JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מתאר את הרכש הכירורגי ולאחר מכן דה-סלוליזציה של דשי חזיר וסקולריים על ידי זלוף של דטרגנט נתרן דודציל סולפט דרך כלי הדם של הדש בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית.

Abstract

פגמים ברקמות הרכות בנפח גדול מובילים לליקויים תפקודיים ויכולים להשפיע מאוד על איכות החיים של המטופל. למרות שחזור כירורגי יכול להתבצע באמצעות העברת דש חופשית אוטולוגית או allotransplantation מרוכב כלי דם (VCA), שיטות כאלה יש גם חסרונות. בעיות כגון תחלואה באתר התורם וזמינות רקמות מגבילות את העברת הדשים החופשית האוטולוגית, בעוד שדיכוי חיסוני הוא מגבלה משמעותית של VCA. רקמות מהונדסות בניתוחים משחזרים בשיטות דה-סלולריזציה/רצלולריזציה מייצגות פתרון אפשרי. רקמות שעברו דה-תאי נוצרות בשיטות המסירות חומר תאי מקומי תוך שמירה על המיקרו-ארכיטקטורה של המטריצה החוץ-תאית הבסיסית (ECM). פיגומים תאיים אלה יכולים לאחר מכן להיות recellularized עם תאים ספציפיים לנמען.

פרוטוקול זה מפרט את שיטות הרכש והדה-סלוליזציה המשמשות להשגת פיגומים תאיים במודל חזיר. בנוסף, הוא מספק גם תיאור של תכנון והגדרת ביוריאקטור זליפה. הדשים כוללים את האומנטום החזירי, הטנזור fascia lata והאמה הרדיאלית. דה-סלוליזציה מתבצעת באמצעות פרפוזיה ex vivo של דטרגנט נתרן דודציל סולפט (SDS) בריכוז נמוך ולאחר מכן טיפול באנזים DNase ועיקור חומצה פראצטית בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית.

דה-סלוליזציה מוצלחת של רקמות מאופיינת במראה לבן-אטום של דשים באופן מקרוסקופי. דשים תאיים מראים היעדר גרעינים על כתמים היסטולוגיים והפחתה משמעותית בתכולת הדנ"א. פרוטוקול זה יכול לשמש ביעילות ליצירת פיגומי רקמות רכות שעברו דה-תאי עם ECM משומר ומיקרו-ארכיטקטורה של כלי הדם. פיגומים כאלה יכולים לשמש במחקרי recellularization הבאים ויש להם פוטנציאל לתרגום קליני בניתוחים משחזרים.

Introduction

פציעה טראומטית והסרת גידולים עלולים להוביל לפגמים גדולים ומורכבים ברקמות הרכות. פגמים אלה עלולים לפגוע באיכות החיים של המטופל, לגרום לאובדן תפקוד ולגרום לנכות קבועה. בעוד טכניקות כגון העברת דש רקמה אוטולוגית היו נהוגות בדרך כלל, בעיות עם זמינות דש ותחלואה באתר התורם הן מגבלות עיקריות 1,2,3. אלוטרנספלנטציה מרוכבת וסקולרית (VCA) היא חלופה מבטיחה המעבירה רקמות מרוכבות, למשל, שרירים, עור, כלי דם, כיחידה אחת למושתלים. עם זאת, VCA דורש דיכוי חיסוני ארוך טווח, מה שמוביל לרעילות תרופות, זיהומים אופורטוניסטיים וממאירויות 4,5,6.

פיגומים תאיים מהונדסים רקמות הם פתרון אפשרי למגבלות אלה7. ניתן להשיג פיגומים של רקמות תאיות באמצעות שיטות דה-סלולריזציה, המסירות חומר תאי מרקמות מקומיות תוך שמירה על המיקרו-ארכיטקטורה של המטריצה החוץ-תאית הבסיסית (ECM). בניגוד לשימוש בחומרים סינתטיים בהנדסת רקמות, השימוש בפיגומים שמקורם ביולוגי מציע מצע ECM ביומימטי המאפשר תאימות ביולוגית ופוטנציאל לתרגום קליני8. לאחר הדה-סלולריזציה, ה-recellularization הבא של פיגומים עם תאים ספציפיים לנמען יכול ליצור רקמות מתפקדות של כלי דם עם מעטמאוד אימונוגניות 9,10,11. על ידי פיתוח פרוטוקול יעיל להשגת רקמות תאיות באמצעות טכניקות דה-סלוליזציה של פרפוזיה, ניתן להנדס מגוון רחב של סוגי רקמות. בתורו, בנייה על טכניקה זו מאפשרת את היישום לרקמות מורכבות יותר. עד כה, דה-סלוליזציה של פרפוזיה של רקמות רכות וסקולריות נחקרה באמצעות רקמות וסקולריות פשוטות כגון דש פאסיו-עורי בעובי מלא במכרסם 12, חזיר13, ומודלים אנושיים 14, כמו גם שריר השלד של רקטוס אבדומיניס חזירי15. בנוסף, רקמות וסקולריות מורכבות עברו גם זלוף דה-תאי כפי שהוכח במודלים שלאוזן חזיר ואוזן אנושית 16,17 ובמודלים של השתלת פנים מלאות אנושיות 18.

כאן, הפרוטוקול מתאר את הדה-סלוליזציה של דשים חופשיים של כלי דם באמצעות פיגומי ECM שמקורם ביולוגית. אנו מציגים את הדה-סלוליזציה של שלושה דשים רלוונטיים מבחינה קלינית: 1) האומנטום, 2) הטנזור fascia lata, ו-3) האמה הרדיאלית, שכולם מייצגים את דשי סוסי העבודה המשמשים באופן שגרתי בניתוחי שחזור ולא נבדקו בעבר במחקרים בבעלי חיים בהקשר של דה-סלוליזציה של רקמות. דשים מהונדסים ביולוגית אלה מציעים פלטפורמה רב-תכליתית וזמינה בעלת פוטנציאל ליישומים קליניים לשימוש בתחום של תיקון ושחזור פגמים ברקמות רכות גדולות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים המערבים נושאים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של רשת הבריאות האוניברסיטאית (IACUC) ומבוצעים בהתאם לפרוטוקול ולנהלים של מרכז משאבי בעלי החיים של רשת הבריאות האוניברסיטאית ולהנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. חמישה חזירי יורקשייר (35-50 ק"ג; גיל כ-12 שבועות) שימשו לכל הניסויים.

1. ייצור ביוריאקטור פרפוזיה

  1. ראו איור 1 עבור כל הרכיבים המשמשים בביוריאקטור הזליפה. לייצור תא הרקמה, השתמש במיכלי נעילת פוליפרופילן זמינים מסחרית עם מכסים אטומים למים ואטומים המכילים בטנה של חותם סיליקון. ודא שהמכלים תואמים לאוטוקלאב.
  2. קודחים שני 1/4 בחורים לאורך דפנות המיכל ומשחילים קטע קצר של צינורות סיליקון מצופים פלטינה L/S-16. צינור אחד יישא את הבהלה והשני הוא עבור הזרימה.
  3. עבור צינורות הזרימה, חבר מחבר Luer זכר בחלק הפנימי שישמש לחיבור לצינורית הרקמה. חבר מחבר Luer נקבה בקצה החיצוני של צינורות הזרימה שישמש לחיבור לתיבת עצירה תלת-כיוונית.
  4. קדחו חור בודד של 1/4 על מכסה התא והשחילו קטע קצר נוסף של צינורות סיליקון מצופים פלטינה L/S-16. צינור זה ישמש כפתח האוורור.
  5. הפוך את צינורות הזרימה והזרימה החוצה על ידי מדידת כ-50 ס"מ של צינורות סיליקון מצופים פלטינה L/S-16. חבר קצה אחד לצינור משאבה צהוב בעל שלוש תחנות ואת הקצה השני לפיפטה סרולוגית סטרילית של 2 מ"ל כדי לשאת את הבשמים ממאגרי חומרי הניקוי לתוך תא הביוריאקטור.
  6. אוטוקלאב את כל הרכיבים (תא וצינורות) באריזה סטרילית עטופה בנפרד.

figure-protocol-1529
איור 1: ייצור של ביוריאקטור הזליפה. ביוריאקטור הזלוף מורכב מ-(A) תא רקמת פוליפרופילן מפלסטיק (B) עם חורים צדדיים שנקדחו כדי להכיל צינורות פרפוזיה עם מכסה אטום לאוויר ולמים. (C) פקקי מחוברים לצינורות כדי לאפשר חיבור של צינורות הזלוף הנושאים חומרי דה-סלוליזציה ממאגר חומרי הניקוי לפסולת באופן חד-פעמי. (D) קלטות משאבה תואמות משמשות לחיבור הצינורות בעלי שלוש העצירות למשאבה הפריסטלטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. הכנת פתרונות דה-סלוליזציה

  1. הכינו תמיסת מלח רגילה שעברה הפרין (15 IU/mL) על ידי דילול 1.5 מ"ל של תמיסת מלאי הפרין של 1000 I.U./mL ב-100 מ"ל של תמיסת מלח רגילה.
  2. הכינו תמיסת נתרן דודציל סולפט (SDS) של 0.05% על ידי הוספה איטית של 9 גרם אבקת SDS ל-18 ליטר של מים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה אוטומטית. השתמש בקרבוי פוליפרופילן (PP) בנפח גדול כדי להתאים לתמיסת SDS. הפתרון מוכן לשימוש כאשר הוא מומס במלואו. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
  3. הכן DNase אני עובד פתרון. ראשית, שחזרו את ה-DNase I הליופילי לריכוז מלאי של 10 מ"ג/מ"ל עם 5 mM CaCl 2 ב-dH2 O. אחסנו את תמיסת ה-DNase I המשוחזרת כ-aliquots במקפיא של 20°C- עד שיהיה מוכן לשימוש. ביום השימוש, יש לדלל את מלאי DNase I 1:100 עם Mg++(1.29 mM) ו-Ca++(1.98 mM) ב-dH 2 O סטרילי לריכוז סופי של 0.1 מ"ג/מ"ל.
    הערה: פעילות DNase תיפגע אלא אם כן היא מאוחסנת קפואה. יש להשתמש רק בתמיסת DNase עובדת טרייה לעיכול אנזימטי של דנ"א בטמפרטורת החדר.
  4. הכן תמיסת PBS אחת על ידי דילול מלאי PBS 10x 1:10 עם מים סטריליים אוטומטיים בנפח סופי של 5 ליטר בקרבוי PP. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
  5. יש להכין 1% אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטיקה (A/A) ב-PBS. יש לדלל 100x אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטיקה 1:100 עם תמיסת PBS סטרילית 1x לנפח סופי של 1 ליטר.
  6. הכינו 0.1% (v/v) חומצה פראצטית (PAA)/4% (v/v) אתנול (EtOH) על ידי הוספת 3.13 מ"ל של PAA + 40 מ"ל של 100% אתנול + 956 מ"ל של dH2O סטרילי הביאו את הנפח הסופי ל-1,000 מ"ל ואחסנו בטמפרטורת החדר.

3. רכישת דשים חזיריים

הערה: זהו הליך מסוף. חזיר אחד שימש לרכישת כל שלושת הדשים. להרדים באופן הומאני את החיה בעקבות רכישת כל הדשים.

  1. טיפול טרום ניתוחי
    1. חזירים מהירים לפחות 12 שעות לפני הניתוח. הרגיעו את בעלי החיים עם קטמין (20 מ"ג/ק"ג תוך שרירי, IM), אטרופין (0.04 מ"ג/ק"ג IM) ומידזולם (0.3 מ"ג/ק"ג IM).
    2. השראת הרדמה על ידי שאיפה של 5% איזופלוראן דרך מסכה בקצב זרימה של 22-44 מ"ל/ק"ג/דקה להחדרת קו היקפי ואינטובציה. לשמור על הרדמה עם 0.5%-2% איזופלוראן ב 22-44 מ"ל / ק"ג / דקה. הקפידו על עומק מספיק של הרדמה על ידי בדיקת יציבות המודינמית ושימו לב להיעדר רפלקסים של נסיגה ממש, דוושה או טונוס שרירי הלסת כדי לציין רמה מתאימה של חומר הרדמה שניתן. מתן remifentanil תוך ורידי (10-20 מיקרוגרם / ק"ג / שעה) עירוי קצב מתמשך במהלך ניתוח משכך כאבים.
    3. אינטובציה של החזיר עם צינור אנדוטרכאלי מתאים (7-8 מ"מ) וחבר את הצינור למכונת הנשמה המוגדרת לנפח גאות של 8 מ"ל / ק"ג, PEEP של 5 ס"מ H 2 0, FiO2 של 0.5, וקצב נשימה של 14.
    4. הכנס קטטר אנגיוקט 22 גרם לתוך וריד האוזן. לאחר קבלת גישה תוך ורידית (IV), יש להחדיר מי מלח חמים 0.9% רגילים ב 5-10 מ"ל / ק"ג / שעה לאורך כל ההליך כדי לשמור על לחץ עורקי ממוצע בין 60 מ"מ כספית ל 90 מ"מ כספית.
    5. נטר באופן רציף את קצב הלב, את אוקסימטריית הדופק ואת ה-CO2 של סוף הגאות והשפל. הערך את לחץ הדם ואת טמפרטורת הגוף כל 5 דקות.
    6. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בעיניים בזמן הרדמה. הכן את כל שדה הניתוח עם פובידון-יוד. עטפו את שדה הניתוח במגבות סטריליות.
  2. דש אומנטלי
    1. מניחים את החזיר במצב שכיבה ומבצעים לפרוטומיה קסיפו-טבורית.
    2. עם הכניסה לבטן, לגייס את cephalad הבטן כדי לדמיין את omentum גדול יותר. הכניסו בזהירות את האומנטום לשדה הניתוח וזהו את כלי הדם הגסטרו-אפיפלואיים העוברים לאורך העקמומיות הגדולה יותר של הקיבה (איור 2A).
    3. התחל בהיבט השמאלי של העקמומיות הגדולה יותר שבה העורק הגסטרו-אפיפלואי השמאלי מצטרף לעורק הטחול. באמצעות מספריים ישרים של טנוטומיה של סטיבנס, השלד הן את העורק הגסטרו-אפיפלואי השמאלי והן את הווריד. לאחר מכן מחלקים את שניהם בנפרד באמצעות קשרים כירורגיים או קליפסים.
    4. המשך לאורך העקמומיות הגדולה יותר של הבטן משמאל לימין. מחלקים ומחלקים את ענפי כלי הדם הקצרים הנובעים מהאומנטום המספקים את העקמומיות הגדולה יותר של הקיבה. היזהר לא לפצוע את pedicle gastroepiploic הראשי של omentum במהלך שלב זה.
    5. המשך את הגיוס של האומנטום הגדול יותר עד למפגש של כלי הגסטרו-אפיפלואיקון הימניים ועורק הגסטרודואודנל. בעזרת קליפסים או קשרים, ליגייט מחלקים את העורק הגסטרו-אפיפלואי הימני ואת הוורידים בנפרד כדי לשחרר את הדש האומנטלי.
    6. לאחר השחרור, ניתן לחלק את האומנטום לאורך האמצע לשני חצאים, כאשר כל מחצית מלווה בעורק גסטרו-אפיפלואי ווריד בהתאמה. זה מאפשר רכישה של שני דשים חופשיים omental מפעולה אחת של בעל חיים. ניתן לאבטח בנפרד את כלי הגסטרו-אפיפלואית עם צינורית של 20-22 גרם ואז לאבטח אותם עם קשרי משי 3-0.
    7. יש לשטוף את המלח הפריני (15 I.U./mL) לתוך צינורית העורקים הגסטרו-אפיפלואית עד לתצפית על זרימה ורידית ברורה.
  3. טנזור פאסיה לאטה דש
    הערה: הפרוטוקול מבוסס על תיאור קודם של דש הטנזור החזירי fascia lata מאת Haughey et al.19. השינוי נעשה כדי לבודד רק את החלק הפאסיאלי של דש הטנזור fascia lata.
    1. מניחים את החזיר במצב דקוביטוס לרוחב ומגלחים את כל החלק האחורי העליון באופן דו-צדדי. יש להכין ולעטוף באמצעות ההליכים הסטריליים הרגילים.
    2. סמן את הגבול הקדמי של הדש בקו המשתרע מעמוד השדרה האיליאק העליון הקדמי (ASIS) לכיוון הפטלה הצידית. מיקום הפדיקל נמצא במרחק של כ-6-8 ס"מ מה-ASIS לאורך קו זה.
    3. יש לסמן קו אחורי מקביל באורך של כ-8 ס"מ עד 10 ס"מ מהחתך הקדמי לאורך ציר עצם הירך כך שיכלול את רוחב הדש. מסמנים את הקצה הדיסטלי של הדש בפטלה הצדדית.
    4. מתחילים את הדיסקציה בשוליים הדיסטליים בפטלה עם חתך חד של העור באמצעות אזמל. יש להעמיק את חתך העור עם צריבה דרך הרקמה התת עורית עד למפגש עם החיתולית שמעל רקטוס פמוריס.
    5. יש להמשיך את חתכי העור לכיוון ה-ASIS לאורך הגבולות הקדמיים והאחוריים המסומנים שתוארו לעיל. כדי לבודד את הדש הפאסיאלי לבדו, הסירו את מרכיב העור העילי משכבת הפאסיאל שמתחת. יש ללכלך או לצרוב כל כלי ניקוב קטנים לעור.
    6. חזרו לגבול הדיסטלי של הדש וחתכו את החיתולית העמוקה כדי לאפשר גיוס של שריר ה-vastus lateralis שמתחתיו. גייסו את הפאסיה לכיוון ה-ASIS.
    7. במהלך הגיוס, זהה את פדיקל כלי הדם הבוקע מבין שרירי ה-vastus lateralis וה-rectus femoris (איור 2B). היזהר כדי למנוע מתיחה מוגזמת כדי לא לפגוע בכלי pedicle.
    8. נתחו את ההיבט הפרוקסימלי מה-ASIS תוך הגנה על פדיקל כלי הדם. מנתחים עד שהדש מגויס מספיק על הפדיקל שלו.
    9. עקבו אחר הפדיקל לכיוון כלי הירך העמוקים. שלד הן את עורק הירך ההיקפי הלטרלי והן את הווריד המספק את הדש הפאסיאלי. לאחר מכן ליגייט מחלקים את שני הכלים באופן פרוקסימי, שם הם מצטרפים לכלי הירך העמוקים.
    10. ניתן לתמרן את כלי הפדיקל בנפרד עם 20 גרם עד 24 גרם אנגיוקטטרים, מאובטחים עם קשרי משי 3-0. יש לשטוף תמיסת מלח הפרית (15 I.U./mL) לתוך צינורית עורקי הדש עד לתצפית על זרימה ורידית ברורה.
  4. דש האמה הרדיאלי
    הערה: הפרוטוקול שלהלן מבוסס על תיאור שפורסם של דגם דש האמה הרדיאלי החזירי על ידי Khachatryan et al.20.
    1. מניחים את החזיר על שולחן הניתוחים במצב דקוביטוס לרוחב. מקם את הפורלימב התלוי בתוך השדה האופרטיבי.
    2. סמן ריבוע דש עור בגודל של כ-3X3 ס"מ על האמה הרדיאלית. צייר קו בין נקודת האמצע של שולי הדש הפרוקסימלי לבין הפוסה האנטקוביטלית כדי לציין את המסלול המשוער של פדיקל העורק הרדיאלי. אשר את הקורס העורקי עם מישוש.
      הערה: במודל החזירי, הכלים הרדיאליים ממוקמים עמוק יחסית מאשר בבני אדם. מיקומם הוא בין הפלקסור קרפי רדיאליס לברכיורדיאליס.
    3. חותכים את העור באמצעות אזמל בהיבט הדיסטלי עם עומק עד החיתולית האנטברכיאלית. נתח קהה עם מספריים טנוטומיה עד העורק הרדיאלי הדיסטלי ושני הוורידים שלו נפגשים. קשר את העורק ואת הוורידים עם קשרים כירורגיים בנפרד ולחלק.
    4. ממשיכים את חתכי העור בשוליים הרדיאליים והאולנאריים של ריבוע העור המסומן. גייסו את הדש מהעצם הרדיאלית שמתחתיה באמצעות להב כירורגי העובר מכיוון רדיאלי לאולנאר תוך הרמת דש העור באופן פרוקסימלי לכיוון הפוסה האנטקוביטלית.
      הערה: יש לשמור על מישור דיסקציה תת-קרקעי על מנת להבטיח שהעורק הרדיאלי יישאר קשור לשכבה העורית שמעל.
    5. בשוליים הפרוקסימליים, החזירו את הרווח שבין הברכיורדיאליס לבין ה-flexor carpi radialis בעזרת משענת ששומרת על עצמה כדי לחשוף את העורק הרדיאלי הפרוקסימלי ואת ה-venae comitantes שלו (איור 2C).
    6. באמצעות מספריים טנוטומיות, שלד את העורק הרדיאלי ואת venae comitantes באופן פרוקסימלי בפוסה האנטקוביטלית, שם הם מצטרפים לעורק הברכיאלי והוורידים, בהתאמה. לנתח את כלי הדם מן הרקמות fibrofatty שמסביב כדי להשיג אורך פדיקל מספיק של כ 5-6 ס"מ. מחלקים את העורק ואת הווריד בנפרד כדי לשחרר את דש האמה הרדיאלי.
    7. תותח את כלי הפדיקל עם 20 גרם עד 24 גרם אנגיוקטטרים, מאובטח עם 3-0 עניבות משי. יש לשטוף את המלח הפריני (15 IU/mL) לתוך צינורית עורקי הדש עד לתצפית על זרימה ורידית ברורה.
    8. לאחר רכישת הדשים, יש לשמור את הדשים במי מלח קרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לפירוק. תחת הרדמה עמוקה של איזופלורן, מרדימים את בעלי החיים בזריקה תוך ורידית של אשלגן כלורי (100 מ"ג/ק"ג IV). לאשר את המוות על ידי היעדר סימנים חיוניים.

figure-protocol-10990
איור 2: רכישה של שלושה דשים וסקולריים חזיריים . (A) אומנטום. העורקים הימניים (i) והשמאליים (ii) הגסטרואפיפלואיים משומרים בדש השחף (iii). (B) טנזור פאשיה לאטה. הפדיקל של הדש (iv) הוא הענף העולה של עורק הירך הלטרלי (v). (C) דש האמה הרדיאלי. הרכש של דש האמה הרדיאלי (vi) מבוסס על העורק הרדיאלי ועל הווריד (vii) כפדיקל כלי הדם (הערה: וילונות הושמטו למטרות הדגמה). פסי גודל: 3 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. הגדרת מערכת הדה-סלוליזציה

  1. להרכיב את תא הרקמה עם דשים בתנאים סטריליים בארון biosafety זרימה למינרית.
  2. חברו פקק תלת-כיווני ליציאות הזרימה והזרימה החוצה של הביוריאקטור. חברו מסנן של 0.2 מיקרומטר ליציאת פתח האוורור במכסה תא הרקמה. הגדילו את צינורות הזרימה עם מי מלח סטריליים שעברו הפרין כדי לסלק את בועות האוויר.
  3. מניחים את הדשים בתא. באמצעות המוסטאטים סטריליים, חבר את הדשים לצינורות הזרימה באמצעות מחבר Luer הגברי. הברג את צינורית העורקים המתאימה של כל דש על הזכר Luer והבטח אטימה הדוקה.
  4. שטפו את המלח דרך הפקק כדי לבדוק שחיבור הלואר הוא ללא דליפות ושניתן למזג את הדשים עם עדות לזרימה ורידית. סגור את מכסה תא הרקמה.
  5. חבר את צינורות הזרימה עם צינור משאבה צהוב בעל שלוש תחנות לפקק הזרימה של תא הרקמות. כמו כן, חבר מתמר חיישן לחץ מוטבע לסטופקוק התלת-כיווני של הזרימה כדי לאפשר ניטור לחץ זלוף.
  6. הפעל את משאבת הזרימה פריסטלטית. במסך הראשוני, המשך לכרטיסייה השלישית באמצעות מקש החץ כדי להגדיר את מזהה הצינורות ל- 1.85 מ"מ. לאחר מכן, המשך לכרטיסייה השנייה כדי להגדיר את קצב הזליפה. קצב קלט כמצב המסירה ומוגדר ל-2 מ"ל/דקה. ודא שכיוון הזרימה נכון כפי שמוצג על המסך. טען את צינורות המשאבה בעלי שלוש התחנות למשאבה הפריסטלטית עם קלטת תואמת.
  7. חזור על ההליך עבור משאבה פריסטלטית זרימה דומה לעיל. הגדר את הגדרת משאבת היציאה לקצב של 4 מ"ל/דקה. חבר את צינורות הזרימה החוצה עם צינור משאבה צהוב בעל שלוש תחנות לפקק היציאה של תא הרקמה. טען את צינורות המשאבה בעלי שלוש התחנות למשאבה הפריסטלטית עם קלטת תואמת. התחל את הזרימה עבור שתי המשאבות על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה .
    הערה: הקצב הגבוה יותר של משאבת היציאה הוא אמצעי בטיחות חיוני למניעת הצפת תא הרקמה, ומבטיח שזרימת החדר תמיד תעלה על הזרימה במהלך הדה-סלולריזציה. כל מערך הדה-סלוליזציה המורכב מתואר באיור 3.

figure-protocol-13569
איור 3: מערכת דה-סלוליזציה של פרפוזיה . (A) סכמת מערכת הדה-סלוליזציה של הזלף. צינורות הזרימה נושאים את הבשמים ממאגר חומרי הניקוי אל תוך תא הרקמה באופן חד-פעמי עם ניטור חיישן לחץ. צינורות הזרימה מסירים את ההפרשה באופן פעיל מתא הרקמה לתוך מיכל הפסולת. חצים שחורים מציינים את כיוון זרימת הזליפה. משאבה פריסטלטית משמשת עם המשאבה השמאלית כדי לשלוט בזרימה. הזרימה מוסרת באופן פעיל באמצעות משאבה פריסטלטית שנייה דרך הצינורות המתאימים. איור שנוצר עם BioRender.com. (B) תצלום של מערכת הדה-סלולריזציה של הזלוף המורכבת על הספסל כאשר המשאבה הפריסטלטית הנכנסת (i) מחוברת לתאי הרקמה (ii) ולאחר מכן המשאבה הפריסטלטית היוצאת (iii). לחץ הזרימה מנוטר באמצעות חיישן לחץ בשורה (iv) לפני הכניסה לתא הרקמה. כאן, שלושה דשים הם decellularized במקביל. גם חומרי הניקוי וגם מאגרי הפסולת נמצאים מתחת לספסל ולא מצולמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. דה-סלוליזציה של דשי חזיר

  1. בצע את כל השלבים הבאים לדה-סלוליזציה של פרפוזיה בטמפרטורת החדר. לסיכום שיעורי הזלוף ומשכי הזמן, ראו טבלה 1. התחל את הזליפה של מלוחים heparinized ב 2 מ"ל / min באמצעות משאבה פריסטלטית ו perfuse את הדשים עם מלוחים heparinized בתא הרקמה במשך 15 דקות כדי להסיר את כל קרישי הדם שנשמרו.
  2. עם השלמת פרפוזיה מלוחים heparinized, לשאוף מלח שיורי בתא הרקמה. מלא את תא הרקמה בכ-500 מ"ל של תמיסת דה-סלוליזציה של SDS כדי להטביע את הדש במידה מספקת.
  3. מעבירים את צינורות הזרימה לתמיסת הדה-סלוליזציה של SDS ומחלחלים לרקמה במהירות של 2 מ"ל/דקה. משך הזלוף משתנה בהתאם לדש; SDS perfuse במשך יומיים עבור omentum, 3 ימים עבור טנזור fascia, ו 5 ימים עבור דש החיתו-עורי של האמה רדיאלית.
  4. עם השלמת decellularization SDS, לשאוף את ה- SDS הקיים perfusate הכלול בתוך תא הרקמה. מעבירים את צינורות הזרימה לתמיסת PBS אחת ומעבירים את הדשים למשך יום אחד במהירות של 2 מ"ל/דקה.
  5. הסר את תמיסת PBS הקודמת והעבר את צינורות הזרימה לתמיסת העבודה של DNase. במשך 2 שעות ב 2 מ"ל / דקה. הסר את תמיסת ה- DNase מתא הרקמה והנח את צינורות הזרימה בתמיסת PBS אחת. טבלו את הרקמות בתמיסת PBS אחת בתא והכניסו תמיסת PBS אחת למשך יום אחד במהירות של 2 מ"ל/דקה.
  6. יש לחטא את הדשים בעזרת תמיסת PAA/EtOH. מעבירים את צינורות הזרימה לתמיסת PAA/EtOH בתמיסת dH2O ומטביעים את הרקמות באותה תמיסה. Perfuse PAA / EtOH ב 2 מ"ל / דקה במשך 3 שעות. לאחר השלמת העיקור PAA/EtOH, נתקו את הצינורות מהפקקים התלת-כיווניים.
  7. הסירו את הדשים בטכניקה אספטית והכניסו את המכשירים הסטריליים ל-PBS המכיל 1% אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטיקה (A/A). יש לטבול את הדשים עם PBS + 1% A/A למשך 15 דקות בשתי שטיפות נפרדות כדי לנטרל לחלוטין את שאריות החומצה. יש לשמור את הדשים ב-PBS + 1% A/A בטמפרטורה של 4°C עד שהם מוכנים ל-recellularization.
  8. בדוק את הסטריליות של הפיגומים על ידי ביצוע תרבית ספוגית על צלחות אגר ובדוק אם יש צמיחה מיקרוביאלית. לחסן צלחות אגר עם ספוגיות שנלקחו מכל משטח דש. תרכזו את צלחות האגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. סטריליות מודגמת על ידי היעדר צמיחה של מושבה מיקרוביאלית.

טבלה 1: סיכום הפרמטרים של פרוטוקול פרפוזיה-דה-סלולריזציה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

6. הערכת דה-סלוליזציה

  1. באמצעות ביופסיית אגרוף, רכשו דגימות בעובי של 3 מ"מ עד 10 מ"מ מהדשים.
  2. עבור היסטולוגיה, לתקן ביופסיות בקלטות היסטולוגיות בפורמלין מאגור רגיל במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
  3. שטפו את קלטות הביופסיה במים או ב-PBS למשך 15 דקות ואז הניחו אותן ב-70% אתנול עד שהן מוכנות לעיבוד רקמות. מעבדים את הקסטות במעבד רקמות על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
  4. הטמע את הביופסיות בפרפין, מה שמאפשר לשעווה להתמצק במשך 10-15 דקות על צלחת קרה. חתך פרפין בלוקים על מיקרוטום עד 5 מיקרומטר עובי. הכתימו את השקופיות בהמטוקסילין ובאוסין (H&E) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. דמיינו את שקופיות הרקמה במיקרוסקופיית אור.
  5. לכימות תכולת הדנ"א, קבל את המשקל היבש של ביופסיות הרקמה לאחר ייבוש רקמות לילה בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. יש לעכל את הדגימות במאגר מיצוי פפאין בטמפרטורה של 65°C למשך הלילה. צנטריפוגה את הדגימות המעוכלות ב 10,000 x גרם ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge טרי. בדוק את תוכן הדנ"א באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית בהתאם להוראות היצרן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול זה לדה-צלולריזציה של דשי חזיר וסקולריים מסתמך על זלוף של חומר ניקוי על בסיס יוני, SDS, דרך כלי הדם של הדש בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית. לפני הדה-סלולריזציה, נרכשו שלושה דשים וסקולריים בדגם חזירי ושימרו אותם בהתאם לכלי האספקה העיקריים שלהם. הדשים נשטפו מיד לאחר הרכישה על מנת לשמור...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המוצע משתמש בזילוף של SDS בריכוז נמוך כדי לבצע דה-סלולריזציה של מגוון דשים שמקורם בחזירים. עם הליך זה, omentum acellular, tensor fascia lata, ואת דשי האמה רדיאלי ניתן decellularized בהצלחה באמצעות פרוטוקול המעדיף SDS ריכוז נמוך. ניסויי אופטימיזציה ראשוניים קבעו כי SDS בריכוז נמוך (0.05%) בין יומיים לחמישה ימים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

ללא

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm pore Acrodisk FilterVWRCA28143-310
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)BaxterJF7123
20 L Polypropylene CarboyCole-ParmerRK-62507-20
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical TieCovidien LS639
3-way StopcockCole-ParmerUZ-30600-04
Adson ForcepsFine Science Tools11027-12
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100XWisent450-115-EL
Atropine Sulphate 15 mg/30mlRafter 8 Products238481
BD Angiocath 20-GaugeVWRBD381134
BD Angiocath 22-GaugeVWRBD381123
BD Angiocath 24-GaugeVWRBD381112
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901DNAse Co-factor
DNase I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)InvitrogenP7589
DPBS, 10XWisent311-415-CL without Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools13008-12
Heparin, 1000 I.U./mLLeo Pharma A/S453811
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 mlBimeda-MTC Animal Health Inc.612316
Ismatec Pump Tygon 3-Stop TubingCole-ParmerRK-96450-40Internal Diameter:  1.85 mm
Ismatec REGLO 4-Channel PumpCole-Parmer78001-78
Ismatec Tubing CassettesCole-ParmerRK-78016-98
Isoflurane 99.9%, 250 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.2231929
LB Agar LennoxBioshop CanadaLBL406.500Sterility testing agar plates
Magnesium SulfateSigma-AldrichM7506DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 TubingCole-ParmerRK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.2242905
Monopolar Cautery PencilValleylabE2100
Normal Buffered Formalin, 10%Sigma-AldrichHT501128
N°11 scalpel bladeSwann Morton303
Papain from papaya latexSigma-AldrichP3125
Peracetic AcidSigma-Aldrich269336
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube IDMcMaster-Carr5117K61
Plastic Barbed Tube 90° Elbow ConnectorsMcMaster-Carr5117K76
Plastic Quick-Turn Tube PlugsMcMaster-Carr51525K143Male Luer
Plastic Quick-Turn Tube SocketsMcMaster-Carr51525K293Female Luer
Punch Biopsy ToolIntegra Miltex3332
Potassium Chloride 40 mEq/20 mlHospira Healthcare Corporation37869
Povidone-Iodine, 10%Rougier833133
Serological Pipet, 2mLFisher Science13-678-27D
Snap Lid Airtight ContainersSnapLock142-3941-4
Sodium Dodecyl Sulfate PowderSigma-AldrichL4509
Surgical Metal Ligation Clips, SmallTeleflex001200
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straightB. BraunBC004R
TruWave Pressure Monitoring SetEdwards LifesciencesPX260

References

  1. Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
  2. Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
  3. Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651(2018).
  4. Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
  5. Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
  6. Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
  7. Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823(2016).
  8. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  9. Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
  10. Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
  11. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  12. Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
  13. Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
  14. Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
  15. Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
  16. Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
  17. Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
  18. Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
  19. Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
  20. Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
  21. Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
  22. Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
  23. Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
  24. Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447(2020).
  25. Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
  26. Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
  27. Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677(2022).
  28. Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
  29. Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557(2022).
  30. Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394(2011).
  31. Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271(2015).
  32. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  33. Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
  34. Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved