חולדות בשיטת הדבקות משנית

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של BMMs מחולדות SD, הנקרא שיטת ההדבקה המשנית.

Abstract

עם ירידה בצפיפות המינרלים בעצמות, העצמות נוטות יותר להישבר, ובכך משפיעות לרעה על איכות החיים של המטופל. הצמיחה וההתפתחות של העצמות מוסדרות בעיקר על ידי אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים. מקובל לחשוב כי אוסטאוקלסטים מופקים מתאי מונוציטים-מקרופאגים של מח עצם (BMMs). BMMs ותאי גזע המטופויאטיים אחרים ממוקמים בחלל מח העצם. לכן, בידוד BMMs יציבים בודדים מאוכלוסיות תאים שונות והטרוגניות הוא אתגר עצום. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של BMMs מחולדות SD, הנקרא שיטת ההדבקה המשנית. נאספו תאים דביקים בתרבית של 24-48 שעות בתרבית ראשונית. ניתוח ציטומטרי של זרימה הראה כי כ-37.94% מהתאים היו CD11b/c+ (אנטיגן פני השטח של מונוציטים-מקרופאג'). צביעת חומצה פוספטאז (TRAP) עמידה בפני טרטרט וניתוח כתמים מערביים הראו כי BMMs יכולים להבדיל לאוסטיאוקלסטים במבחנה. הממצאים הנ"ל הציעו כי תאי ההדבקה המשניים יכולים להיחשב כמודל תאי מתאים לחקר התמיינות אוסטאוקלסט.

Introduction

דווח כי תאי שושלת מונוציטים-מקרופאגים הקיימים במח העצם יכולים להתמיין למונוציטים בדם ומקרופאגים^{של רקמות 1,2}. התאים הנ"ל, שיכולים להתמיין לאוסטיאוקלסטים כדי לאזן את צמיחת העצם והתפתחותה, משמשים בדרך כלל כמודל תאי להשראת אוסטאוקלסטים in vivo ^3,4. מח עצם הוא רקמה מיוחדת המכילה מספר סוגים שונים של תאים, הכוללים אך אינם מוגבלים רק לתאי גזע מזנכימליים של מח עצם, תאי מונוציטים-מקרופאג' של מח עצם (BMMs), תאי גזע המטופויאטיים, תאי אנדותל ותאי מערכת החיסון. למעשה, מספר מחקרים קודמים הציעו כי תאים דביקים שמיהרו לצאת מחל מח העצם של העצם הארוכה יכולים להתמיין לאוסטאובלסטים, אוסטאוקלסטים, כונדרוציטים או אדיפוציטים 5,6,7,8. למרות ששיטות בידוד ותרבית שונות שימשו ליצירת אוכלוסיות תאים הומוגניות שונות, עדיין ישנם אתגרים גדולים בבידוד ובגידול BMMs ממגוון סוגי תאים שונים.

מספר שיטות פותחו כדי לחלץ מקרופאגים חד-גרעיניים של מח עצם (BMSCs). עם זאת, רוב השיטות הללו מורכבות ^9,10,11. לדוגמה, צנטריפוגת שיפוע צפיפות דורשת ערכה מיוחדת והפעולה גוזלת זמן ומסורבלת. שיטה זו מתאימה לבידוד של BMMs מדגימות דם בנפח גבוה, אך לא מדגימות מח עצם ^9,12,13. בנוסף, חילוץ דגימות רקמה באמצעות עיכול קולגן הוא הליך מורכב וגוזל זמן; שיטה זו אינה מומלצת לבידוד של BMMs מדגימות מח עצם^14,15. בנוסף, למרות שהפרדת זרימה יכולה לגרום לאוכלוסיות מונוציטים/מקרופאגים מטוהרות מאוד, היא דורשת גודלי מדגם גדולים מאוד ודרישות גבוהות של מכשירים וציוד^10,16. בנוסף, שיטת העשרת החיידקים יקרה ביותר ואינה אפשרית במעבדה כללית¹⁷.

לכן, במחקר הנוכחי הוצעה שיטה נוחה, מהירה וזולה לבידוד מקרופאגים חד-גרעיניים ממח העצם. תאי מח עצם שנדבקו במשך נקודות זמן שונות שימשו לבידוד BMMs בשיטת הדבקה משנית. BMMs שחולצו בשיטה הנ"ל יכולים לגרום להיווצרות של אוסטאוקלסטים במבחנה, ובכך לספק מודל תאים פשוט ונוח למחקר עתידי של אוסטאופורוזיס במבחנה.

Protocol

כל הניסויים במחקר זה נערכו בהתאם להנחיות הניסויים בבעלי חיים של המרכז לחקר בעלי חיים במעבדה של האוניברסיטה הרפואית הסינית בג'ה-ג'יאנג (מספר אישור: IACUC-20181029-11).

1. מיצוי תאים

1. שים את חולדות ספראג-דאולי (חולדות SD, בנות 1-10 ימים, זכר או נקבה) בכלובי המתת חסד מלאים ב- CO₂ בקצב מאוזן של 30%-70% נפח מיכל לדקה. לאחר שהחולדות מאבדות את הכרתן (20-60 דקות), המתות את החולדה על ידי נקע צוואר הרחם כדי להבטיח מוות ללא כאבים.
2. לטבול את החולדות ב 75% אלכוהול במשך 10 דקות לחיטוי.
3. בזהירות להסיר את כל הגפיים של החולדה עם מספריים ומלקחיים, לשאוף עם PBS באמצעות פיפטה לשטוף את הדם הידבקות לגפיים.
4. מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין ל-500 מ"ל של DMEM ומערבבים היטב. קח צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל, הוסף 5 מ"ל של FBS ו-45 מ"ל של מדיום DMEM, וערבב ביסודיות כדי לקבל 10% FBS DMEM המכיל תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין של 1%. הוסף 2 מ"ל של מדיום התרבית הנ"ל לתוך צינור 5 מ"ל.
5. מעבירים את עצמות הגפיים לצינור 5 מ"ל. השתמשו במספריים כדי לחתוך את עצמות הגפיים בצינור לחתיכות קטנות (1-3 מ"מ) וערבבו את ההומוגנאט כדי להשעות מחדש את תאי מח העצם לתוך מדיום התרבית. יש לעמוד במשך 5 דקות עד ששברי הרקמה התיישבו לתחתית הצינור.
6. הוסיפו 10 מ"ל של 10% FBS DMEM לתבשיל תרבית של 100 מ"מ, ולאחר מכן העבירו את ה-supernatant למנת התרבית. כאשר שואפים לסופרנאטנט, הימנעו מהעברת פסולת הרקמה לתוך צלחת התרבית.
7. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך כ-24 שעות. לאחר זמן הדגירה הזה, רוב תאי הגזע המזנכימליים ידבקו בדופן התרבית ויגדלו לאט, בעוד שרוב תאי ה-BMM עדיין יושעו במדיום התרבית.
8. מעבירים את תרחיף התאים בצלחת תרבית 100 מ"מ לבקבוקון חדש של²⁵ ס"מ 2 וממשיכים לטפח את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות נוספות. הסר את המדיום הישן בזהירות והחלף במדיום טרי לאחר ש- BMMs נדבקו לקיר הבקבוקון.
9. תת-תרבית כאשר התאים בבקבוק הגיעו ל-80%-90% מפגש.
   הערה: כל התאים עברו תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂. במהלך התרבית, המורפולוגיה של התא אוחדה בהדרגה. התאים היו גדולים, בעלי צורה לא סדירה, גדלו באופן רדיאלי והתחברו לבקבוקון בצורה של דיסק, שם ניתן היה להבחין במספר גרעינים.

2. צביעת FACS של התא

1. טריפסין מעכלים באמצעות 1-2 מ"ל של טריפסין מסחרי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 5 דקות וסופרים תאים דביקים משניים כדי להבטיח ספירת תאים סופית של 100,000/דגימה (ספירת תאים עם המוציטומטר של נויבאואר).
2. חלק את התאים לשלוש קבוצות (500 μL של PBS מכיל 100,000 תאים): (1) קבוצת הביקורת הריקה המכילה תאים לא מוכתמים; (2) קבוצת הביקורת האיזוטיפית; ו-(3) קבוצת הניסוי (צביעת CD11b/c).
3. הדגירה של נוגדנים ראשוניים (ללא נוגדן לקבוצת הביקורת הריקה; בקרת איזוטיפ אנטי-CD11 לקבוצת הביקורת האיזוטיפית, 0.6 μL של נוגדן/דגימה, 1 מיקרוגרם/דגימה; אנטי CD11b/c לקבוצת הניסוי, 1 μL של נוגדן/דגימה, 1 מיקרוגרם/דגימה) על קרח למשך 30 דקות.
4. צנטריפוגה ב 300-350 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהחיות את התאים עם 500 μL של PBS. חזור על ההליך לעיל פעם אחת כדי להבטיח שהנוגדנים הראשוניים הלא מאוגדים נשטפים.
5. הדגירה של הנוגדן המשני המתאים (ללא נוגדן לקבוצת הביקורת הריקה; IgG נגד ארנב עזים לבקרת האיזוטיפ ולקבוצות הניסוי, 0.25 μL נוגדנים/דגימה, 1:2,000) על קרח בחושך למשך 30 דקות.
6. צנטריפוגה ב 300-350 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהחיות את התאים עם 500 μL של PBS. חזור על ההליך הנ"ל פעם אחת כדי להבטיח שהנוגדנים השניים הלא מאוגדים נשטפים.
7. זהה את התאים החיוביים CD11b/c על ידי ציטומטריית זרימה (10,000 תאים/דגימה) ונתח את הנתונים לפי תוכנה (לדוגמה, FlowJo 7.5).
   הערה: כדי לקבל את האחוז הסופי של תאי CD11b/c+, נעשה שימוש בנוסחה הבאה: אחוז תאי CD11b / c + בקבוצת הניסוי - אחוז תאי CD11 + בקבוצת הביקורת האיזוטיפית.

3. רייט-גימסה מכתים

1. זרעו את התאים המשניים הדביקים שהועברו שלוש פעמים על יריעות טיפוס של 35 מ"מ² תאים (1 × 10⁶ תאים/באר) ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות.
2. יש להשליך את מדיום התרבות ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
3. הוסף את תמיסת הצבע Wright-Giemsa (0.5 מ"ל-0.8 מ"ל) ליריעת טיפוס התאים למשך דקה אחת.
4. מערבבים את הצבע עם מים מזוקקים (0.5 מ"ל-0.8 מ"ל) עם צמר גפן, ועומדים על 10 דקות.
5. לשטוף את תמיסת הצבע עם מים מזוקקים, ולאחר מכן יבש במשך 1-3 דקות. התבונן תחת מיקרוסקופ.

4. צביעת מלכודת

1. זרעו את התאים המשניים הדביקים שהועברו שלוש פעמים על יריעות טיפוס של 35 מ"מ² תאים (1 × 10⁶ תאים/באר) ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות.
2. החלף את המדיום הישן ב- 10% FBS DMEM או מדיום אינדוקציה אוסטאוקלסט בתוספת מפעיל קולטן 50 ננוגרם / מ"ל של ליגנד פקטור גרעיני - κB (RANKL) ו- 30 ng / mL של גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF), ותרבית ב - 37 ° C ו - 5% CO₂ למשך 7 ימים נוספים.
3. הכתימו את התאים בערכת ההכתמה TRAP על פי פרוטוקול היצרן והתבוננו תחת מיקרוסקופ.
   הערה: תאים חיוביים ל-TRAP הוגדרו כאוסטאוקלסטים, שהיו סגולים תחת מיקרוסקופ אור. מספר התאים החיוביים ל-TRAP נמדד באמצעות תוכנת ImageJ.

5. כתם מערבי

1. זרעו את התאים המשניים הדבקים שהועברו שלוש פעמים על יריעות טיפוס של 35 מ"מ מ"מ² תאים (1 × 10⁶ תאים/באר) ותרבית במשך 24 שעות.
2. החלף את המדיום הישן ב-10% FBS DMEM או מדיום אינדוקציה אוסטאוקלסט (50 ננוגרם/מ"ל של RANKL ו-30 ננוגרם/מ"ל של M-CSF) ותרבית למשך 7 ימים נוספים ב-37°C ו-5% CO₂.
3. יש לחלץ את סך החלבונים התאיים עם מאגר RIPA, בנפרד ב-10% SDS-PAGE, ולהעביר לקרומי פלואוריד פוליווינילידן^18,19.
4. יש לחסום עם 5% אבקת סקימילק (25 מ"ל) למשך שעתיים ולשטוף שלוש פעמים, למשך 10 דקות בכל פעם, עם TBS-Tween 20 (TBST).
5. הדגירה של נוגדנים ראשוניים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (נוגדת β-אקטין, אנטי-טראפ ואנטי-קתפסין K; כל הנוגדנים הראשוניים היו מדוללים ב-1:1,000, 10 מ"ל נוגדנים/פסים מדוללים, ושטפו שלוש פעמים עם TBST.
6. דגירה של הנוגדן המשני (IgG נגד ארנב עזים, 1:2,000 דילול, 10 מ"ל נוגדן מדולל/ פס) בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות, ושטוף שלוש פעמים עם TBST. דמיינו את רצועות החלבון באמצעות תמיסה מתפתחת.
   הערה: רמות הביטוי של החלבונים הנ"ל היו מנורמלות β-אקטין.

תוצאות

אוכלוסיית התאים החסידיים המשניים הייתה יציבה ואחידה. עם התפשטות התאים המתמשכת, רוב התאים נעשו גדולים יותר, בעלי צורה לא סדירה וגדלו לדיסק דבק רדיאלי (איור 2C,D). ציטומטריית זרימה הראתה שאחוז התאים המבטאים CD11b/c, סמן מולקולרי על פני השטח של תאי שושלת ?...

Discussion

אוסטאוקלסטים הם אחד מסוגי התאים המשמעותיים ביותר המעורבים בהתרחשות ובהתפתחות של מחלות עצם, כמו גם אחד האובייקטים העיקריים של מחקר מחלות עצם²⁰. מונוציטים/מקרופאגים יכולים להבדיל לאוסטיאוקלסטים. מאחר שמקרופאגים מונו-גרעיניים (תאי RAW264.7) יקרים מדי לרכישה ומופעלים בקלות במהלך תר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm2 cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Anti-cathepsin K	Abcam	ab19027	1:1,000
Anti-CD11 isotype control	Abcam	ab172730	1 μg/test,1.675 mg/Ml
Anti-CD11b/c	Absin	abs124232	1μg/test, 1 mg/mL
Anti-TRAP	Abcam	ab191406	1:1,000
Anti-β-actin	Beyotime	AF5003	1:1,000
Cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Cell culture dish	corning	430167
Cell culture flask	corning	430168
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C
Goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab150077	for IF, 1:2,000
goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab6721	for WB, 1:2,000
M-CSF	Pepro tech	400-28
PBS	Biosharp	BL302A
RANKL	Pepro tech	400-30
SD rat	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd		1-10 days old
SDS-PAGE gel preparation kit	Solarbio	P1200
TRAP/ALP Staining Kit	Wako	294-67001
Trypsin-EDTA solution	Biosharp	BL512A
Wright-Giemsa solution	Keygen Biotech	KGA225-1