תצפית פלואורסצנטית עמוקה בצילומי אורז באמצעות טכנולוגיית סליקה

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי של יורה אורז, שקשה להכין לתצפיות מבניות פנימיות בגלל האופי הקשה, העבה או השכבתי של הרקמות. שיטה זו מאפשרת תצפיות פלואורסצנטיות מתמשכות ועמוקות, אפילו בצמחי אורז בוגרים.

Abstract

טכנולוגיית הסליקה שפותחה לאחרונה, המונעת אי-התאמות במקדם השבירה ומפחיתה את החומר הפלואורסצנטי האוטומטי, אפשרה לצפות ברקמות צמחים בתלת-ממד (3D) תוך שמירה על המבנים הפנימיים שלהן. באורז (Oryza sativa L.), צמח מודל מונוקוט וגידול בעל חשיבות עולמית, דווח על טכנולוגיית ניקוי באיברים שקל יחסית לצפות בהם, כמו השורשים והעלים. כמו כן דווח על יישומים של טכנולוגיית סליקה ב-shoot apical meristem (SAM) ובגבעולים, אך רק במידה מוגבלת בגלל החדירה הלקויה של תמיסת הסליקה (CS) לרקמות אלה. היעילות המוגבלת של תמיסות הניקוי ברקמות אלה מיוחסת לפלואורסצנטיות אוטומטית, עיבוי והתקשות של הרקמות בגבעול כאשר צרורות כלי הדם והאפידרמיס מתפתחים ושכבות של ה-SAM עם עלים דוחי מים. הפרוטוקול הנוכחי מדווח על אופטימיזציה של גישת ניקוי לתצפית רציפה ותלת-ממדית של ביטוי גנים מה-SAM/הפאניקה הצעירה לבסיס היורים במהלך הפיתוח. דגימות רקמה קבועות המבטאות כתב חלבון פלואורסצנטי נחתכו למקטעים באמצעות מיקרו-פרוסה רוטטת. כאשר הושג עובי מתאים, הוחל ה- CS. על ידי התמקדות ספציפית ברקמה המרכזית, קצב החדירה והאחידות של CS גדלו, והזמן הנדרש כדי להפוך את הרקמה לשקופה ירד. בנוסף, ניקוי המקטעים החתוכים איפשר תצפית על המבנה הפנימי של הצילום כולו מנקודת מבט מאקרו. לשיטה זו יש יישומים פוטנציאליים בהדמיה עמוקה של רקמות של מיני צמחים אחרים שקשה לנקות.

Introduction

טכנולוגיית הסליקה שפותחה לאחרונה אפשרה לצפות ברקמות העמוקות של הצמחים תוך שמירה על המבנה הפנימי שלהם ^1,2,3. בצמח מודל הדיקוט Arabidopsis, מחקרים רבים על הדמיית חלבונים פלואורסצנטיים נערכו באמצעות טכנולוגיית ניקוי כדי למנוע אי התאמות במקדם השבירה ולהסיר חומרים פלואורסצנטיים אוטומטיים ^4,5,6. אף על פי שהשימוש בטכנולוגיית ניקוי^7,8 והדמיה תלת-ממדית ברזולוציה תאית⁹ דווחו באורז (Oryza sativa L.), צמח מודל מונוקוט וגידול בעל חשיבות עולמית, אלה מוגבלים לאיברים דקים ורכים יחסית^, כגון שורשים, עלים ומרים אפיקליים (SAM), שקל לצפות בהם.

היורה הוא האיבר העיקרי המהווה את החלקים שמעל פני הקרקע של צמחים וסקולריים. באורז, יורה מורכבת מסדרה של "פיטומרים" בערימה אנכית, הכוללת ניצנים בבית השחי, עלים וגבעול¹⁰. בקצה היורה, ה-SAM מורכב מתאי גזע לא מובחנים במרכז. פיטומרים נוצרים על ידי התמיינות של תאים שמקורם ב- SAM. לאחר שהצמחים עוברים משלב הווגטטיבי לשלב הרבייה, גבעולי האורז מתארכים וה-SAM מתפרק לפאניקה צעירה¹⁰. שינוי התפתחותי זה מלווה בתנודות בביטוי של גנים שונים בגבעולים וב-SAM/Young panicles. כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס התמיינות התאים לרקמות שונות, חשוב לבחון באופן מבני את המורפולוגיה של התא ואת ביטוי הגנים ברקמות היורה הפנימיות. עם זאת, ההדמיה העמוקה של גבעולים (צמתים ואינטרנודות) בצילום מהווה אתגר בגלל חוסר היעילות של ניקוי פתרונות לחדירה לרקמה. הגבעולים עוברים באופן מיידי גידול מהיר בנפח מצמיחה לרוחב לאחר התמיינות מה-SAM. התקשות רקמות צומת האורז עקב עיבוי צרורות כלי הדם והקישור המורכב האופקי של אנסטומוזיס כלי הדם הנודלי, בנוסף לדחייה הגבוהה של יורה אורז, כולם תורמים להגבלת החדירה של CS בגבעולים¹⁰.

מחקר זה נועד לבחון שינויים בביטוי גנים ברקמות יורה אורז באמצעות טכניקת פלואורסצנציה עמוקה מבנית. עבודה זו מייעלת פרוטוקול ניקוי עבור אורז כדי לצפות באופן רציף בביטוי גנים מה-SAM/young panicle לבסיס במבנה תלת-ממדי, ולא על משטח שטוח, באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.

Protocol

1. הכנת הפתרון המקבע

1. העבירו 70 מ"ל מים סטריליים לבקבוק זכוכית והוסיפו 10 גרם של פרפורמלדהיד (PFA).
   אזהרה: PFA הוא רעיל; לפיכך, מומלץ ללבוש כפפות.
2. הוסף 2 מ"ל של 1 N NaOH כדי להמיס את תמיסת ה- PFA.
3. ממיסים את תמיסת ה-PFA בערבוב רציף (300-500 סל"ד) ב-60°C למשך כשעה עד שתמיסת ה-PFA שקופה.
4. הוסף מים מעוקרים כדי להגדיל את נפח תמיסת PFA ל -100 מ"ל.
   הערה: תמיסת PFA הוכנה טרייה לפני השימוש. יתר על כן, ניתן להשתמש בתמיסת PFA המאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך כחודשיים.
5. מיד לפני הדגימה, יש להוסיף 25 מ"ל של 60 מ"ל HEPES (pH 7.4), 3 מ"ל של 1 מ' סוכרוז ו-2 מ"ל מים סטריליים ל-20 מ"ל של 10% PFA כדי להכין תמיסה מתקבעת של 50 מ"ל.

2. הכנת פתרון הסליקה (CS)

1. שוקלים ומערבבים 7.5 גרם נתרן דאוקסיכולאט, 5 גרם קסיליטול ו-12.5 גרם אוריאה (ראו טבלת חומרים) ב-50 מ"ל של מים סטריליים.
   הערה: אבקת נתרן דאוקסיכולאט נשקלה בתא טיוטה כללי במעבדה כדי למנוע פיזור באוויר.
2. ממיסים את המרכיבים (שלב 2.1.) בעזרת מערבל מגנטי להכנת ה-CS.
   הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בפתרון סליקה מוכן פנימי (CS), אך ניתן להשתמש גם בפתרון סליקה זמין מסחרית, ClearSee (ראה טבלת חומרים).
3. מעבירים את ה-CS לצינור חרוטי של 50 מ"ל ומאחסנים אותו בטמפרטורת החדר (15-30 מעלות צלזיוס) בחושך.
   הערה: ניתן לאחסן את CS במשך יותר משנה אחת.

3. דגימה

1. חותכים את השורשים בזהירות מבלי לפגוע בצמחים. שטפו את הצמחים במים כדי להסיר את הלכלוך.
   הערה: שיטה זו חקרה את התצפית על רקמות משלב שלושת העלים (LS) ועד לדגל LS. המחקר הנוכחי השתמש בזני האורז Nipponbare (ניפ) וטאיצ'ונג 65 (T65) ב-8-10 LS.
2. מקלפים את העלים החיצוניים הישנים בידיים ובפינצטה. נותרו בערך 2-3 עלים.
3. חתכו את הרקמה מה-SAM/הבהלה הצעירה לבסיס בעזרת סכין גילוח בעל קצה אחד באמצעות תנועת החלקה כדי להימנע מריסוק התאים (איור 1A-C). אם המיקום של ה-SAM/הפאניקה הצעירה אינו נראה לעין, חתכו אותו לזמן רב יותר.
4. מאחר שלחתך הרוחב של יורה האורז יש צורה אליפטית (איור 1D), התגלחו מצד אחד של האליפסה דק בכיוון הציר הארוך שלה בעזרת סכין גילוח בעל קצוות כפולים (איור 1E-F).
   הערה: שלב זה הקל על הפתרון המקבע לחדור את הדגימה. משטח חיתוך אופקי מקל על הדבקת הדגימה למגש מיקרו-פריסה רוטט (ראו טבלת חומרים).
5. אשרו את המיקום של ה-SAM/הבהלה הצעירה על-ידי הופעת צבע לבנבן בדגימה (איור 1G). חותכים את הרקמה העודפת.
   הערה: יש להתאים את אורך הדגימה לאורך המרבי שניתן לחתוך באמצעות מיקרו-פרוסה רוטטת. אם המדגם ארוך מדי, חלקו אותו למספר חלקים.

4. קיבוע הדגימות

1. פיפטה 1 מ"ל של הפתרון המקובע (מוכן בשלב 1.) לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ומיד לשים את הדגימות.
   הערה: ודא שכמות הדגימה אינה עולה על 20% מנפח הפתרון המתקן.
2. חותכים חתיכת סרט פרפין לתוך 2.5 ס"מ². עצבו את שכבת הפרפין לכדורים והניחו אותם על גבי הדגימות כדי למנוע מהם לצוף החוצה מהתמיסה המתקבעת.
3. מניחים את הצינור המכיל את הדגימה בתוך ייבוש. לאחר מכן, סגרו את המכסה של חומר הייבוש והפעילו את משאבת הוואקום כדי לדכא את החלק הפנימי של הייבוש עד −0.095 MPa באיטיות.
4. לאחר סגירת הייבוש ב -0.095 MPa, כבה את משאבת הוואקום ואפשר לה לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: רמת הוואקום הייתה כזו שבועות הופיעו בהדרגה בדגימות.
5. פותחים מעט את הייבוש ומחזירים אותו לאט לאט ללחץ האטמוספרי. הפחיתו את הלחץ של חומר הייבוש ל-0.095 MPa-, כבו את משאבת הוואקום ואפשרו לתערובת לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. פותחים מעט את הייבוש ומחזירים אותו לאט לאט ללחץ האטמוספרי. אם המדגם קבוע כראוי, הוא שוקע לתוך הפתרון המקבע. אם זה לא לשקוע, להפחית את הלחץ שוב.
7. מוציאים את סרט הפרפין, סוגרים את המכסה ושומרים את הצינורות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: הדגימות תוקנו בתמיסה מקובעת למשך שעתיים לפחות. זה יכול להיות מאוחסן במשך ~ 1 שבוע.

5. חיתוך המדגם הקבוע

1. הסירו את עודפי התמיסה המקובעת מהדגימה באמצעות מגבונים נטולי מוך.
   הערה: עודף תמיסה מקובעת מונע מהדגימה להידבק כראוי למגש.
2. תקן את הדגימה על מגש מיקרו-פריסה רוטט עם דבק מיידי. הניחו אותו על מגש כשהצד השטוח כלפי מטה, שגולח במהלך הדגימה.
   הערה: בשל המבנה של יורה האורז, יש לקצץ אותו מהבסיס לכיוון ה- SAM/young panicle.
3. הגדר את תנאי החיתוך בהתאם למדגם הקבוע.
   הערה: במחקר זה, הזמירה הוגדרה ל-THICK, 130 מיקרומטר; רחב, 15 מ"מ; תדירות, 15%; ומהירות חיתוך, 32 מ"מ.
4. התאם את המיקום לדוגמה באמצעות לחצן RVS או FWD והלחצן UP או DOWN . מלאו את המגש במים שעברו דה-יוניזציה עד שכל הדגימות נטבלות. לאחר מילוי המגש, לחץ על לחצן התחל . הניחו את הדוגמאות החתוכות על שקופית זכוכית עם טיפה של PBS אחד.
   הערה: הזז את מיקום הדגימה לצד השני לאחר כל חיתוך מכיוון שהדגימה הקשה שוחקת את סכין הגילוח.
5. לאחר בדיקת הדגימה המכילה את אתר היעד תחת סטריאומיקרוסקופ, העבר את הדגימה החתוכה לצלחת מרובת בתים עם 1 מ"ל של PBS 1x.
   הערה: בחר את מספר הבארות בהתאם לגודל המדגם. במחקר זה נעשה שימוש בצלחת מרובת 12 קומות.

6. טיפול בפתרון הסליקה

1. הסר את ה- PBS 1x מצלחת המולטיוול והוסף PBS 1x טרי. תן לזה לעמוד במשך דקה אחת.
2. הסר PBS 1x והוסף את CS.
   הערה: כמות CS חייבת להיות פי חמישה מנפח הדגימה.
3. מניחים את הלוחית הרב-תכליתית המכילה את הדגימה במתקן ייבוש. לאחר מכן, סגרו את המכסה של חומר הייבוש והפעילו את משאבת הוואקום כדי לדכא את החלק הפנימי של הייבוש עד −0.09 MPa באיטיות.
4. לאחר סגירת הייבוש ב -0.09 MPa, כבה את משאבת הוואקום ותן לה לעמוד במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
5. פותחים מעט את הייבוש ומחזירים אותו לאט לאט ללחץ האטמוספרי.
6. יוצקים מים שעברו דה-יוניזציה לתוך המרווח בין הבארות כדי למנוע אידוי של CS. אחסנו את הלוחות המרובי בטמפרטורת החדר בחושך לצורך ניקוי.
   הערה: יש לנער בעדינות את צלחת המולטי-וול כל 1-2 ימים כדי לפזר את הכלורופיל ורכיבים אחרים.
7. כאשר CS הופך ירוק, החלף אותו עם פתרון טרי.

7. צביעת דופן התא בצבע כימי

1. מפרקים את התמיסה הלבנה של קלקופולאור (1 מ"ל, ריכוז סופי: 1 מ"ג/מ"ל בתמיסת הניקוי, ראו טבלת חומרים) לתוך צלחת מרובת קומות. מניחים את הדגימות בתמיסת הצבע ודוגרים במשך שעה אחת.
   הערה: נפח הצבע לא יעלה על 10% מנפח ה-CS.
2. לשטוף את הדגימות המוכתמות בצלחת multiwell אחרת עם 1 מ"ל של CS במשך שעה אחת לפחות.

8. תצפית עם מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי

1. הנח טיפה של CS על שקופית מיקרוסקופ והעבר את הדגימות שטופלו (עם CS) לשקופית.
   הערה: מכיוון שהדגימות המטופלות רכות, יש לטפל בהן בזהירות בפינצטה.
2. כסו את הדגימה בכיסוי זכוכית כדי למנוע אידוי של ה- CS.
   הערה: מדעי המחשב מזרזים בקלות.
3. שימו לב לדגימות המטופלות תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.
   הערה: לאחר התצפית, ניתן להחזיר את הדגימות שטופלו ל- CS לתצפיות נוספות מאוחר יותר.

תוצאות

ראשית, המידה שבה ניתן היה להפוך את הרקמות הקשות והעבות של צמחי אורז בוגרים לשקופות על ידי טיפול הניקוי אומתה. נעשה שימוש ב-9-10 LS, שהוא שלב היווצרות הפאניקה, ורקמות באורך 12-16 מ"מ שנחתכו מהבהלה הצעירה לבסיס היורה. דגימות אלה, כולל הבהלה הצעירה, תוקנו בתמיסה המקובעת ונצפו לפני ואחרי 1-4 שבועות של טיפול הסליקה (איור 2). הדגימות הלא חתוכות נשארו ירוקות ולא הפכו לשקופות לאחר 4 שבועות או אפילו לאחר 3 חודשי טיפול בתמיסת הסליקה (איור 2A). בדגימות שקולפו מכל העלים, האינטרנודות הפכו לבנות לאחר שבוע של טיפול ב- CS, אם כי הצמתים נותרו ירוקים. דגימה זו לא הפכה לשקופה לאחר 4 שבועות (איור 2B). לאחר 3 חודשים של טיפול ב- CS, רק הפאניקה הצעירה הפכה שקופה. הדגימות שנחתכו ביד השתנו ללבן, למעט העלים החיצוניים וצרורות כלי הדם, לאחר שבוע של טיפול ב- CS. חלקים מסוימים של העלים, הבהלה הצעירה והאינטרנודות נעשו שקופים, אך לא נעשו שקופים לאחר 4 שבועות (איור 2C). לאחר 3 חודשים, רק הבהלה הצעירה והעלים הפנימיים הפכו שקופים. הדגימות שנחתכו לעובי של 130 מיקרומטר עם המיקרו-פרוסה הרוטטת הפכו לשקופות לאחר שבוע של טיפול ב-CS, כשהעלים הופכים לשקופים. לאחר שבועיים, הדגימה הייתה כמעט שקופה ונותרה ללא שינוי לאחר 4 שבועות (איור 2D). לאחר 3 חודשים, הדגימות הפכו שקופות לחלוטין.

לאחר מכן, אומת העומק שבו טיפול הניקוי איפשר תצפיות ביטוי גנים בצילומי T65 ב-8 LS. נעשה שימוש בירי מבוטא UBQpro:: NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN, ראה טבלת חומרים). דגימות הרקמה תוקנו בתמיסה המקובעת לפני קיצורן לעובי של 130 מיקרומטר באמצעות מיקרו-פרוסה רוטטת. לאחר מכן נצפו הדגימות תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי (לייזר: 488 ננומטר/13%, מטרה: 20x, חור סיכה: 0.93 AU, ממוצע: 16, רווח גלאי: 800) במרווחים של 10 מיקרומטר בכיוון ציר z בכל שבוע מ-0-4 שבועות של טיפול ב-CS. התוצאות המייצגות מוצגות באיור 3. כל הנתונים הותאמו באותו עיבוד כדי להשוות את עוצמת הפלואורסצנטיות. בצומת ללא הטיפול, אותות פלואורסצנטיים קלושים נצפו בעומק של −40 מיקרומטר (איור 3A). העומק הנצפה היה −60 מיקרומטר לאחר שבוע אחד של טיפול CS ו -−90 מיקרומטר לאחר שבועיים, אך פלואורסצנציה אוטומטית של הציטופלסמה הורגשה בשני השבועות בעומק של −20 מיקרומטר. האוטופלואורסצנציה נחלשה במקצת לאחר 3 שבועות ולא נראתה עוד לאחר 4 שבועות. אותות פלואורסצנטיים נצפו בעומק של −80 מיקרומטר ב-3 שבועות ובעומק של −100 מיקרומטר ב-4 שבועות. באינטרנודה, אותות פלואורסצנטיים נצפו בעומק של −60 מיקרומטר ללא טיפול CS (איור 3B). העומק הנצפה היה −90 מיקרומטר לאחר שבוע עד 3 שבועות של טיפול CS ו-−100 מיקרומטר לאחר 4 שבועות, אך פלואורסצנציה אוטומטית בציטופלסמה הורגשה בעומק של −20 מיקרומטר לאחר שבוע. פלואורסצנציה אוטומטית כבר לא נראתה לאחר שבועיים. בעלים נצפו אותות פלואורסצנטיים בעומק של −90 מיקרומטר ללא טיפול ב-CS (איור 3C). האותות הפלואורסצנטיים נצפו עמוק יותר בעלים מאשר בצמתים ובאינטרנודות. עם זאת, האותות הפלואורסצנטיים היו חלשים יותר. האותות הפלואורסצנטיים התבהרו לאחר שבוע אחד של טיפול ב- CS ונצפו בעומק של −120 מיקרומטר. לאחר שבועיים ושלושה שבועות, אותות פלואורסצנטיים נצפו בעומק של −110 מיקרומטר, ולאחר 4 שבועות, בעומק של −120 מיקרומטר.

לבסוף, הביטוי של גורם שעתוק OsMADS15¹¹ התמזג עם mOrange 12 נצפתה, אשר מסדיר את המעבר של SAM מן הווגטטיבי לשלב הרבייה¹³. דגימות רקמה מ-Nip ב-10 LS עם OsMADS15-mOrange תוקנו, קוצצו לעובי של 130 מיקרומטר וטופלו ב-CS במשך שבועיים. איור 4 מראה שניתן להשתמש בתמיסת הניקוי בו-זמנית כדי לצפות בחלבונים הפלואורסצנטיים (OsMADS15-mOrange) של ביטוי גנים טבעי וצביעת צבע פלואורסצנטי (לבן קלקופלואור). הפרח כולו בעומקים שבין 0 ל-130 מיקרומטר נצפה, והתמונה התלת-ממדית שוחזרה מ-43 תמונות z-stack במרווחים של 3 מיקרומטר (איור 4E).

איור 1: מיקום הדגימה ועיבודה. (A) שתיל ניפ ב-8 LS בתנאי יום קצר. (B) תצוגה מוגדלת של הבסיס. (C) דגימה שנחתכה מה-SAM/הפאניקה הצעירה לבסיס. (D) חתך סגלגל מ-C (כניסה). (E) גילוח דק של צד אחד של הצילום באמצעות להב. (F) משטח מגולח דק. (G) דוגמה המציגה התארכות אינטרנוד. החלק הלבן המצוין על ידי ראשי החץ הוא צמתים. בצד העליון של הצומת העליון יש את הפאניקה הצעירה. פסי קנה מידה: (A) 10 ס"מ, (B-C,E-G) 1 ס"מ, (D) 0.5 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: ניקוי רקמות תלוי בעובי הדגימה ובתקופת הטיפול ב-CS . (A) דגימות לא מלוטשות עם יריות חלקיות כולל הבהלה הצעירה. עובי מרבי: 4 מ"מ. (B) כל העלים התקלפו מהדגימות כדי לחשוף את הבהלה הצעירה. עובי מקסימלי: 2.5 מ"מ. yp: פאניקה צעירה, ב: internode; ראשי חץ מציינים צומת. (C) דגימות שנחתכו ידנית לעובי של 1 מ"מ. (D) דגימות חתוכות עם המיקרו-פרוסה הרוטטת לעובי של 130 מיקרומטר. סרגל קנה מידה: 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: עומק התצפית הפלואורסצנטית תלוי בסוג הרקמה ובתקופת הטיפול ב-CS. הדמיה עמוקה של UBQpro::NGCN בצומת (A), (B) internode, ו-(C) עלה. "מיזוג" פירושו שהתמונות התמזגו עם תמונת ניגודיות ההפרעות הדיפרנציאליות (DIC) וכל תמונות z-stack. תמונות שבהן לא נצפתה פלואורסצנטיות סומנו כ-"n.d". (לא זוהה). ההגדרות של מיקרוסקופיית הלייזר הקונפוקלית הן כדלקמן: לייזר: 488 ננומטר / 13%, מטרה: 20x, חור סיכה: 0.93 AU, ממוצע: 16, רווח גלאי: 800, מרווח: 10 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: תצפית פלואורסצנטית עמוקה של OsMADS15-mOrange. (A) תמונת ה-DIC של ניפ ב-10 LS. yp: פאניקה צעירה, le: עלה, לא: צומת, בתוך: internode; ראשי חץ מציינים פרחים. (B) תמונה פלואורסצנטית של OsMADS15-mOrange. נקודות צהובות מציינות את החלבונים הפלואורסצנטיים של OsMADS15-mOrange בגרעין. דופן התא הייתה מוכתמת בציאן עם תמיסה לבנה של קלקופלאור. (ג) מבט מוגדל על הבהלה הצעירה. (D) הדמיה עמוקה של הפרח. PA: PALEA, LE: LEMMA, FM: מריסטם פרחוני; כוכביות מציינות אבקנים פרימורדיה. מיקרוסקופ הלייזר הקונפוקלי נקבע כדלקמן: OsMADS15-mOrange; לייזר: 555 ננומטר/13%, מטרה: 20x, חור סיכה: 0.96 AU, ממוצע: 16, רווח גלאי: 800, מרווח: 3 מיקרומטר. לבן קלקופלאור; לייזר: 405 ננומטר/3%, מטרה: 20x, חור סיכה: 0.93 AU, ממוצע: 16, רווח גלאי: 470, מרווח: 3 מיקרומטר. (E) התמונה התלת-ממדית של הדמות (D) הבנויה מתמונות z-stack. פסי קנה מידה: (A-B) 1 מ"מ, (C) 500 μm, (D) 40 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

שלבים קריטיים של הפרוטוקול
השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם קיבוע וזמירה. ליורה אורז יש רקמות קשות, עבות או שכבות המגבילות את החדירה של הפתרון המתקן. כדי לשפר את החדירות של התמיסה המתקבעת, צד אחד של הרקמה היה מגולח דק בעת הדגימה, כפי שניתן לראות באיור 1E-F. בנוסף, טיפולי הוואקום חזרו על עצמם פעמיים בלחץ גבוה יותר. יתר על כן, הדגימות תוקנו בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס במקום הקיבוע הרגיל של שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.

נקודת המפתח בשלב החיתוך היא לקבוע את עובי הרקמות כדי להיות מוכנות לצפות בחלבונים הפלואורסצנטיים תוך שמירה על המבנה הפנימי שלהם לאחר תקופה קצרה של טיפול במדעי המחשב. כפי שניתן לראות באיור 2C, דגימות בעובי 1 מ"מ, שנחתכו ביד דק ככל האפשר, הפכו לשקופות במספר מוגבל של רקמות גם לאחר 3 חודשים של טיפול במדעי המחשב. לכן, שלב הזמירה חיוני לתצפית פלואורסצנטית עמוקה על יורה אורז בוגרת. במחקר זה, הדגימות קוצצו לעובי של 130 מיקרומטר, כפי שמוצג באיור 2D. עובי 130 מיקרומטר איפשר לנקות את העלים לאחר שבוע של טיפול ב- CS ואת כל הדגימה לאחר שבועיים. במחקר זה נעשה שימוש ביורה אורז למבוגרים ב-9-10 LS. רקמות עבות אך רכות יותר מנבטי אורז צעירים יותר עשויות להתפנות מהר יותר עם הטיפול ב-CS. יש להתאים את עובי הדגימות ומשך הטיפול במדעי המחשב בהתאם לסוג הרקמה, מצבה ועובייה של המבנה התלת-ממדי שיש לראות.

שינויים ושיטות לפתרון בעיות
ה- CS זירז בקלות בטמפרטורות נמוכות. ה-CS המזורז אינו יכול לשמר את החלבונים הפלואורסצנטיים; לפיכך, יש להקפיד בעת אחסון הדגימות בטמפרטורה הנכונה. בנוסף, הן ל- CS והן לפתרון המקבע אין אפקט חיטוי; לכן, חלבונים פלואורסצנטיים יתפרקו אם יזדהמו. אורז שגדל באדמה נוטה לצמיחה פטרייתית; לפיכך, הדגימה והטיפול בדגימות חייבים להתבצע בזהירות כדי למנוע זיהום.

עודף צבעים פלואורסצנטיים במאגר עלול לגרום לפלואורסצנטיות הרקע ולהפריע לתצפיות מיקרוסקופיות. לדוגמה, בעבר נעשה שימוש בתמיסה לבנה מסוג calcofluor המכילה צבע כחול של אוונס. לאחר צביעה במשך שעה אחת ושטיפה במשך שעה אחת, החלבונים הפלואורסצנטיים של OsMADS15-mOrange נצפו באמצעות לייזר של 555 ננומטר. עם זאת, לא ניתן היה לצפות בחלבונים פלואורסצנטיים בגלל פלואורסצנטיות הרקע הנגזרת מהצבע הכחול של אוונס. פלואורסצנטיות הרקע הזו כמעט בוטלה על ידי שטיפת הדגימות במשך שעתיים. יתר על כן, החלבונים הפלואורסצנטיים היו ברורים יותר אם הדגימות הושארו למשך הלילה. לכן, תמיסה לבנה טהורה calcofluor שימש במחקר זה. יש לבדוק פלואורסצנטיות רקע הנגזרת מהצבע הפלואורסצנטי באמצעות אורכי גל לייזר שונים לפני התצפיות.

מגבלות השיטה
כפי שניתן לראות באיור 3, חלבונים פלואורסצנטיים עמוקים נצפו בדגימות בעובי של 130 מיקרומטר לאחר שבועיים של טיפול ב-CS. זה עולה בקנה אחד עם התוצאות המוצגות באיור 2D, שבו הדגימה בעובי 130 מיקרומטר הפכה לשקופה לאחר שבועיים של טיפול במדעי המחשב. עם זאת, כפי שניתן לראות באיור 3A, פלואורסצנציה אוטומטית של הציטופלסמה עדיין הורגשה בצמתים לאחר שבועיים והוסרה לחלוטין רק לאחר 4 שבועות של טיפול ב-CS. צמתים יש צפיפות תאים גבוהה, ולכן, דורשים זמן רב יותר כדי להסיר חומרים פלואורסצנטיים אוטומטיים.

כפי שניתן לראות באיור 3C, חלבונים פלואורסצנטיים עמוקים נצפו בעלים ללא טיפול CS, אך הבהירות הייתה חלשה יותר מזו שבצמתים ובאינטרנודות באותו עומק של 20 מיקרומטר. לאחר שבוע של טיפול במדעי המחשב, החלבונים הפלואורסצנטיים היו בהירים יותר. כלורופיל מצוי בשפע בעלים וסופג 488 ננומטר של אור עירור. יש להם גם פלואורסצנציה אוטומטית כתומה/אדומה, שיכולה להפריע לתצפית של חלבונים פלואורסצנטיים באמצעות לייזר של 555 ננומטר. לאחר שבוע של טיפול במדעי המחשב, הוסרו כלורופיל וחומרים פלואורסצנטיים אוטומטיים אחרים, וכתוצאה מכך נוצרו תמונות ביחס אות לרעש גבוה.

העומקים שניתן היה לראות ברקמות לאחר שבועיים ו-4 שבועות של טיפול ב-CS לא היו שונים באופן משמעותי, אם כי החלבונים הפלואורסצנטיים נראו חלשים יותר לאחר 4 שבועות (איור 3). בדרך כלל, הבהירות של חלבונים פלואורסצנטיים ופלואורסצנטיות אוטומטית נחלשת עם הזמן, וכתוצאה מכך יחס אות לרעש גבוה יותר. לכן, ניתן לצפות בחלבונים פלואורסצנטיים בצורה ברורה יותר על ידי התאמת התנאים המיקרוסקופיים ועיבוד התמונה. בהתבסס על תוצאות אלה, הגיע למסקנה כי שבועיים של טיפול ב- CS יכולים להקל על תצפית של חלבונים פלואורסצנטיים עמוקים, בהתחשב בתנאי הדגימה שלנו. עם זאת, נדרשים 4 שבועות כדי לצפות בתמונות ברורות יותר שאינן כוללות לחלוטין את החומרים הפלואורסצנטיים האוטומטיים.

מבנים עם אוטופלואורסצנציה חזקה, כגון צרורות כלי דם ותאים מרובי זרועות, אינם ניתנים לניקוי ב- CS. כדי לצפות במבנים אלה ללא אוטופלואורסצנציה, יש צורך להשתמש בשיטת זמן¹² או לקבל תמונות על ידי ספקטרוסקופיה של ספקטרום הפלואורסצנציה. מיקרוסקופ דו-פוטוני עשוי להתאים יותר להתבוננות ברקמות עמוקות יותר אם נצפות רקמות עבות יותר.

משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות ואלטרנטיביות
באופן כללי, המבנים הפנימיים של צמחי אורז נצפו באמצעות חתך קריוסטאט או ויברטום. Cryostat מתאים להכנת קטעים דקים, המאפשרים תצפית קלה יותר, אבל הכנת הדגימות ואת הפעולה של הציוד הם זמן רב. שחזור המבנה התלת-ממדי המקורי מקטעים דקים הוא גם קשה. הוויברטום קל יחסית לתפעול ומתאים לייצור חתכים עבים. עם זאת, מקטעים עבים של רקמות מטרה מאפשרים רק תצפיות על פני השטח החתוכים ולא על רקמות עמוקות שהאור אינו יכול להגיע אליהן. מסיבות אלה, אף אחת מהשיטות אינה מתאימה לתצפיות פלואורסצנטיות עמוקות.

מחקר זה התמודד עם אתגרים בתצפית פלואורסצנטית עמוקה ביורה אורז, כגון החדירה המוגבלת לרקמות של CS ורזולוציית האובייקט הירודה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, על ידי שילוב שיטות קיימות. כפי שניתן לראות באיור 4, צפינו בחלבונים פלואורסצנטיים (OsMADS15-mOrange) המתבטאים ברקמות העמוקות של יורה אורז בוגר מהבהלה הצעירה לבסיס. איור 4D מתמקד בפלורט ומראה חלבונים פלואורסצנטיים עמוקים במרווחים של 3 מיקרומטר. רקמות מעל עומק של 130 מיקרומטר נצפו לאחר שבועיים של טיפול ב- CS, אך רק הרקמות בעומק של −27 מיקרומטר נצפו (נתונים לא מוצגים) בפלורט באותו גודל ובאותו שלב צמיחה ללא טיפול ב- CS. הפרוטוקול המשופר הנוכחי איפשר תצפית לא רק על ביטוי יתר של גנים אלא גם על ביטוי גנים טבעי ברקמות העמוקות של יורה אורז בוגר.

חשיבותה ויישומיה הפוטנציאליים של השיטה בתחומי מחקר ספציפיים
פרוטוקול זה, המייעל את התצפית הפלואורסצנטית העמוקה של יורה אורז בוגר, מאפשר ניקוי יעיל של רקמות קשות, עבות או שכבות על ידי חיתוך רקמות מיותרות והגברת החדירות של CS. בנוסף, עובי הדגימות לניתוח הותאם כדי לאפשר תצפית פלואורסצנטית עמוקה רציפה ומבנית באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי, שבדרך כלל אינו יכול לפתור רקמות עבות או אטומות.

קשה להשוות דגימות אורז בשלבי גדילה שונים מכיוון שהחלבונים הפלואורסצנטיים מתפרקים עם הזמן בתמיסות הקיבוע וה-PBS. עם זאת, חלבונים פלואורסצנטיים ב- CS ניתן לאחסן במשך יותר מ 5 חודשים¹. חיי המדף הארוכים של מדעי המחשב הם יתרון משמעותי לתצפית פלואורסצנטית עמוקה באורז.

לאחרונה פותחו טכנולוגיות ניקוי רבות, המאפשרות לצפות ברקמות עמוקות בתלת מימד תוך שמירה על המבנים הפנימיים שלהן. טכנולוגיות אלה המשיכו להתפתח, ופותחו פתרונות סליקה חדשים. דוגמה טובה לכך היא iTOMEI¹⁴, המאפשרת סילוק יעיל של כלורופיל וזיהוי פלואורסצנטי בהיר יותר. דוגמה נוספת היא ClearSeeAlpha¹⁵, אשר מונע השחמה של רקמות במהלך ניקוי הטיפול וגורם להם להיראות שקופים. שילוב פתרונות סליקה אלו עם השיטה הנוכחית עשוי לאפשר סליקה יעילה ואפקטיבית יותר.

צפוי כי השיטה הנוכחית תסייע להשיג תובנות חדשות באמצעות הדמיה עמוקה של לא רק אורז אלא גם צמחים אחרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	BIO-BIK	ST-0150F
12-multiwell plate	Corning	353043
50 mL conical tube	Corning	352070
Calcofluor white solution	Sigma-Aldrich	910090
ClearSee	FUJIFILM Wako Pure Chemical	031-25151	This can be made or purchased.
Confocal laser microscope	Carl Zeiss	LSM700
Desiccator	SANPLATEC		Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H)
Glass coverslip (18 × 18 No.1)	MATSUNAMI	C018181
HEPES	FUJIFILM Wako Pure Chemical	342-01375
Microscope slide (76 × 26)	MATSUNAMI	S2441
Paraffin film	Bemis	PM-996
Paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical	162-16065
Sodium deoxycholate	Tokyo Chemical Industry	C0316
Sucrose	FUJIFILM Wako Pure Chemical	190-00013
UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN)	provided by Dr. Kurihara
Urea	FUJIFILM Wako Pure Chemical	211-01213
Vacuum pump	AS One	AS-01
Vibrating micro-slicer	DOSAKA	DTK-3000
Xylitol	FUJIFILM Wako Pure Chemical	248-00545