JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תאי T ו-ILC2 המבטאים IL-9 מושרים במהלך זיהום ב-N. brasiliensis , אך האפיון שלהם התעלם במידה רבה במעי הנגוע בשל התדירות הנמוכה והקינטיקה הדיפרנציאלית שלהם. פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאים אלה מאיברי מטרה שונים ואישור זהותם באמצעות ציטומטריית זרימה בשלבי זיהום שונים.

Abstract

IL-9 הוא ציטוקין פליוטרופי הקשור לתהליכים שונים, כולל חסינות אנטי-סרטנית, השראת פתולוגיות אלרגיות והתגובה החיסונית נגד זיהומי הלמינת'ס, שם הוא ממלא תפקיד חשוב בגירוש הטפיל. במודל מוריני של זיהום Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 מיוצר בעיקר על ידי לימפוציטים מסוג CD4+ T ותאי לימפה מולדים הנמצאים בריאה, במעי הדק ובבלוטות הלימפה המנקזות. בהתחשב בקשיים הטכניים הכרוכים בצביעה תוך-תאית של IL-9, כמו גם המורכבות של בידוד תאים המטופויטיים מהמעי הדק בעת זיהום, יש צורך דחוף בפרוטוקול מקיף אך פשוט לניתוח הביטוי של IL-9 ברקמות לימפואידיות ולא לימפואידיות שונות במודל זה. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את הקינטיקה של IL-9 המיוצרת על ידי תאי T CD4+ ותאי לימפה מולדים בריאה ובמעי הדק, האיברים העיקריים הממוקדים על ידי N. brasiliensis, כמו גם בבלוטות הלימפה mediastinal ו mesenteric, לאורך כל הזיהום. בנוסף, הוא מפרט את מספר הזחלים הדרושים לזיהום, בהתאם לסוג התא והאיבר המעניין. פרוטוקול זה נועד לסייע בסטנדרטיזציה של בדיקות כדי לחסוך זמן ומשאבים על ידי מתן הזדמנות להתמקד בתאים, איברים ושלבי מחלה ספציפיים של עניין במודל זיהום N. brasiliensis.

Introduction

תולעי קרס הן טפילי מעיים המדביקים כ-700 מיליון בני אדם ברחבי העולם, בעיקר באזורים טרופיים במדינות לא מפותחות. זיהומים בעוצמה גבוהה עם Ancylostoma duodenale ו - Necator americanus, טפילי תולעי הקרס הנפוצים ביותר בבני אדם, גורמים לאנמיה ומחסור בחלבון שעלולים לגרום לעיכוב בגדילה ובהתפתחות הנפשית1. N. americanus וטפיל המכרסם Nippostrongylus brasiliensis גורמים לתגובה חיסונית טיפוסית מסוג 2 אצל הפונדקאי שלהם וחולקים קווי דמיון במחזור החיים שלהם. לפיכך, זיהום של עכברים עם N. brasiliensis הוא המודל הנפוץ ביותר עבור זיהומים תולעי קרס אנושיים. שלב 3 (L3) זחלים זיהומיים N. brasiliensis עוברים מהעור לריאה בשעות הראשונות שלאחר ההדבקה. ברגע שהם בריאה, הם הופכים ל-L4 ונודדים במעלה קנה הנשימה כדי להיבלע, לעבור דרך הקיבה ולהגיע למעיים כדי להפוך למבוגרים (L5) תוך 4-5 ימים. במעיים, תולעי L5 מטילות ביצים המופרשות בצואה כדי להפעיל מחדש את מחזור החיים של הטפיל2.

התגובה החיסונית הנגרמת על ידי N. brasiliensis מאופיינת על ידי עלייה במספר ציטוקינים מסוג 2, כולל IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 ו- IL-13, יחד עם אאוזינופיליה, בזופיליה, היפרפלזיה של גביע ותאי פיטום, וייצור מוגבר של IgG1 ו- IgE. רוב המחקרים המנסים לזהות ולהגדיר את התגובות החיסוניות המתעוררות על זיהום N. brasiliensis מתמקדים בתפקיד של IL-4 או IL-13 במודל זה3. עם זאת, הזיהוי והאפיון של תאים המבטאים IL-9 ותפקודו של ציטוקין זה התעלמו במידה רבה, עד שליקונה-לימון ועמיתיו פרסמו את המחקר הראשון שהוכיח תפקיד קריטי עבור IL-9 בתגובה החיסונית נגד N. brasiliensis. באמצעות עכברי דיווח, מחקר זה תיאר תאי T (בעיקר T עוזר 9) ותאי לימפה מולדים מסוג 2 (ILC2s) כתת-קבוצות התאיות העיקריות המבטאות IL-9 בעת זיהום4.

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מריאות נגועות בהלמינת'ס הוא אפשרי, ודווח בהרחבה 3,4. עם זאת, בגלל שיפוץ הרקמה האינהרנטית וייצור הריר, לעשות זאת במעיים הנגועים התגלה כאתגר טכני, עד לפרסום האחרון של Ferrer-Font et al.5. הקבוצה התוותה פרוטוקול לבידוד וניתוח תרחיפים חד-תאיים של תת-קבוצות חיסוניות ממעי מורין נגועים בפוליגירוס Heligmosomoides. בהתבסס על זה, יש לנו עכשיו סטנדרטיזציה פרוטוקול לבידוד וניתוח ציטוטומטרי של תאי לימפה המבטאים IL-9 מן המעי נגוע N. brasiliensis. בנוסף, ביססנו קינטיקה IL-9 ממקורות תאיים שונים וממיקומים אנטומיים שונים במהלך הזיהום.

אפיון אוכלוסיות התאים השונות המעורבות בזיהום זה חיוני להבנה רחבה יותר של התגובה החיסונית לטפיל והאינטראקציה שלו עם הפונדקאי. פרוטוקול מקיף זה מספק מסלול ברור לבידוד וניתוח תאים מייצרי IL-9 מאיברים רצויים בשלבי מחלה, ומאפשר שיפור חד של הידע על תפקידם של תאים אלה בזיהום N. brasiliensis ובזיהומים טפילים בכלל.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה הפנימית לטיפול בבעלי חיים (CICUAL) של המכון לפיזיולוגיה תאית, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו.

הערה: תרשים זרימה של הפרוטוקול כולו מוצג באיור 1.

1. דיור של עכברים

  1. השתמשו בקבוצות עכברים בנות 8-10 שבועות, נקבות או זכרים, השוכנים במתקני בעלי חיים עם טמפרטורה ולחות קבועות במחזורי אור/חושך של 12 שעות , עם גישה למים ולמזון.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש בזן עכבר מדווח IL-9 ברקע C57BL/6, כמתוארלעיל 4; עם זאת, זנים אחרים של כתב IL-9 יכולים לשמש 6,7,8, כמו גם צביעת IL-9 תוך תאית, עם תוצאות משתנות 9.

2. זיהום של עכברים

  1. יש לגלח את גב העכברים ממרכז הגוף ועד סמוך לבסיס הזנב יום אחד לפני ההדבקה. השימוש בחומרי הרדמה אינו חיוני.
  2. לחסן כל עכבר ב-200 זחלי N. brasiliensis (L3) בשלב השלישי ב-100 μL של מלח חוצץ פוספט (PBS)10 בגב התחתון, כפי שתואר קודם לכן2,11, או להזריק 100 μL של PBS בלבד כבקרה. הקריבו את בעלי החיים ביום 4, יום 7 או יום 10 לאחר ההדבקה.

3. בידוד בלוטות לימפה ריאתיות, מעי דק, מדיאסטינליות ומזנטריות

  1. הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם. הניחו את העכבר על גבו ורססו אותו באתנול 70%. בצע חתך קו אמצע באמצעות מספריים ופתח את העור כדי לחשוף את אזורי הבטן ובית החזה.
    הערה: ניתן להשתמש באיזופלורן כשיטת המתת חסד חלופית12. תאי פחמן דו חמצני אינם מומלצים, שכן CO2 מוביל לנזק לרקמת הריאה ודימום13.
  2. בידוד בלוטות הלימפה והריאות המדיאסטינליות
    1. בצע חתך בחזה וחתך בצורת "V" כדי להסיר את הצלעות ושרירי החזה. לאחר חשיפת חלל בית החזה, מקמו את בלוטות הלימפה המדיאסטינליות ליד הוושט, מתחת ללב (ראו איור משלים 1).
    2. חלצו את בלוטות הלימפה המדיאסטינליות ואספו אותן ב-1 מ"ל של מדיום R-10 (טבלה 1) בצלחת תרבית של 12 בארות. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד לעיבוד.
      הערה: הדגימות צריכות להיות מוגנות מפני אור, כדי למנוע הפחתת האות הפלואורסצנטי מהעכברים המדווחים המשמשים בניסויים אלה.
    3. לחלץ את הריאות ולאסוף אותם 1 מ"ל של מדיום R-10 בצלחת תרבית 12 בארות לכל עכבר. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד לעיבוד.
  3. בידוד שרשראות בלוטות לימפה מזנטריות ומעי דק
    1. חשוף את חלל הצפק, והזז בזהירות את המעי הדק ימינה כדי לחשוף את שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות (MLN) לאורך המעי הגס.
    2. בעזרת מלקחיים, להסיר את MLN, לגלגל אותו בעדינות על מגבת נייר, ולמשוך את השומן.
    3. העבר את MLN ל 1 מ"ל של מדיום R-10 בצלחת תרבית של 12 בארות. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד לעיבוד.
    4. חותכים את המעי הדק ממש מתחת לסוגר הפילורי ומעל הצקום. משוך את המעי החוצה לאט בעזרת מלקחיים, הסרת mesentery מחובר רקמת שומן.
    5. הניחו את המעי הדק על מגבת נייר והרטיבו אותו בנדיבות עם PBS. הסר את מדבקות פייר מהמעי הדק עם מספריים.
      הערה: כדי לשמור על כדאיות, להסיר את רקמת השומן הנותרת, ולשמור על המעי הדק לח עם PBS במהלך כל התהליך.
    6. חותכים את המעי הדק לאורכו באמצעות מספריים, ומחליקים בעדינות את המלקחיים על המעי הפתוח כדי להסיר את תוכן הצואה והריר.
    7. החזיקו את המעי הדק עם מלקחיים, ושטפו אותו ב 5 מ"ל של PBS על קרח על ידי טבילה בזהירות אותו כמה פעמים. חזור על הפעולה פעמיים.
    8. חותכים את המעי הדק לחתיכות קצרות (כ -5 מ"מ), ואוספים אותם בצינור חרוטי 50 מ"ל עם 10 מ"ל של HBSS14 עם 2% FBS (טבלה 1). מיד להמשיך לבודד תאים intraepithelial ו lamina propria.

4. הכנת תרחיפים חד-תאיים מהמעי הדק, הריאה ובלוטות הלימפה

הערה: חשוב מאוד לעבד עד שישה עכברים לאדם בעת הכנת תרחיפים חד-תאיים ממעי דק, מכיוון שיכולת הקיום של התאים פוחתת באופן משמעותי עם תקופות עיבוד ארוכות יותר. שיטה זו הותאמה ממודל5 של עכבר זיהום Heligmosomoides polygyrus.

  1. חממו מראש את האינקובטור הרועד, R-20 medium, HBSS ו-HBSS-2 mM EDTA (טבלה 1) ב-37°C.
  2. הכינו 10 מ"ל של מדיום עיכול המעי הדק (טבלה 1) לדגימה.
  3. נערו את חתיכות המעי משלב 3.3.8 במרץ ביד.
  4. מסננים כל דגימה דרך רשת ניילון (כ-10X10 ס"מ) מעל משפך זכוכית. שטפו את הדגימה על ידי הוספת 10 מ"ל HBSS שחומם מראש על הרשת והשליכו את הזרימה. חזור על הפעולה פעם נוספת.
    הערה: השתמשו ברשת שינוי חדשה לכל דגימה ועשו בה שימוש חוזר לאורך כל ההליך.
  5. הסר את הרשת מהמשפך, ואסוף את הדגימה מהרשת בצינור חרוטי של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של HBSS-2 mM EDTA חם (שלב 4.1). יש לדגור במשך 10 דקות ב-37°C, עם רעידות ב-200 סל"ד.
  6. מערבולות במשך 10 שניות במהירות מרבית (3,200 סל"ד) ומסננים את הדגימה עם הרשת מעל משפך זכוכית, ומשחזרים את הזרימה בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  7. חזור על שלבים 4.5 ו -4.6 פעמיים, לשחזר את הזרימה דרך באותו צינור חרוטי 50 מ"ל. התאים intraepithelial ממוקמים זה 30 מ"ל חלק. שמור את הרקמה הנותרת.
  8. הכנת תרחיף חד תאי מתאים תוך אפיתל
    1. צנטריפוגה 30 מ"ל של תרחיף התא, התאושש בשלב 4.7, ב 450 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנטנט.
    2. הוסף 5 מ"ל PBS וצנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך את supernatant.
    3. השהה מחדש את גלולת התא ב-3 מ"ל של RPMI 10% FBS-20 מיקרוגרם/מ"ל DNase (טבלה 1). יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד להכתמת תאים.
  9. הכנת תרחיף חד תאי מתאי lamina propria
    1. שטפו את רקמת המעי הדק הנותרת משלב 4.7 על ידי שפיכת מעל 10 מ"ל HBSS חם דרך הרשת מעל המשפך. חזרו על הכביסה. לאסוף את הרקמה מן הרשת בצינור חרוטי 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום העיכול המעי הדק.
    2. יש לדגור במשך 30 דקות ב-37°C, עם רעידות ב-200 סל"ד. מערבולת במהירות מרבית למשך 10 שניות כל 5 דקות.
    3. הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS-EDTA (טבלה 1) כדי לעצור את תגובת העיכול, והניחו אותו על קרח.
    4. מסננים כל דגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר באמצעות פיפטה סרולוגית, ומשחזרים את התרחיף בצינור חרוטי של 50 מ"ל המונח על קרח.
    5. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
    6. השליכו את הסופרנטנט. לשטוף את גלולת התא עם 5 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
    7. השליכו את הסופרנטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של סל"ד 10% FBS-20 מיקרוגרם/מ"ל DNase. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד להכתמת תאים.
  10. הכנת תרחיף חד תאי מהריאה
    הערה: כל ריאה ומעי דק צריכים להיות מעובדים במקביל על ידי שני אנשים כדי למנוע זמני טיפול ארוכים, אשר גורמים לכדאיות תאים נמוכה.
    1. הכינו 4 מ"ל של מדיום עיכול ריאות (טבלה 1) לכל דגימה מעובדת.
    2. הסר את מדיום RPMI מהבאר המכילה את הריאות משלב 3.2.3. חותכים את הריאה לחתיכות קטנות עם מספריים עדינים.
    3. מעבירים את חתיכות הריאה לצינור חרוטי 15 מ"ל עם מרית. הוסף 4 מ"ל של מדיום עיכול ריאות (טבלה 1).
    4. יש לדגור במשך 30 דקות ב-37°C, עם רעידות ב-250 סל"ד. בסיום, יש לשמור על קרח עד שכל דגימה מעובדת.
    5. סנן כל דגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר, הממוקמת בבאר אחת של צלחת תרבית בת 6 בארות. לנתק את הרקמה עם בוכנה מזרק.
    6. שחזר כל דגימה בצינור חרוטי של 15 מ"ל, והוסף 4 מ"ל של מדיום R-2 (טבלה 1). שמור על קרח בזמן שהדגימות האחרות מעובדות.
    7. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיום R-5 (טבלה 1).
    8. בזמן הצנטריפוגה, הכינו 4 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות של 27.5% (טבלה 1) לכל דגימה כדי להעשיר את מקטע התא ההמטופויטי15,16. אסטרטגיה זו להפרדת תא בודד יעילה יותר, חסכונית יותר ורעילה פחות בהשוואה למדיות שיפוע צפיפות דומות אחרות17.
    9. הוסף 4 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות של 27.5% ל- 1 מ"ל של תרחיף התא משלב 4.10.7, ונער במרץ.
    10. הוסף באיטיות 1 מ"ל של R-5 בינוני (טבלה 1) על גבי המתלה המעורב כדי ליצור שני שלבים.
    11. צנטריפוגה במהירות 1,500 x גרם למשך 20 דקות ב-RT, עם האצה נמוכה והבלם כבוי. שימו לב לטבעת שנוצרה בין שני השלבים.
    12. לשחזר את הטבעת שנוצרה בין שני השלבים עם micropipette 1 מ"ל, ו resuspend ב 4 מ"ל של מדיום R-2.
    13. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט. השהה מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של חיץ ACK (טבלה 1), ודגר במשך דקה אחת ב-RT.
    14. הוסף 4 מ"ל של R-5 בינוני וצנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיום R-10. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד להכתמה לצורך ציטומטריית זרימה.
  11. הכנת השעיה חד-תאית מבלוטות הלימפה
    1. מניחים את בלוטות הלימפה משלבים 3.2.2 או 3.3.3 בין שתי חתיכות רשת בבאר מצלחת תרבית של 6 בארות, ומתנתקים עם בוכנה מזרק.
    2. לשחזר את השעיית התא בצינור חרוטי 1.5 מ"ל צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום R-10. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד להכתמה לצורך ציטומטריית זרימה.
      הערה: אם הגושים גלויים, סנן את הדגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר.

5. צביעת תאים עבור ציטומטריית זרימה (איור 2 ואיור 3)

הערה: צנטריפוגה של תאי בלוטות הלימפה מתרחפת משלב 4.11.3 ב- 450 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 ° C, ומשהה מחדש את כדורית התא ב- 500 μL של מאגר FACS (טבלה 1).

  1. צביעת תאים לזיהוי ILC2s (איור 3 ואיור משלים 2)
    הערה: הליך צביעה זה הוא ספציפי לזיהוי תאי ILC2 המבטאים IL-9.
    1. צלחת 150 μL לדגימת ריאה (כ 1.8 x 106 תאים) משלב 4.10.14, ו 50 μL לכל דגימת בלוטות לימפה משלב 4.11.3 (בערך 0.7 x 10 6 ו 2.2 x 106 תאים עבור דגימות בלוטות לימפה mediastinal ו mesenteric, בהתאמה) בלוח תרבית תחתית חרוטי 96 באר. הוסף 100 μL של מאגר FACS, וצנטריפוגה ב 450 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    2. צלחת 100 μL לכל דגימת מעי דק (כ 2.7 x 10 6 ו 0.6 x 106 תאים עבור דגימות intraepithelial ו lamina propria, בהתאמה) משלבים 4.8.3 ו 4.9.7 בצלחת תרבית תחתית חרוטי 96 באר. הוסף 150 μL של חיץ FACS וצנטריפוגה ב 450 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש כל גלולה ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים הביוטינילציה (טבלה 2) המדולל במאגר FAC. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C המוגנת מפני אור.
      הערה: השתמש במאגר FACS עם DNase של 20 מיקרוגרם/מ"ל עבור דגימות intraepithelial ו- lamina propria.
    4. הוסף 150 μL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של חיץ FACS. שוב צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט.
    6. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים/הכתם (טבלה 2), ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור.
    7. הוסף 150 μL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    8. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של חיץ FACS. שוב צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט. חזור על הכביסה (שלב 5.1.7), והשלך את supernatant.
    9. להשהות מחדש את גלולת התא ב 300 μL של מאגר FACS, ולנתח על ידי ציטומטריית זרימה.
    10. עבור דגימות המעי הדק והריאות, השתמשו באסטרטגיית הגאט: לימפוציטים, תאים בודדים, תאים חיים, תאים המטופויטיים, תאי CD90+שושלת, תאי ST2+ ותאי IL-9+ (איור 3A,B ואיור משלים 2A). עבור דגימות בלוטות הלימפה, השתמשו באסטרטגיית gating: תאים חיים, תאים בודדים, תאי שושלת CD90+, תאי ST2+ ותאי IL-9+ (איור משלים 2B,C).
  2. צביעת תאים לזיהוי לימפוציטים מייצרי IL-9 (איור 2 ואיור משלים 3)
    1. העבר 800 μL לכל דגימת ריאה משלב 4.10.14 לצינור 1.5 מ"ל (כ 14.6 x 106 תאים). צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
    2. עבור דגימות בלוטות לימפה, צלחת 400 μL של תרחיף התא משלב 4.11.3 (כ 5.6 x 10 6 ו 17.5 x 106 תאים עבור דגימות בלוטות לימפה mediastinal ו mesenteric, בהתאמה) בלוח תחתון חרוטי 96 היטב בשני שלבים.
      1. מעבירים 200 μL תחילה, צנטריפוגה ב 450 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C, ומשליכים את supernatant.
      2. מעבירים עוד 200 μL לבאר המתאימה. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ולהשליך את supernatant.
    3. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-50-400 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים/הכתם (טבלה 3), ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור.
      הערה: דגימות ריאה צריכות להיות מושעות מחדש ב 400 μL, דגימות בלוטות לימפה mediastinal ב 50 μL, ודגימות בלוטות לימפה mesenteric ב 100 μL של קוקטייל מכתים.
    4. הוסף 150 μL של חיץ FACS לדגימות בלוטות הלימפה המדיאסטינליות ו- 100 μL לדגימות בלוטות הלימפה המזנטריות. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ולהשליך את supernatant.
    5. לשטוף את דגימות הריאה ובלוטות הלימפה על ידי השעיה מחדש של הכדוריות ב 1 מ"ל ו 200 μL של חיץ FACS, בהתאמה. צנטריפוגה ב 450 xגרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט וחזרו על הכביסה.
    6. להשהות מחדש את דגימות הריאה ב 600 μL של מאגר FACS, ולנתח אותם על ידי ציטומטריית זרימה. השתמשו באסטרטגיית הגטינג: לימפוציטים, תאים בודדים, תאים חיים, תאים המטופויטיים, תאי CD4+TCRβ+ ותאי IL-9+ (איור 2A).
    7. להשהות מחדש את דגימות בלוטות הלימפה ב 300 μL של מאגר FACS, ולנתח על ידי ציטומטריית זרימה. השתמשו באסטרטגיית הגטינג: לימפוציטים, תאים בודדים, תאים חיים, תאי CD4+ TCRβ+ ותאי IL-9+ (איור 2B ואיור משלים 3A).

6. קביעת מספר מוחלט של תאים בתרחיפים חד-תאיים

  1. דללו את הדגימות משלבי בידוד 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 ו-4.11.3 עם PBS ביחס של 1:20 (10 μL של דגימה + 190 μL של PBS).
  2. יש לערבב 10 μL מכל דגימה מדוללת משלב 6.1 עם 10 μL של Trypan Blue. טען 10 μL לתוך hemocytometer ולספור את התאים החיים, בהתחשב בכל דילול.
  3. השג את המספרים האבסולוטיים של תאים על-ידי הכפלת אחוז האוכלוסייה המעניינת מתאים חיים שנקבע על-ידי ציטומטריית זרימה (כדאיות תאים שליליים) במספר הכולל של תאים חיים בתרחיף של תא בודד לאחר בידוד, וחלוקת מספר זה ב-100 (איור משלים 4, איור משלים 5 ואיור משלים 6).
    מספר מוחלט = (אחוז אוכלוסיית העניין מתאים חיים שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה x המספר הכולל של תאים חיים בתרחיף של תא בודד)/100

תוצאות

לעכברים הוזרקו תת עורית 200 זחלי L3 שלב N. brasiliensis , או PBS לבקרות דמה. מספר הזחלים המשמשים בפרוטוקול זה הותאם על מנת לבודד תאים בני קיימא מהריאות, מרקמת הלימפה ומהמעי הדק, בניגוד לדיווחים קודמים שבהם נעשה שימוש בעומסים גבוהים יותר של תולעים כדי לאתר תאים ברקמות הלימפה ובריאות, רק4

Discussion

הבנה מלאה של אינטראקציות טפיל-מארח במעי ותגובות חיסוניות לזיהום הלמינת'ס דורשת זיהוי וניתוח של אוכלוסיות התאים השונות ומולקולות ההשפעה שהן המפתח להשראת עיצוב מחדש של רקמות וסילוק תולעים. זיהומי הלמינת'ס המועברים בקרקע מהווים בעיה גדולה במדינות מתפתחות ברחבי העולם. עם זאת, עד לאחרונה, פרו...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לחוסה לואיס ראמוס-בלדראס על תמיכתו הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המענק הבא ל- PLL מ- CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P ו-EO-M קיבלו מלגה מ-CONACYT (736162 ו-481437, בהתאמה). MCM-M קיבל מלגה מ- CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ACK bufferHomemade
Attune Nxt cytometerThermofisher
B220Biolegend103204
CD11bBiolegend101204
CD11c Biolegend117304
CD19 Biolegend115504
CD4Biolegend100404
CD4 (BV421)Biolegend100443
CD45.2Biolegend109846
CD8 Biolegend100703
CD90.2Biolegend105314
Collagenase DRoche11088866001
DNAse IInvitrogen18068015Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorterBD Biosciences
FACS Melody cell sorterBD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
FcεRIeBioscience13589885
Fetal bovine serumGibco26140079
FlowJoFlowJoFlow cytometry analysis data software
Gr-1Tonbo305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Homemade
IL-9biolegend514103
NK1.1 Biolegend108704
Nylon mesh ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Phosphate-buffered saline Homemade
RPMIGibco11875093
Siglec F Biolegend155512
StreptavidinBiolegend405206
TCR-β Biolegend109203
TCR-β (PE/Cy7)Biolegend109222
TCR-γδ Biolegend118103
Ter119Biolegend116204
Tricine buffer Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability DyeBiolegend423101

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193IL 9Th9ILC2IL 9N brasiliensis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved