מודל ניסיוני של אוטם שריר הלב לחקר תיקון לב ושיפוץ בעכברי נוקאאוט

Summary

כאן, אנו מתארים מודל ניסיוני של אוטם שריר הלב, הליך אקו לב לחקר שיפוץ ותפקוד הלב, ונהלים לכימות פיברוזיס והיפרטרופיה בקטעים מוכתמים באדום פיקרוזיריוס ומוכתמים ברודמין, כמו גם את גודל האוטם ואינדקס ההתפשטות בפרוסות המוכתמות בטריכרום של מאסון.

Abstract

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות השכיחה ביותר במדינות המערב, כאשר אוטם שריר הלב החריף (MI) הוא הצורה הנפוצה ביותר. מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר תפקידו של גלקטין 3 (Gal-3) באבולוציה הזמנית של ריפוי לב ועיצוב מחדש במודל של חיות ניסוי של MI.

ההליכים המתוארים כוללים מודל ניסיוני של MI עם קשירה כלילית קבועה בעכברי C57BL/6J (בקרה) ו-Gal-3 נוקאאוט (KO), הליך אקו לב לחקר שיפוץ לב ותפקוד סיסטולי in vivo, הערכה היסטולוגית של פיברוזיס שריר הלב הבין-רקמתי עם קטעים מוכתמים בלקטין מוכתמים באדום ומצומד רודמין לחקר היפרטרופיה של מיוציטים על ידי אזור החתך (MCSA), וכימות גודל האוטם ושיפוץ הלב (דילול צלקת, עובי מחיצה ואינדקס התפשטות) על ידי פלנימטריה בפרוסות מוכתמות בטריכרום של מאסון וטריפניל טטרזוליום כלוריד. גל-3 עכברי KO עם MI הראו שיבוש בשיפוץ הלב ועלייה ביחס דילול הצלקות ומדד ההתרחבות. בתחילת MI, תפקוד שריר הלב ושיפוץ הלב הושפעו קשות גם הם. 4 שבועות לאחר MI, האבולוציה הטבעית של פיברוזיס בעכברי Gal-3 KO עם אוטם הושפעה גם היא.

לסיכום, המודל הניסיוני של MI הוא מודל מתאים לחקר האבולוציה הזמנית של תיקון לב ועיצוב מחדש בעכברים עם מחיקה גנטית של Gal-3 ומודלים אחרים של בעלי חיים. המחסור ב-Gal-3 משפיע על הדינמיקה של תיקון הלב ומשבש את האבולוציה של שיפוץ ותפקוד הלב לאחר MI.

Introduction

אוטם שריר הלב (MI) הוא הצורה הנפוצה ביותר של מחלות לב וכלי דם. לאחר MI, שריר הלב עובר שינויים מורפולוגיים ותפקודיים סדרתיים, כולל ריפוי אזור אוטם MI, שיפוץ חדרים (VR) ותפקוד לקוי של שריר הלב¹. ריפוי MI הוא תהליך דינמי ומתוזמר היטב הקשור להסננה דלקתית עמוקה שמסתיימת בהיווצרות צלקת פיברוטית ^2,3. המודל הניסיוני של MI בעכברים משמש כיום לחקר שיפוץ לב בתנאים פתולוגיים ^4,5, ומודעות לפרוטוקול הכירורגי המדויק חיונית לפיתוח הליך ניתן לשחזור ויעיל להשראת קשירה כלילית קבועה. שיטה זו נחוצה כדי לחקור את הריפוי של MI ואת הרלוונטיות שלו באבולוציה הזמנית של שיפוץ החדר השמאלי (LVR) ותפקוד הלב הלקוי הקשור ל-MI.

גלקטינים הם קבוצה של לקטינים המזהים פחמימות ספציפיות בליגנדים תוך-תאיים, קולטני ממברנה וגליקופרוטאינים חוץ-תאיים. גלקטין 3 (Gal-3) הוא בן למשפחה זו הפועל באמצעות זיהוי וקישור צולב של N- ו-O-גליקנים בגליקו-מצומדים על פני התא, והוא מתבטא באופן נרחב במערכת החיסון⁶. מחקרים קודמים חקרו את תפקידו של Gal-3 כמווסת דלקת ופיברוזיס במחלות לב וכלי דם 7,8,9,10,11,12. מכיוון שהתמקדות בגורמים הרגולטוריים של דלקת במהלך הריפוי רלוונטית מאוד מכיוון שדלקת יכולה להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העיצוב מחדש, מטרתנו הייתה לתאר פרוטוקול לחקר האבולוציה הזמנית של שיפוץ חדרים לאחר MI ואת השלבים והשיטות לקביעת האופן שבו המוטציה הגנטית של Gal-3 משנה את האבולוציה הזמנית של הריפוי ב-MI ומשפיעה על עיצוב מחדש ותפקוד הלב בעכברים.

Protocol

הערה: כל הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול ומחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת בואנוס איירס (CICUAL), בהתאם לוועדת המועצה הלאומית למחקר (ארה"ב) לעדכון המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה¹³. לצורך הניסויים, השתמשו בעכברי C57BL/6J ו-Gal-3 KO זכרים (בני 8-10 שבועות) במשקל 30-35 גרם, המאפשרים מניפולציה טובה יותר לניתוח. לאפשר לבעלי החיים גישה למים ולמזון אד ליביטום. עכברי ה-Gal-3 KO גודלו על רקע C57BL/6J באותם מתקני משאבים ביולוגיים כמו עכברי הביקורת C57BL/6J.

1. אזור ומכשירים כירורגיים

1. לפני תחילת הניתוח, ודא שמכונת ההנשמה מחוברת למקור חשמל ופועלת כהלכה. ודא שיש מספיק תמיסת הרדמה. הכן את התמיסה ביום הניתוח על ידי חישוב מספר בעלי החיים לשימוש.
2. ודא שכל המכשירים הכירורגיים מעוקרים, כולל מספריים אל חלד, מספריים מיקרו, מחזיקי מחטים למחטים גדולות וקטנות, מחזירים, מלקחיים חדים ומעוקלים במיוחד, מלקחיים משוננים ומלקחיים לרקמות. נקה את אזור העבודה עם 70% אתנול.
3. הקפידו על זמינותם של כדורי צמר גפן קטנים, זעתר וגזה לצריבה מיידית של כל דימום פוטנציאלי.
4. שמור מוכנים מוכנים 10-0 עד 7-0 תפרי משי קלועים מצופים סיליקון לקשירה של העורק הכלילי היורד השמאלי (LDA), תפר ניילון לסגירת בית החזה וחוט פשתן לסגירת העור.

2. הרדמה ואינטובציה

1. שקלו את העכברים כדי לקבוע את מינון ההרדמה.
2. יש לחמם מראש כרית חימום המוקפת בבסיס קלקר ל-40 מעלות צלזיוס.
3. להרדים את העכברים עם מתן תוך שרירי של 0.1 מ"ל/10 גרם משקל גוף של תמיסה המכילה קטמין (65 מ"ג/ק"ג), קסילזין (13 מ"ג/ק"ג) ואצפרומזין (1.5 מ"ג/ק"ג).
4. לאחר הרדמת העכבר ולפני תחילת ההליך הכירורגי, בדוק את עומק ההרדמה על ידי גרימת גירוי מעט כואב, כגון על ידי לחיצה על כפות הרגליים עם האצבעות. אם החיה מגיבה לגירוי, התאם את עומק ההרדמה.
5. הנח את העכבר בדקוביטוס הגב, והדביק את רגליו לבסיס העבודה מעל כרית החימום, והניח אותו מתחת למיקרוסקופ סטריאו דו-עיני. האריכו יתר על המידה את הצוואר בעזרת חוט המחזיק את השיניים המקסילריות המחוברות לבסיס העבודה.
6. לאחר מכן, עבור חלק האינטובציה, חשפו את טבעות קנה הנשימה דרך חתך מינימלי בצוואר, ותעלו דרכו עם קטטר תוך-ורידי 20 גרם המחובר למכונת הנשמה של מכרסמים (נפח גאות ושפל: 250 מ"ל/שבץ) בתדירות נשימה של 34-38 מחזורים לדקה, כפי שתואר קודם לכן¹⁴.
7. הנח את החיה בדקוביטוס לרוחב כדי לבצע את כריתת בית החזה השמאלית בחלל הבין-צלעי הרביעי או החמישי. לבצע חתך בעור החיה; התבונן בשרירים שמתחת, ופזר אותם בזהירות כדי להפריד אותם מדופן בית החזה כדי לראות בבירור את החלל הבין-צלעי. בשלב זה, ודא שהחיה מחוברת כהלכה למכונת ההנשמה; לאחר מכן, פתח את החלל הבין-צלעי על ידי יצירת חור עם המלקחיים החדים במיוחד.
   הערה: ה-LDA צריך להיות ניתן לזיהוי לאורך דופן החדר השמאלי החופשי (LV) בחללים הבין-צלעיים שהוזכרו לעיל.
8. בצע את כריתת קרום הלב, וזהה את ה-LDA על ידי ניגוד העורקים הכליליים עם הוורידים הכליליים והסתעפות ה-LDA מתחת לאפרכסת השמאלית. לאחר מכן, בצע את הקשירה של ה-LDA באמצעות ה-8-0 חוט משי ~ 2 מ"מ מקצה האפרכסת. לבסוף, סגרו את בית החזה בשכבות באמצעות חוט משי 6-0 - סגרו את הצלעות, וודאו שאין פנאומוטורקס בפנים (עשו זאת בזהירות על ידי אילוץ הריאות להתרחב עם מכונת ההנשמה), והתקרבו לשרירים או תפרו אותם לפני סגירת העור.
9. לאחר סגירת העור, נתק לאט את העכבר ממכונת ההנשמה בדקוביטוס הגחוני, והסר את הצינור האנדוטרכיאלי כאשר תדר הנשימה התאושש. תנו לבעל החיים להתאושש מההרדמה בסביבה שקטה ורצוי עם טמפרטורת חדר יציבה ב-27 מעלות צלזיוס.
10. המתן עד שבעלי החיים יתאוששו מההרדמה, יתחילו להזיז את הגפיים שלהם ושתדר הנשימה הרגיל שלהם ישוחזר. לאחר מכן, הכניסו אותם לכלובים בודדים עד סוף הפרוטוקול.
11. בצע את אותו הליך על בעלי חיים המופעלים על ידי בקרה או דמה אך ללא קשירה של ה-LDA.

3. תכנון המחקר

1. לבדיקת האבולוציה הזמנית של ריפוי ושיפוץ חדרים לאחר MI, חלק את העכברים באופן אקראי לקבוצות הבאות:
   1. כדי לחקור את השלב המוקדם של שיפוץ חדרים לאחר שבוע אחד של אבולוציה של MI, הקצה את העכברים לקבוצות הבאות: 1) C57 Sham (שבוע אחד); 2) Gal-3 KO Sham (שבוע אחד); 3) C57 MI (שבוע אחד); 4) Gal-3 KO MI (שבוע אחד).
   2. כדי לחקור את השלב המאוחר של שיפוץ חדרים לאחר 4 שבועות של MI, הקצה את העכברים לקבוצות הבאות: 5) C57 Sham (4 שבועות); 6) Gal-3 KO Sham (4 שבועות); 7) C57 MI (4 שבועות); 8) Gal-3 KO MI (4 שבועות).

4. אקו לב

הערה: עבור אקו לב של עכבר, יש להשתמש במתמרים ליניאריים מעל 10 מגה-הרץ להדמיה נכונה של קוטר הקיר וגדלי החללים. הליך זה יכול להתבצע בהרדמה עם אברטין תוך-צפקי (IP) ב-1.15 מ"ל/ק"ג או בבעלי חיים בהכרה. עם זאת, האחרון יכול להוביל לתוצאות מבלבלות בעכברים עם MI עקב הלחץ והחרדה הנגרמים ממניפולציה.

1. כדי להרדים עכבר, הרימו אותו, החזיקו אותו עם הגב לכף היד והפכו אותו כדי להגיע לפני השטח של הבטן. במצב זה, הזריק את הרדמת ה-IP בזווית של 45 מעלות בין החיה למחט התת עורית.
2. לאחר שהעכבר מורדם, גלחו את החזה שלו והניחו את העכבר מעל כרית חימום שחוממה מראש במצב דקוביטוס גבי. כדי לקבל תצוגות ציר ארוך וציר קצר פרסטרנליות, הזז את המתמר ב-90°. לאחר קבלת הציר הנכון view, מקם את הסמן ברמת השריר הפפילרי, לחץ על מקש מצב M-2D כדי ללכוד את התמונות והשתמש בתוכנת ניתוח תמונות כדי למדוד את הפרמטרים הבאים:
   1. מדוד את מידות ה-LV, כולל עובי הדופן (LVWT), אזורי ה-LV הן בסיסטולה (S) והן בדיאסטולה (D), והאזור הדיאסטולי של החדר השמאלי (LVDA) והאזור הסיסטולי של החדר השמאלי (LVSA) בשלוש פעימות לפחות.
   2. בנוסף, חשב את תפקוד החדר לפי מקטע הפליטה (EF, %), השבר המתקצר (SF, %), ומסת הלב (נניח קובייה לא מתוקנת) באמצעות משוואה (1), משוואה (2) ומשוואה (3), כפי שתוארה קודם לכן¹⁵.
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      מסת LV = 1.055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³) (3)
      כאשר LVEDD הוא הקוטר הדיאסטולי של החדר השמאלי, LVESD הוא הקוטר הסיסטולי של החדר השמאלי, IVST הוא העובי התוך-חדרי ו-PWT הוא עובי הדופן האחורית.

5. הערכה היסטולוגית

1. במהלך הנתיחה יש לחלץ את הלב מהחיה על ידי פתיחת בית החזה מצד לצד וחיתוך כל המבנים המקיפים אותו. נקו את קריש הדם שנמצא בתוך החללים על ידי הפעלת לחץ עדין באמצעות נייר טישו.
2. קצרו ושקללו את הלב במשקל דיוק מעבדתי. טבלו אותו בפורמלדהיד של 10% למשך 72 שעות לפחות בטמפרטורת החדר. חותכים את הלב ידנית מהקודקוד לבסיס בפרוסות רוחביות בעובי 1 מ"מ בעזרת להב, ומעבדים את הפרוסות על ידי הטמעתן בפרפין. בצע חתכים סדרתיים בחלקים המשובצים בפרפין בעובי 5 מיקרומטר עם מיקרוטום.
3. הניחו כל חלק בין השקופיות, וצבעו אותם בהמטוקסילין ואאוזין (H&E), הטריכרום של מאסון, קטעים מוכתמים בלקטין מצומד רודמין, או אדום פיקרוסיריוס^15,16.
   1. על ידי שימוש בפוטומיקרוסקופ מתאים, צלם תמונות דיגיטליות ב-400x עבור מורפומטריה, פיברוזיס וכימות MCSA. ודא שהמיקרוסקופ מחובר למצלמה דיגיטלית ומחובר למחשב באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. עבור כל ניתוח מורפומטרי, ודא שהתמונות נמצאות באותם אזורים, עם מינימום של 10 שדות בעוצמה גבוהה ב-400x לכל קטע (מחיצה, אזור אוטם ואזור מרוחק) ומבלי לחפוף את השדות.
      1. כדי למדוד את ה-MCSA, היו מודעים למיקומים של מיוציטים לבביים, וספרו רק את המיוציטים החתוכים לרוחב ומוקפים בלפחות שלושה נימים סמוכים.
      2. בפרוסות המוכתמות באדום של Picrosirius, זהה את אזורי הצלקת והמחיצה, ודמיין את הקולגן הבין-רקמתי בשני האזורים. העלה את התמונות לתוכנת הניתוח, ופתח את לשונית הסף כדי להדגיש את כל אזורי הקולגן החיוביים והשליליים כדי להשיג את הנתונים, לחץ על לשונית המדידה ושמור את התוצאות. לחישוב אחוז הקולגן לאזור, השתמשו במשוואה (4), והוסיפו את האזורים החיוביים לקולגן וחלקו אותם בכלל הרקמה, כולל האזורים החיוביים לקולגן, כפי שמתואר במקום אחר^15,16.
         קולגן (%) = האזור האדום של פיקרוזיריוס/שטח הרקמה הכולל (4)
      3. כמת את ה-MCSA מהתמונות הדיגיטליות שהתקבלו מהחלקים המוכתמים בלקטין מצומדים ברודמין של הדגימות המשובצות בפרפין. כדי להשיג את התמונה הנכונה, השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לעקוב אחר קווי המתאר האדומים של המיוציטים המקיפים את קרומי התא. בחר את כרטיסיית האזור , עקוב אחר קווי המתאר ולחץ על פונקציית כרטיסיית המדידה . לבסוף, שמור את התוצאות מאזורי התא¹⁶.

6. קביעה כמותית של גודל האוטם והפלנימטריה להערכת שיפוץ לב

1. מדוד את גודל אוטם שריר הלב, את עובי הדופן ואת אורך ההיקף האנדוקרדיאלי והאפיקרדיאלי באמצעות פלנימטריה מהתמונות ההיסטולוגיות של החלקים המוכתמים בטריכרום של מאסון שהתקבלו במיקרוסקופ אור (4x) והתוכנה המתאימה.
   1. לכימות גודל האוטם, זהה את אזור האוטם (כחול) ואת האזור המרוחק (אדום). עקוב ומדוד את האורך הכולל של אזור האוטם והאזור המרוחק בצד האנדוקרדיאלי והאפיקרדיאלי. חשב את הממוצע של המעקב האנדוקרדיאלי והאפיקרדיאלי כאחוז מהיקף ה-LV הכולל¹⁷.
   2. באופן דומה, מדדו את עובי הצלקת (ממוצע של חמש מדידות שוות מרחק) ואת עובי המחיצה (ממוצע של שלוש מדידות שוות מרחק) בחלק האמצעי של הלב, והשתמשו במדידות אלה כדי לקבוע את יחס עובי הצלקת (משוואה [5]) ואת מדד ההתפשטות (משוואה [6]¹⁸).
      הערה: ניתן לרשום את כל הערכים בגיליון אלקטרוני.
      יחס עובי צלקת = עובי צלקת/עובי מחיצה (5)
      אינדקס התפשטות = (שטח חלל LV/שטח LV כולל) × (עובי מחיצה/עובי צלקת) (6)
      הערה: מכיוון שהשיפוץ עשוי לשנות את ההתרחבות, וכתוצאה מכך להערכת חסר או הערכת יתר של גודל האוטם, ייתכן שיידרש זמן מה לביצוע ניסוי פיילוט למדידת גודל האוטם ב-24 שעות, ואחריו המתת חסד. במקרה זה, יש להרדים את החיה באותה תמיסת הרדמה IP המשמשת להליך MI.
2. הנח את החיה בדקוביטוס הגב, והחדיר אותה כמתואר קודם לכן. לאחר שהחיה מורדמת, בצע חתך אלכסוני עמוק המגיע לעור, לשרירים ולעצמות החוף מהאפופיזה הקסיפואידית לחלול בית השחי.
3. בודדו את קשת אבי העורקים, צרו חור קטן באבי העורקים העולה והכניסו קטטר כדי להחדיר את הלב עם הכחול של אוון. לאחר מכן, הסר ידנית את הלב המוכתם מהחיה, וחתוך אותו מהקודקוד לבסיס בעזרת להב חד. מניחים את פרוסות הלב ב-1% טריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC) במאגר פוספט איזוטוני (pH 7.4) ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ⁴ כדי לאשר שבעלי החיים דומים מבחינת גודל האוטם.

תוצאות

הישרדות ונקרופסיה לאחר MI
במשך 4 שבועות של מעקב, 17% (4/23) מעכברי C57 לעומת 40% (8/20) מעכברי Gal-3 KO נמצאו מתים. הנתיחה בוצעה; עכברי Gal-3 KO המתים הראו לבבות גדולים יותר מעכברי C57 (איור 1), ו-38% מעכברי C57 בהשוואה ל-32% מעכברי Gal-3 KO היו בעלי קרישי חזה מקר...

Discussion

המודל הניסיוני של MI על ידי קשירה קבועה של העורקים הכליליים משמש לחקר מגוון רחב של מנגנונים פתופיזיולוגיים של תיקון לב ועיצוב מחדש ^5,14,17. מאמר זה מסכם שיטות שונות המשמשות כיום במעבדה זו לחקר האבולוציה הזמנית של תיקון הלב ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-0 silk suture	Ethicon
C57BL/6J mice	Department of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respirator	Hardvard company
Heating pad			maintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		Image Analysis Software
Ketamine	Holiday
Masson Trichrome	BIOPUR
Picrosirius red	BIOPUR
Retractors
Rodent Ventilator Model 683	Harvard Apparatus		Mechanical ventilator
Scissors
Stereoscopic magnifying glass	Arcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)	General Electric		Any tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, Burlingame	Vector Laboratories
Xylazine	Pro-Ser