גישה מיקרופלואידית לחקר התגבשות קרח וקלתראט הידרט

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר התגבשות של גבישי קרח מיקרוסקופיים והידרטים של קלתראט בהתקנים מיקרופלואידיים, מה שמאפשר חילופי נוזלים סביב הגבישים שנוצרו. זה מספק אפשרויות שאין שני להן לבחון את תהליך ההתגבשות ומנגנוני הקשירה של המעכבים.

Abstract

תיאור מכניסטי מדויק של התגבשות מים הוא מאתגר ודורש כמה אלמנטים מרכזיים: בקרת טמפרטורה מעולה המאפשרת היווצרות של גבישים מיקרוסקופיים בודדים ומערכת מיקרוסקופיה מתאימה המוצמדת לשלב הקר. השיטה המתוארת כאן מוסיפה תכונה חשובה נוספת הכוללת החלפת תמיסות סביב קרח וגבישי הידרט קלתראט. המערכת המתוארת כוללת שילוב של מכשירים ייחודיים שפותחו בבית, כולל מיקרופלואידיקה, שלבים קרים ברזולוציה גבוהה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השלב הקר תוכנן עבור התקנים מיקרופלואידיים ומאפשר היווצרות גבישי קרח/הידרט בגודל מיקרון בתוך תעלות מיקרופלואידיות והחלפת תמיסות סביבם. רזולוציית הטמפרטורה והיציבות של השלב הקר היא מיליקלווין אחד, שהוא חיוני לשליטה על הצמיחה של גבישים קטנים אלה. מערכת מגוונת זו משמשת לחקר התהליכים השונים של התגבשות קרח והידרטים והמנגנון שבאמצעותו מעוכבת צמיחתם של גבישים אלה. הפרוטוקול מתאר כיצד להכין התקנים מיקרופלואידיים, כיצד לגדל ולשלוט בגבישים מיקרוסקופיים בתעלות המיקרופלואידיות, וכיצד ניצול זרימת הנוזלים סביב גבישי קרח/הידרט מעניק תובנות חדשות על התגבשות המים.

Introduction

חלבונים נוגדי הקפאה (AFPs) וגליקופרוטאינים נוגדי הקפאה (AFGPs) מגנים על אורגניזמים שונים המותאמים לקור מפני נזקי כפור¹. AFPs ו-AFGPs (בהכללה כ-AF(G)Ps) מעכבים את צמיחתם של גבישי קרח על ידי קשירה בלתי הפיכה לפני השטח שלהם ועיכוב צמיחה נוספת עקב אפקט גיבס-תומסון 2,3,4,5. הפער שנוצר בין טמפרטורת ההיתוך, שכמעט ולא השתנתה, לבין טמפרטורת ההקפאה שזה עתה מדוכאת נקרא היסטרזיס תרמי (TH) ומייצג פרמטר מדיד המתאים לפעילות AFP⁶. לשימוש ב-AFPs לעיכוב צמיחת קרח יש יישומים מרחיקי לכת ומגוונים, המציעים פוטנציאל השבחה בתחומים שונים, כולל שימור בהקפאה, איכות מזון קפוא והגנה על גידולים שנחשפו לקור.

התגבשות המים בטמפרטורות נמוכות ובלחצים גבוהים בנוכחות מולקולות אורגניות קטנות גורמת להיווצרות הידרטים של קלתראט (או הידרטים של גז), כאשר ההידרט הנפוץ ביותר הוא מתאן הידרט⁷. התגבשות של הידרטים של מתאן בקווי זרימה של גז/נפט עלולה לגרום לתקעים, שעלולים לגרום לפיצוצים עקב הצתת גז ^8,9,10. המאמצים הנוכחיים למניעת התגבשות הידרטים בקווי זרימה כוללים שימוש במעכבים תרמודינמיים (אלכוהולים וגליקולים) וקינטיים (בעיקר פולימרים)^11,12,13,14. כמו כן, נמצא כי AFPs נקשרים לגבישי הידרט קלתראט ומעכבים את צמיחתם, מה שמצביע על שימוש פוטנציאלי ב-AFPs כדי לעכב את היווצרותם של תקעים, ובכך לספק פתרון ירוק יותר¹⁵.

מיקרופלואידיקה היא שיטה נפוצה המשמשת לחקר תכונותיהם של נוזלים בנפחי דגימה זעירים (עד fL) הזורמים דרך רשת של מיקרו-ערוצים¹⁶. המיקרו-ערוצים עוקבים אחר תבנית שנוצרה על פרוסת סיליקון (התבנית) באמצעות ליתוגרפיה¹⁷. חומר נפוץ לייצור התקנים מיקרופלואידיים הוא פולידימתילסילוקסן (PDMS), שהוא זול ופשוט יחסית לעבוד איתו במעבדות מחקר. עיצוב התכונות (ערוצים) מורכב ביחס למטרה הספציפית של המכשיר; לפיכך, ניתן להשתמש בו למגוון יישומים, כולל חישת DNA¹⁸, אבחון רפואי¹⁹ ותהליכי התגבשות 3,20,21.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מיקרופלואידית ייחודית לגידול גבישי קרח והידרט בגודל מיקרון עם מעכבים שונים, כולל AFPs ו-AFGPs. עבור ניסויים אלה, הידרטים של Tetrahydrofuran (THF) שימשו כדי לחקות את התכונות של הידרטים של גז מתאן²², הדורשים ציוד מיוחד לבקרת לחץ וטמפרטורה²³. AF(G)Ps עם התווית הפלואורסצנטית שימשו להדמיה ולניתוח של ספיחת החלבונים אל פני השטח של הגביש, ובשילוב עם הדמיה פלואורסצנטית, הגישה המיקרופלואידית אפשרה קבלת תכונות מפתח של תהליך הקשירה של מולקולות אלה למשטחי גבישים.

Protocol

1. ייצור מכשירים מיקרופלואידיים

1. מכסים את המשטח הפנימי של צלחת פטרי ברדיד אלומיניום ומניחים את התבנית שהוכנה מראש לתוך צלחת פטרי.
   1. לייצר את התבניות באמצעות טכניקות ליתוגרפיה המתוארות בהפניות. שני עיצובי המכשירים המשמשים בעבודה הנוכחית מתוארים באיור 1.
2. מכינים 30-40 מ"ל של תערובת PDMS על ידי שקילת תערובת 1:10 (לפי משקל) של חומר הריפוי והאלסטומר (ראו טבלת חומרים) וערבוב רציף במשך כ-5 דקות עד שהתערובת נראית לבנה וכמעט אטומה.
   הערה: מניחים פלסטיק על סולם השקילה, מוזגים את האלסטומר לתוך הכוס, ולאחר מכן מוסיפים את חומר הריפוי כדי להשיג יחס משקל של 1:10.
3. יוצקים את תערובת ה-PDMS לצלחת הפטרי עם התבנית והדגה במייבש עד שלא נשארות בועות (כ-30 דקות).
4. אופים את התבנית עם ה-PDMS הנוזלי בתנור או על פלטה חמה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס עד לקבלת מרקם דמוי גומי. תהליך זה אורך כשעה.
5. חותכים את המכשיר החוצה על ידי התחקות אחר התכונות עם אזמל, תוך הקפדה לדחוף קדימה עם האזמל במקום למטה מכיוון שהתבנית שברירית. הסר את התקן ה-PDMS החתוך, והנח אותו הפוך בצלחת פטרי חדשה. הסר חלקיקי אבק ולכלוך מהמשטח התחתון על-ידי הצמדה והסרה של פיסת סרט דבק (ראו טבלת חומרים).
6. השתמש במחט מזרק קהה (20 גרם) כדי לנקב חורים במכשיר בהתבסס על התבנית המוטבעת, באמצעות מיקרוסקופ במידת הצורך. ודא שהחור חודר דרך הצד השני של המכשיר, והשתמש בפינצטה כדי להסיר את החלקים המנוקבים.
7. יש לשטוף היטב את הכיסוי (18X18 מ"מ, עובי 0.14 מ"מ) במים וסבון, ולאחר מכן עם איזופרופנול. השתמשו בלחץ אוויר כדי לייבש את המכסה הנקי.
8. הכנס את ה-PDMS והכיסוי המנוקים לשואב הפלזמה, סגור את השסתומים והפעל את החשמל, השואב והמשאבה. אפשרו למנקה הפלזמה לפעול במשך כדקה, הגדירו את ה-RF ל-HI ואפשרו לחלק מהאוויר להיכנס למנקה הפלזמה באמצעות השסתום העדין.
   1. כאשר צבע חלון הצפייה משתנה מסגול לוורוד, תן למנקה הפלזמה לעבוד במשך 50 שניות וכבה את ה- RF. שמור את המשאבה דולקת למשך דקה, ולאחר כיבויה, פתח בהדרגה את השסתום הראשי כדי לאפשר לאוויר להיכנס למנקה הפלזמה.
      הערה: שיטה חלופית להשגת תוצאות דומות היא הדבקה בחום. בשיטה זו, הניחו את התבנית על הכיסוי והניחו אותה על פלטה חמה שנקבעה ל-70-80 מעלות צלזיוס למשך כ-60 דקות.
9. לחץ על משטח ה- PDMS על מכסה הניקוי וודא שהם מחוברים על ידי התבוננות ללא ניתוק בעת משיכה קלה כלפי מעלה על הכיסוי.
10. הצמידו את המחט של מחט קהה בזווית של 90° (18 גרם) בעזרת זוג צבתות ומשכו את מחבר מזרק הפלסטיק כדי להסיר אותו. הכנס קצה אחד של המחט לצינור טייגון (מזהה 0.020 אינץ', OD בגודל 0.060 אינץ', ראה טבלת חומרים) ואת הקצה השני לאחד החורים המנוקבים של המכשיר. חזור על התהליך עבור החורים האחרים.
11. כדי להסיר בועות אוויר, הזריקו מים/חיץ לתעלות עם מזרק זכוכית (משאבה היא אופציונלית, אך לא נעשה כאן שימוש במשאבה). סנן את כל הנוזלים עם מסנן 0.22 מיקרומטר לפני הזרקתם למכשיר.
12. השתמש בסוכן חוסם כגון פתרון BSA של 1% כדי למנוע קשירה של AFPs עם תווית פלואורסצנטית על קירות PDMS. הזריקו את סוכן החסימה לערוץ הכניסה ואפשרו לו להישאר במיקרו-ערוצים למשך 20 דקות. לאחר מכן, הזרק את תמיסת המאגר לערוץ הכניסה כדי לשטוף את תמיסת ה- BSA.
    הערה: התקן PDMS שנוצר מחובר לכיסוי לאורך המשטח התחתון שלו, מחובר לצינורות בחורי הכניסה והיציאה שלו, ומצופה בסוכן חוסם בערוצים שלו.

2. הגדרת המכשיר המיקרופלואידי

1. מרחו כמות קטנה של שמן טבילה על פני השטח של שלב הנחושת הקר (ראו טבלת חומרים) ומרחו אותו באמצעות מגבון ללא מוך ליצירת שכבה דקה של שמן. לאחר מכן, הניחו דיסקית ספיר נקייה (ראו טבלת חומרים) על שכבת השמן שנוצרה. מרחו טיפה של שמן טבילה על מרכז דיסק הספיר והניחו את התקן ה-PDMS על הטיפה כך שתכונות המכשיר מיושרות מעל חור הצפייה של השלב הקר.
2. החזיקו את המכשיר במקומו והצמידו את הצינורות לדפנות החיצוניות של קופסת האלומיניום המאכלסת את הבמה הקרה באמצעות סרט דבק. רשום לעצמך את המיקום של כל צינור ספציפי.
3. השתמש במזרק זכוכית כדי להזריק 4-5 μL של תמיסת AF(G)P (ראה טבלת חומרים) לתעלת הכניסה. סגור את המכסה של השלב הקר.
   הערה: הריכוז של פתרונות AFP יכול להיות מגוון ולהכריע על סמך עוצמת הפלואורסצנטיות שלהם. בפרוטוקול הנוכחי, טווח הריכוזים היה 5-40 μL.

3. היווצרות גבישים בודדים בתעלות המיקרופלואידיות

1. נקו את השלב הקר עם אוויר/חנקן יבש כדי למנוע היווצרות עיבוי בתוכו. הפעל אמבט קירור במחזור כדי להזרים מים דרך השלב הקר ולשמש כגוף קירור.
2. הפעל את תוכנית בקרת הטמפרטורה והגדר את הטמפרטורה ל -25 °C (75 °F).
   הערה: הקפאה תתרחש כאשר הדגימה מגיעה לטמפרטורה של ~-20 מעלות צלזיוס, אשר ניתן לראות כהחשכה פתאומית וחספוס של הדגימה. ניתן להשתמש בכל מטרה בשלב זה, רצוי המטרה 4x, המאפשרת למשתמש לצפות במכלול הערוצים המיקרופלואידיים.
3. לאט לאט, הגדלת הטמפרטורה בכ-1 °C/5 שניות, מתקרבים לנקודת ההיתוך של הדגימה, שיכולה לנוע בין -1 ל-0.2 °C בהתאם למאגר המשמש בתמיסת AF(G)P. כאשר הטמפרטורה מתקרבת לנקודת ההיתוך, המתן עד שיבודדו כמה גבישים בודדים.
   הערה: במידת הצורך, קרח לא רצוי יכול להיות מומס באופן מקומי באמצעות לייזר IR (980 ננומטר) (ראה טבלת חומרים), אשר קבוע על המיקרוסקופ. הלייזר ממיס גבישי קרח סמוכים כל עוד הוא פועל.
4. בשלב זה, מומלץ לעבור למטרות 10x או 20x כדי לצפות טוב יותר גבישים בודדים. לאחר קבלת גביש יחיד במיקום הרצוי, מגדלים את הגביש על ידי ירידה קלה בטמפרטורה (ב~0.01 מעלות צלזיוס) עד שקצוות הגביש פוגשים את דפנות התעלה.
5. עברו ליעד 50x, הזריקו את תמיסת ה-AF(G)P לתעלות, וצפו בעוצמת הפלואורסצנטיות העולה, מה שמעיד על כך שתמיסת החלבון הוזרקה בהצלחה לתעלות. בצע שלב זה בזהירות כדי למנוע המסה של גביש הקרח במהלך חילופי פתרונות. עקוב מקרוב וכוונן הן את קצב הזרימה (על ידי הפעלת לחץ נוסף/פחות על מזרק הזכוכית) והן את הטמפרטורה במהלך תהליך החלפת התמיסה.
6. אפשרו לחלבונים מספיק זמן להצטבר ולהיקשר על פני השטח של הגביש.
   הערה: זה משתנה בהתאם לשיעורי ההצטברות והספיחה של AF(G)P ^5,25. בניסוי טיפוסי, 5-10 דקות מותרות עבור הצטברות AFP

4. מדידת פעילות בהיסטרזיס תרמי (TH)

הערה: שלב זה הוא אופציונלי.

1. קבע את נקודת ההיתוך של הגביש על ידי התאמת הטמפרטורה בצעדים קטנים של 0.002 מעלות צלזיוס והתבוננות בטמפרטורה הגבוהה ביותר שניתן נתון לגביש קטן מבלי שהוא יימס.
2. בפונקציית RAMP של בקר הטמפרטורה, הגדר את קצב הקירור ל -0.05 עד -0.01 °C / 4 s והפעל את הרמפה. שימו לב לטמפרטורה המדויקת שבה מתרחשת צמיחה גבישית פתאומית.
   הערה: ערך זה נקרא טמפרטורת הפרץ ומתאים לטמפרטורת ההקפאה. ההבדל בין טמפרטורות ההיתוך וההקפאה הוא פעילות TH²⁵.

5. חילופי פתרונות סביב גבישים בודדים

1. ודא שטמפרטורת הדגימה נמצאת במרווח TH כדי למנוע התכה או צמיחה של הגביש במהלך הניסוי.
2. תעד את תהליך החלפת הפתרונות באמצעות תוכנית ההדמיה NIS Elements (ראה טבלת חומרים) לניתוח נתונים פלואורסצנטי מאוחר יותר. הזריקו באיטיות את תמיסת החיץ לתוך הכניסה השנייה של המכשיר המיקרופלואידי, וצפו בירידה באות הפלואורסצנטי בקצב התלוי בלחץ המופעל על המזרק.
   1. השתמש בייצוג חזותי זה כדי להבטיח שהלחץ המופעל אינו גבוה מדי כדי לא לגרום לגביש להתמוסס. ראו איור 2 לקבלת רצף של תמונות המדגימות את תהליך החלפת הפתרונות.
3. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתעלה המיקרופלואידית באמצעות תוכנית ההדמיה.
   הערה: האות צריך להגיע לשיאו באזור הסמוך לפני השטח של הגביש, מה שמעיד על קשירת AFP, וצריך להיות נמוך יחסית בתמיסה שמסביב, שנשטפה במאגר.
4. מדוד את פעילות ה- TH לאחר החלפת הפתרונות לאחר שלב 4.
5. חזור על הניסוי על ידי בידוד גביש חדש (שלבים 3.3-3.5). להזריק לתמיסת AFP מזרק זכוכית ולחזור על חילופי התמיסה (שלבים 5.1-5.3). השיגו גביש יחיד חדש (שלבים 3.3-3.5) והזרימו את תמיסת AFP לתעלות באמצעות מזרק הזכוכית.

6. ניסויים עם הידרטים clathrate

1. כדי לקבל הידרטים של THF, הכינו תמיסת THF/מים עם יחס טוחן של 1:15, שהוא יחס נפח של 1:3.3²⁶. שמור על יחס זה בכל הפתרונות המשמשים בניסויים הבאים, כולל אלה המכילים AF(G)Ps או מעכבים אחרים.
2. בצע את שלבים 1 ו -2 כדי להכין את המכשיר microfluidic ומניחים אותו בשלב הקר. הגדר את הטמפרטורה ל -25 °C (75 °F); הדגימה תקפא ב~-20 מעלות צלזיוס כמתואר בשלב 3.2.
3. לאחר שתמיסת ה-THF קפואה, העלו באיטיות את הטמפרטורה עד שכל הקרח נמס.
   הערה: נקודת ההמסה של הקרח מדוכאת מעט על ידי ה-THF.
4. כדי להבטיח שכל גבישי הקרח נמסו בהרחקת ההידרטים, החזיקו את הטמפרטורה ב-1 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
5. הגדר את הטמפרטורה ל -2 מעלות צלזיוס והתבונן בשפע ההידרטים המופיעים בתעלות המיקרופלואידיות בהיעדר מעכבים.
   הערה: הידרטים של THF מעוצבים כאוקטהדרונים (איור 2), ובמקרים מסוימים, הגבישים דקים מאוד; לפיכך, התבוננות ברורה עשויה להיות מאתגרת. במקרים אלה, מומלץ לחזור על שלבים 6.4-6.5 כדי לקבל גבישים חדשים.
6. הזרקת מעכב AF(G)P/מעכב לתעלה המיקרופלואידית באמצעות מזרק הזכוכית תוך התאמת הטמפרטורה כדי להבטיח שהגבישים המתקבלים לא יימסים/גדלים. הקדישו מספר דקות למולקולות המעכבות להיספג אל פני השטח של הגביש.
7. במידת הצורך, מדוד את פעילות ה- TH לאחר שלב 4.
8. החלף את הפתרון סביב הגבישים כמתואר בשלבים 5.2-5.3.

תוצאות

החלפת פתרונות עם גבישי קרח
חילופי פתרונות מוצלחים סביב גביש קרח מוצגים באיור 3. חותמת הזמן על כל תמונת מצב מצביעה על כך שהחלפת הפתרונות הייתה מהירה יחסית; עם זאת, החלפה איטית יותר אפשרית. עוצמת הפלואורסצנטיות המגיעה ממולקולות ה-AFGP הנספגות בקרח נצפית בבירור לאחר השלמת ההחלפה (איור 3, מימין). ניתוח כמותי של ריכוז AFP על פני הקרח מנוטר באמצעות כלי ייעודי של אזור עניין (ROI) (איור 4). בניסוי זה⁴, AFP סוג III (איזופורם QAE) מדולל ב 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) ו 100 mM NaCl שימש. התמיסה מוחלפת סביב גביש בצורת דו-פירמידל, ועוצמת הפלואורסצנטיות בתמיסה ועל הקרח מנוטרת. החלקה האדומה המציינת את אות הפלואורסצנציה בתמיסה פוחתת בפקטור של 100 במהלך חילופי התמסיסה, בעוד שהאות המחושב (החלקה הירוקה) על פני הקרח נשאר קבוע. האות המחושב של מולקולות ספיחת הקרח התקבל על ידי הפחתת האות המגיע מהתמיסה (כפול קבוע המתייחס לעובי הערוץ המיקרופלואידי) מהאות המגיע מהקרח⁴.

החלפת תמיסות עם הידרטים של THF
ניסויים מיקרופלואידיים עם הידרטים של THF בוצעו בדומה לניסויים בקרח. לאחר שגבישי ההידרט הורשו לספוח את מולקולות המעכב מהתמיסה, הוזרק תמיסה נטולת מעכבים לתעלות. איור 5 מציג הידרטים של THF לאחר חילופי תמיסות עם שני סוגים של מעכבים: AFGP_1-5 המסומן באיזותיוציאנט פלואורסציני (FITC) (איור 5A) וספרנין O (ראו טבלת חומרים), שהוא צבע פלואורסצנטי²⁶ (איור 5B). זהו ההדגמה הראשונה של קשירת AFGP לפני השטח של הידרט קלתרט.

איור 1: ייצוג סכמטי של התעלות המיקרופלואידיות ששימשו במחקר הנוכחי. שני העיצובים כוללים שני פתחים ושקע אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: הידרטים של THF נוצרו בתעלה המיקרופלואידית לאחר שהטמפרטורה התקררה ל~-2 מעלות צלזיוס. המורפולוגיה של כל הגבישים המוצגים היא טטרהדרון; עם זאת, חלק מהגבישים מכוונים אחרת. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: ניסוי מייצג המציג חילופי תמיסה סביב גביש קרח יחיד בתעלה מיקרופלואידית. בתחילה, הפתרון הכיל AFGP_1-5 המסומן ב- FITC, ו- AFGPs ספיחת קרח לא נצפו. לאחר שהתמיסה הוחלפה בתמיסה נטולת AFGP, החלבונים שנספחו קודם לכן על פני הקרח זוהו בבירור (תמונה מימין). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: ניתוח כמותי ואיכותי של ריכוז AFP על פני הקרח. (A) גביש קרח בריכוז תמיסת AFP גבוה (לפני חילופי תמיסות). (B) אותו גביש לאחר פתרון AFP הוחלף בתמיסת חיץ נטולת AFP. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (C) ניתוח כמותי של עוצמת הפלואורסצנטיות על פני הקרח (שחור) ובתמיסה (אדום) במהלך חילופי תמיסה. העקומה הירוקה מייצגת את העוצמה המחושבת על פני הקרח. האיור מותאם באישור הפניה⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: גבישי הידרט THF בודדים בתעלות מיקרופלואידיות לאחר שהתמיסה סביבם (A, AFGP_1-5) או (B,Safranine  O) הוחלפה. התמונה ב-(B) מועתקת מהפניה²⁶. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי תוכנן להשתמש בשילוב של זרימה מיקרופלואידית עם גבישים מיקרוסקופיים כדי לחשוף תובנות חדשות על צמיחת גבישים ועיכובם. שלב קר²⁷ מבוקר טמפרטורה ברזולוציה של מיליקלווין מאפשר שליטה בגבישים מיקרוסקופיים בודדים הממוקמים בתוך תעלות מיקרופלואידיות, ובכך מאפשר החלפת תמיסות סביבם. בעוד שייצור התקנים מיקרופלואידיים הוא סטנדרטי ודומה לשיטות עבודה נפוצות^17,18, השליטה על הצמיחה וההתכה של גבישים בתוך המכשיר היא ייחודית וחדשנית. המרכיב הקריטי ביותר במערכת זו הוא בקרת הטמפרטורה המעולה, המושגת באמצעות מצננים תרמואלקטריים של Peltier, משוב מתרמיסטור הממוקם קרוב לדגימה, ובקר טמפרטורה ברזולוציה גבוהה השולט בלולאת המשוב.

שלב קריטי נוסף הוא החלפת התמיסה עצמה, שכן הגבישים עשויים להתמוסס או לגדול במהלך תהליך זה; לפיכך, יש להתאים את הטמפרטורה במהלך חילופי התמיסה כדי למנוע צמיחה/התכה. היווצרות גבישים בתעלות מיקרופלואידיות מפריעה לזרימת הנוזלים ומציבה את האתגר העיקרי של מערכת זו; לפיכך, יש לשלוט בצמיחתם של גבישים אלה. כאן, לייזר IR (980 ננומטר) הורכב על המיקרוסקופ ההפוך ושימש להמסה מקומית של גבישי קרח/הידרציה לא רצויים²⁸. אם לא ניתן להשתמש בלייזר כזה, ניתן לחמם את המחברים המתכתיים של המכשיר המיקרופלואידי על ידי מצנן תרמואלקטרי נוסף של Peltier, אשר ימיס את הקרח בכניסה/יציאה של המכשיר.

השיטה המתוארת כאן כוללת מכשירים שפותחו בבית (שלב קר) ודורשת אימון, שכן חלק מהצעדים שהוזכרו לעיל מאתגרים. מכיוון שריכוז התמיסה המקיפה את הגבישים עשוי להשתנות גם כאשר הזרימה אינה מיועדת, שלב כיול^{פשוט 5} יכול לספק הערכה אמינה של הריכוז בהתבסס על אות הפלואורסצנציה. פתרון אפשרי נוסף לזרימה לא רצויה (במהלך מדידות TH, למשל) הוא שסתומים מיקרופלואידיים, המתוארים בהתייחסות⁴.

מערכת זו שימשה גם כדי לחקור את התנהגות הגדילה שלקרח D 2 O בנוזל H₂O, מחקר שחשף תופעה חדשה של משטחי קרח מיקרוסקופיים מסולסלים²⁷. לפיכך, microfluidics יכול לשמש במחקר של מערכות גבישיות שונות המגיבות היטב לשינויי טמפרטורה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-micron filters	Fisher Scientific
90-degree bent blunt needles			18 Gauge
Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins	A gift		See references 5 and 28
Blunt needles			18 Gauge and 20 Gauge
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich
Cold stage	Home made
Cover slips	Globe Scientific		18 X 18 mm, 0.14 mm thickness
Glass syringe
Infrared laser 980 nm	Opto Engine LLC
Inverted microscope, Eclipse Ti - S	Nikon
Invisible tape	Staples
lint-free wipe	Kimwipes
Newport 3040 temperature controller	Newport
NIS-Elements Imaging Software	Nikon
Oil vacuum pump	Harrick Plasma
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)	Dow Corning Syglard
Safranine O	Sigma-Aldrich	S2255-25G
Sapphire disc	Ted Pella Inc	16005-1010	25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness
sCMOS Camera, Neo 5.5	Andor
Tetrahydrofuran (THF)	Sigma-Aldrich	401757-100ML
Tygon Microbore tubing for microfluidic device	Cole-Parmer		0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll.
Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas	Cole-Parmer		1/8” ID, 3/16” OD